2021核酸檢測基本知識

1、2021核酸檢測基本知識通過整理的2021核酸檢測基本知識相關(guān)文檔，希望對大家有所幫助，謝謝觀看!核酸檢測基本知識1.什么是核酸檢測核酸的定義：核酸是由 核苷酸或脫氧核苷酸通過3,5-磷酸二酯鍵連接而成的一類生物大 分子。核酸具有非常重要的生物功能，主要是貯存遺傳信息和傳遞 遺傳信息。2.核酸的分類核酸大分子可分為兩類：脫氧核糖核酸（DNA） 和核糖核酸（RNA）。/、3.核酸的組成DNA和RNA都是由一個一個核苷酸（nucleotide）頭尾相連而形成的，由C、H、O、N、P，5種元素組成。DNA是絕大多數(shù)生物的遺傳物質(zhì)，RNA是少數(shù)不含DNA的病毒（如 HIV病毒，流感病毒，SARS病毒等

2、）的遺傳物質(zhì)。RNA平均長度大 約為2000個核苷酸，而人的DNA卻是很長的，約有3X10 個 核 苷酸。4.核酸的功能在蛋白質(zhì)的復制和合成中起著儲存和傳遞遺傳 信息的作用。核酸不僅是基本的遺傳物質(zhì)，而且在蛋白質(zhì)的生物合成 上也占重要位置，因而在生長、遺傳、變異等一系列重大生命現(xiàn)象中 起決定性的作用。DNA與RNA都是核酸，它們在化學組成上有什么區(qū)別如下： DNA與RNA的比較 DNA RNA 主要存在部位 細胞核 細胞質(zhì) 基本組成單位脫氧核苷酸核糖核苷酸堿基種類A、G、C、T A、G、C、U五碳糖種類脫氧核糖核糖核苷酸鏈兩條脫氧 核苷酸鏈一條核糖核苷酸鏈5.檢測方法核酸檢測方法，主要通 過同

3、時進行靶核酸擴增和可檢測信號的生成來檢測樣品中的靶核酸。 可應(yīng)用于臨床微生 物學、血液篩選、遺傳病診斷和預(yù)防、法醫(yī)學等 領(lǐng)域的核酸檢測。目前主要使用的方法有以下幾種：a.核酸序列依賴性擴增法 NASBA是由一對引物介導的、連續(xù)均一的、體外特異性核苷酸序列 等溫擴增RNA的新技術(shù)。反應(yīng)在42C。進行可在2h內(nèi)將RNA模板擴 增約109倍。NASBA原理是提取病毒RNA,加入AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA 酶H、T7RNA聚合酶和引物進行擴增。整個反應(yīng)分非循環(huán)相和循環(huán) 相:在非循環(huán)相中，引物I與模板RNA退火后在AMV逆轉(zhuǎn)錄酶的作用 下合成cDNA,形成RNA:DNA雜合體，隨即RNaseH降解RNA，引

4、物II 與cDNA退火，在反轉(zhuǎn)錄酶作用下合成第2條DNA互補鏈。雙鏈DNA 可在T7RNA聚合酶的作用下,經(jīng)其啟動子序列起動而轉(zhuǎn)錄RNA，RNA 又可在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下反轉(zhuǎn)錄成DNA，進入循環(huán)相,對模板進行大 量擴增。轉(zhuǎn)錄介導的擴增技術(shù)TMA技術(shù)原理與NASBA基本一致，略 有不同之處是TMA利用的是MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶及T7RNA聚合酶兩種 酶，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶既有逆轉(zhuǎn)錄酶的活性又具有RNA酶H活性。反 應(yīng)在41.5C。進行可在1h內(nèi)將RNA模板擴增約109倍。連接酶酶促鏈式反應(yīng)(LCR) LCR是基于靶分子依賴的寡核苷 酸探針相互連接的一種 探針擴增技術(shù)，是繼PCR后新發(fā)展的一種 較有前景的體

5、外擴增技術(shù)。它的原理就是由2段寡核苷酸單鏈DNA 探針與目標序列雜交，當該2段DNA探針與沒有發(fā)生突變的模板褪火 后，如果2探針是緊鄰的，中間沒有核苷酸間隔，則可在連接酶作用下連 接起來，連接以后的新鏈又可以作為模板，引導下一周期的連接產(chǎn)生新 的子鏈。若連接區(qū)段發(fā)生核苷酸的堿基突變,則連接反應(yīng)不能發(fā)生，擴 增反應(yīng)終止。d.多聚酶鏈反應(yīng)檢測法(PCR) PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性一退火一延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93C。左右一定時間后， 使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DN

6、A解離，使之成為單 鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準備。模板DNA與引物的退火（復性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單 鏈后，溫度降至55C左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié) 合。引物的延伸：DNA模板引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作 用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復 制原理，合成1條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈，重復循 環(huán)變性一退火一延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且 這種新鏈又可成為下次 循環(huán)的模板。每完成1個循環(huán)需24min,23h就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。檢測HIV RNA,需要 先利用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將RNA轉(zhuǎn)錄為cDN

