臍血分血及CIK細胞培養(yǎng)流程

1、臍血分血及CIK細胞培養(yǎng)流程采集新鮮的自體外周血入血液采集袋（含28mL枸櫞酸納抗凝劑），將血液采集登記表標記細胞編號，用鉛筆在采集袋表面空白處也標記細胞編號。檢查全血有無凝血，凝血會導致單核細胞得率降低，細胞采集到接收時間段是否在六小時之內(nèi)，超過六小時細胞得率降低。熱合機在血液采集袋輸入管1/3處熱和一個封口，用酒精噴血液采集袋表面，將血液采集袋放入傳遞窗。準備好50mL離心管、3mL抗凝管、生理鹽水、10mL移液管、T-75瓶、T-25瓶、淋巴細胞分離液、廢液缸。采集袋拿進超凈臺之前再噴酒精。擰扭輸出管，使血液回流入采血袋，用止血鉗夾住采血袋輸出管，用酒精棉球擦拭輸出管管表面，剪刀剪去封口

2、，剪成斜口（方便倒出），準備好兩個50mL離心管，輸出管口火焰滅菌后，用止血鉗控制管口將全血倒入50mL離心管，最后采血袋留3mL全血倒入抗凝管中，抗凝管血混勻后計數(shù)（中間細胞Mid+淋巴細胞L），用作第三方檢測（乙肝HBsAg、丙肝HCV-IgG、梅毒TRUST、艾滋Anti-HIV、谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT、血型Rh(D)、梅毒螺旋體特異性抗體TPPA），此時記下全血體積，將采血袋標記細胞編號保存于-20保留血樣，以防日后需要檢測。，并記下采血袋批號用于填寫細胞檔案。準備好數(shù)個50mL離心管，分別加入20mL淋巴細胞分離液，將全血緩慢加入勿破壞淋巴細胞分離液液面層。淋巴細胞表面。一定配平后離心，2

3、000rpm，離心20min。取出離心管，棄掉最上層的血漿層。準備兩個干凈的50mL離心管，旋轉(zhuǎn)吸取單核細胞層（白膜層）加入離心管，全部吸完后，記下單核細胞體積。11、準備幾個新的50mL離心管，每管分裝10mL單核細胞，生理鹽水分別加至50mL（與生理鹽水1:4），混勻后1800rpm，10min離心，洗滌細胞第一次。12、取出離心管，倒掉上清，取10-15mL生理鹽水依次重懸單核細胞，再取10-15mL生理鹽水洗滌單核細胞離心管，減少細胞損失，將單核細胞重懸入一個或兩個離心管，生理鹽水加至40或80mL（細胞濃度太大時加至80mL），細胞計數(shù)儀計數(shù)（中間細胞Mid+淋巴細胞L）。按照接種密

4、度為2.5-3109個/L計算接種幾個T-75瓶。注:中間細胞包括嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞、單核細胞。 密 度 40 或 80 =2.5-3109個/L 40或60或80或100或120或140或160分母為40則接種4個T-75瓶，160則接種16個T-75瓶，每瓶10mL。13、1800rpm，10min離心，洗滌細胞第二次。14、用40或60或80或100或120或140或160mL培養(yǎng)基 = 1 * ROMAN I重懸單核細胞，每瓶10mL接種于T-75瓶中，第0天。15、CIK細胞第一天，T-75瓶，加10mL培養(yǎng)基 = 2 * ROMAN II。第二天，T-75瓶，加30mL培養(yǎng)

5、基 = 3 * ROMAN III。第三天，觀察CIK細胞。第四天， 兩個T-75瓶CIK細胞裝一個細胞培養(yǎng)袋，補加300mL培養(yǎng)基 = 3 * ROMAN III，裝袋前顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)，有無污染，培養(yǎng)基染色是否一致，檢查第三方檢測結(jié)果是否正常，正常方可裝袋。16、裝袋后每隔三天進行細胞計數(shù)，補液，補培養(yǎng)基 = 3 * ROMAN III（補液后細胞密度維持在1.5-2109個/L），留樣，至細胞第14天成熟。無血清培養(yǎng)基 = 1 * ROMAN I配制：空白培養(yǎng)基1L + 10mL IFN-（終濃度1%）+ 10mL成分 = 1 * ROMAN I（終濃度1%）無血清培養(yǎng)基 = 2 *