7、A,繼而以cDNA為模板進行 PCR擴增即可，這樣的反應(yīng)稱為RT-PCR。e.實時熒光定量PCR技術(shù) 實時熒光定量PCR技術(shù),是指在PCR 反應(yīng)體系中加入熒光基團利用熒光信號實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。本技術(shù)的原理是使用熒光基團標記探針5端標記熒光基團R3 端標記淬滅基團Q,在沒有PCR擴增時，由于熒光基團和淬滅基團空間 距離很近，使熒光基團被淬滅，不發(fā)熒光;而當PCR擴增時，引物與熒光 標記的特異性探針同時結(jié)合在模板上，熒光標記的探針與模板的結(jié)合 位置位于上下游引物之間，利用Taq酶的53外切酶活性，將熒光探針 水解,熒光基團被釋放出來，由于在空間上

8、與淬滅基團分開，則發(fā)出熒 光。發(fā)出的熒光可以被熒光探頭檢測到,一邊擴增，一邊檢測，這樣就實 現(xiàn)了“實時”檢測。該技術(shù)不僅實現(xiàn)了 PCR從半定量到定量的飛躍，而 且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性強、自動化程度高、有效解決了 PCR 污染問題等特點。f.支鏈DNA檢測法bDNA bDNA是定量檢測血漿中的 HIV 1型RNA的一種方法。bDNA是指人工合成的帶有側(cè)鏈的DNA 片段，在其每個側(cè)鏈上 都可以標記被激發(fā)的標記物。將HIV的RNA 通過離心從病毒顆粒中釋放出來，然后用捕獲探針1將其捕獲到微孔 中。捕獲探針2與病毒RNA的另一部分特異結(jié)合，又與預(yù)放大探針結(jié) 合。后者再與放大探針即bDNA探針

9、雜交。兩套靶探針分別與病毒 RNA的pol基因的不同區(qū)域特異結(jié)合。在微孔中形成HIVRNA寡核苷 酸復合物。再加入1種化學發(fā)光底物孵育后可放大化學發(fā)光信號。通 過發(fā)光強度來定量，因為發(fā)光強度與樣品中HIVRNA含量成比例。 bDNA不存在擴增物的交叉污染，這較PCR是一大進步。bDNA有數(shù) 十個覆蓋整個基因組的探針，可以方便地檢測HIV某些變異株,但靈敏 度不及PCR，提高bDNA靈敏度是一大難點。檢測步驟HIV核酸定性檢測技術(shù)，其檢測過程分為核酸提取、 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA、PCR擴增反應(yīng)、擴增產(chǎn)物定性分和結(jié)果判定和完 成報告單。6.實驗室檢測具體步驟如下：a.核酸提取 使用硅膠柱離心、 磁性

10、硅膠顆粒分離方法以及自動化儀器等商品化試劑或設(shè)備并按說 明書操作。提取RNA時應(yīng)注意防止RNA降解。DNA應(yīng)置于-20C。保 存RNA和需長期保存的DNA應(yīng)置于-80C保存。b.逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成反應(yīng)需使用逆轉(zhuǎn)錄引 物、dNTPs、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、DTT、緩沖液和適量無RNA/DNA 酶的超純水以及RNA模板。在擴增儀或水浴箱中，在規(guī)定的溫度和 時間下進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。建議使用商品化RT-PCR 一步法試劑進行第 一輪擴增反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成反應(yīng)需使用逆轉(zhuǎn)錄引物、dNTPs、 逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、DTT、緩沖液和適量無RNA/DNA酶的超 純水以及RNA模板

11、。在擴增儀或水浴箱中，在規(guī)定的溫度和時間下進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。使用商品化RT-PCR-步法試劑進行第一輪擴增反 應(yīng)。c.PCR擴增反應(yīng)（使用二次擴增的套式PCR擴增方法）PCR 反應(yīng)需使用引物、dNTPs、DNA聚合酶（如Taq酶等）、緩沖液、和 適量無RNA/DNA酶超純水、以及模板（DNA或cDNA）。在擴增儀 中，按照設(shè)定的程序進行擴增。使用二次擴增的套式PCR擴增方法。擴增產(chǎn)物定性分析擴增產(chǎn)物常用分析方法是瓊脂糖凝膠電 泳法，與分子量標準比較，判斷擴增片段是否在預(yù)期的分子量范圍內(nèi)。 其它擴增產(chǎn)物分析方法還有限制性內(nèi)切酶酶切分析、特異性探針雜交 分析以及DNA序列分析等。自動化核酸擴增儀使用酶聯(lián)比色分析或 熒光探針雜交等原理測定。結(jié)果判定和完成報告單 （1）實驗成立的條件：每一次檢測 需同時做兩個陽性 對照、兩個陰性對照，只有陽性對照擴增出預(yù)期 的片段、陰性對照