6、 ROMAN II配制：空白培養(yǎng)基1L + 20mL IL-1（終濃度2%） + 1支IL-2（終濃度2%）無血清培養(yǎng)基 = 3 * ROMAN III配制：空白培養(yǎng)基1L +1支IL-2（終濃度2%）IL-1原液配制：空白培養(yǎng)基40mL + 1支IL-1IFN-原液配制（瓶上有標記）：因子 = 4 * ROMAN IV配制：1支用10mL培養(yǎng)基溶解，1.5mL分裝。因子 = 4 * ROMAN V配制：1支用15mL培養(yǎng)基溶解，1.5mL分裝。因子 = 6 * ROMAN VI配制：1支用10mL培養(yǎng)基溶解，1.5mL分裝。抗原肽：每支溶于0.5mL培養(yǎng)基，相同病種抗原肽混合后，凍存至-20

7、，使用時1%終濃度。注意事項：1、血液第三方檢驗合格結(jié)果經(jīng)主管審核無誤后，上報OA合格血液單，否則上報OA不合格血液單。2、細胞治療原則：先采血后回輸?；剌斍盎颊咛崆拜斂惯^敏藥。提前兩天通知患者回輸（有一些患者是外地的）。3、每次配液后及時填寫配液記錄。4、接種前細胞一定要混勻；回輸時細胞一定要打勻，防止結(jié)塊。5、一定記得回輸時人血清白蛋白的加入，使細胞包裹上血清白蛋白，不容易結(jié)塊，細胞結(jié)塊容易引起血栓。6、兩份血同時做時一定要在50mL管體上標細胞編號或者患者姓名，不同血在不同的超凈臺操作。7、傳染病患者分血操作放在最后，一定換手套噴酒精，該患者的培養(yǎng)基一定要分裝。8、超凈臺內(nèi)操作，嚴禁雙肘

8、放在操作臺面上。9、注射器和培養(yǎng)袋接口是污染高發(fā)區(qū)，嚴禁觸碰。10、瓶蓋等放在遠離操作容易碰到的地方。11、細胞培養(yǎng)袋補液前，管口有液體的話記得甩一下管口。12、裝袋時不留樣，以后每次補液都要留樣。13、分血及回輸時，生理鹽水瓶一定要拿對。自體血出細胞前一天記得冰鹽水（50mL）吹打DC細胞。14、瓊脂平皿上的標記寫在瓊脂背面，蓋子上不寫東西。15、補液前，培養(yǎng)基提前拿出來至室溫再用。16、臭氧殺菌的原理：臭氧與細菌細胞壁脂多糖、脂蛋白結(jié)合，氧化細菌，殺死細菌。17、T-25瓶最多可以加10mL液體，T-75瓶最多可以加50mL液體，T-175瓶最多可以加250mL液體。18、細胞補液后密度控

9、制在1.5-2109個/L，因為這個密度下細胞長得快。19、淋巴細胞分離液：全血=20mL：20-25mL，分離單核細胞沒問題。20、掉在地上的沒有拆包裝的耗材，噴酒精后拿進超凈臺使用。21、清場：關風機，酒精擦臺面及物品，關操作臺，開紫外。22、DC細胞加因子后輕輕混勻培養(yǎng)基。23、開蓋后的生理鹽水要用點著的酒精棉球擦拭，以防金屬碎片進入培養(yǎng)基。24、回輸當天顯微鏡檢查最后一次補液T-25瓶有無異常，檢查當天T-25瓶有無異常。25、補液前查看上一次補液的留樣瓶，無污染后再補液。26、細胞回輸前72小時不再補液，因為三天內(nèi)留樣瓶必定可以觀察到是否污染，以保證回輸細胞無污染，質(zhì)量合格。27、分血前，一定要有病人的細胞治療申請單，病人體檢報告（傳染病四項，三個月之內(nèi)的體檢結(jié)果）、患者簽字。查看患者的血常規(guī)有無異常，關于培養(yǎng)天數(shù)和注意事項及時與市場代表溝通。28、使用輸血器回輸（有過濾裝置）。29、病人做過放化療之后一周，白細胞恢復的差不多再進行采血。血常規(guī)正常值范圍：紅細胞RBC：女 4.0-5.0101