藥物分析學：總論 第十章 生物藥物分析概論

1、第十章 生物藥物分析概論藥物分析學 總論1Chapter 10 Biopharmaceutical Analysis基本要求掌握生化藥物的種類、鑒別、檢查和含量測定方法1熟悉生物制品的分類、理化檢定與生物學檢定2了解生化藥物分析和生物制品分析的實例32防病、治病的三大藥源3生物藥物分析的特點相對分子量的測定1生物活性檢查2安全性檢查3效價測定4結構確證54 一、生化藥物種類 例：氨基酸、多肽、蛋白質、酶等。 第一節(jié) 生化藥物5氨基酸及其衍生物類藥物 多肽和蛋白類藥物酶類與輔酶類藥物糖類藥物脂類藥物生化藥物種類核酸及其降解產物和衍生物類藥物 多組分生化藥物6二、鑒別方法 理化鑒別法：化學鑒別法

2、光譜鑒別法 HPLC法生化鑒別法：酶法 電泳法 等電聚焦法生物鑒別法：家兔驚厥試驗肽圖鑒別法：胰蛋白酶裂解-RP-HPLC法 溴化氰裂解法7 1.化學鑒別法 例：谷氨酸(Glutamic Acid)片的鑒別 取本品的細粉適量(約相當于谷氨酸5 mg)加水5ml，加熱使谷氨酸溶解，濾過，取濾液，加茚三酮約5 mg，加熱，溶液顯藍至藍紫色。8 2.光譜鑒別法 例：細胞色素C的鑒別 取含鐵量項下的供試品溶液1ml，置50 ml量瓶中，用磷酸鹽緩沖液(pH=7.3)稀釋至刻度，加連二亞硫酸鈉約15 mg，搖勻，測定，在520、550 nm波長處有最大吸收，在535 nm波長處有最小吸收。 利用藥物的光

3、譜特性如UV或IR特征吸收而進行鑒別910原理：細胞色素C是以含鐵卟啉為輔基的結合蛋白，當其結構中鐵原子為三價(Fe3+)時，它是氧化型的細胞色素C，但接受一個電子變成二價鐵(Fe2+)后，就成了還原型的細胞色素C。 在磷酸鹽緩沖液(pH=7.3)中，其還原型在550、520與415nm波長處有最大吸收，而其氧化型在280、361、410與529nm波長處有最大吸收，故可采用UV進行鑒別。 3. HPLC法 利用對照品溶液和供試品溶液色譜圖的保留時間和肽圖譜的一致性進行鑒別。 例：胰島素的鑒別 采用HPLC法，固定相為十八烷基硅烷鍵合硅膠(5 m)，柱溫40，流動相為0.1 mol/L磷酸二氫

4、鈉溶液(pH=3.0)乙腈(7327)，檢測波長214 nm。取胰島素(豬或牛)對照品及供試品適量，分別加0.01mol/L鹽酸溶液制成濃度為40 U/ml的溶液，各取5 L進樣，供試品主峰的保留時間應與同種屬對照品主峰的保留時間一致。 11 4.酶法12例：尿激酶的鑒別-氣泡上升法 原理：5. 電泳法：以肝素鑒別為例與國家肝素標準品對照，其移動位置相應13 6. 生物鑒別法 利用生物體進行試驗來鑒別藥物14 例：家兔驚厥試驗鑒別胰島素 利用胰島素的降糖作用，給家兔大劑量注射胰島素，家兔驚厥，迅速靜注50%GS，驚厥停止。 7. 肽圖鑒別法 肽圖譜分析是根據(jù)蛋白質分子量的大小以及氨基酸組成特點

5、，使用專一性較強的蛋白水解酶，一般為肽鏈內切酶，作用于特殊的肽鏈位點，將蛋白質裂解成較小的片斷，經分離檢測形成特征性指紋圖譜。15三、檢查 有效成分在生物材料中濃度很低，雜質的含量相對比較高，因此，雜質檢查和安全性檢查就顯得非常重要。生化藥物應保證符合無毒、無菌、無熱源、無致敏源和降壓物質等一般安全性要求。16（一）雜質檢查 一般雜質檢查：氯化物、硫酸鹽、磷酸鹽、銨鹽、鐵鹽、重金屬等 特殊雜質檢查：原料藥純度分析 生產過程中雜質的檢查 如：原料藥純度分析 多糖類-低聚糖、核酸、蛋白質 酶類藥物-酶催化反應基本產物的分析，具有一定活性的其他有關酶的檢查。17例：糜蛋白酶中胰蛋白酶的檢查 吸取供試

6、品溶液(10 mg/ml) 50l與0.1%胰蛋白酶對照品溶液5l，分別置白色點滴板上，各加對甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯鹽酸鹽試液0.2 ml，放置后，供試品溶液應不呈現(xiàn)紫紅色或呈色時間晚于胰蛋白酶對照品溶液(1.0)。1819（二）安全性試驗熱源與細菌內毒素試驗 ： ChP中的熱原檢查采 用家兔法，細菌內毒素檢查采用鱟試劑法 異常毒性試驗 :急性毒性物質 用一定劑量的藥物按指定的操作方法和給藥途徑給予規(guī)定體重的某種試驗動物，觀察其急性毒性反應。反應的判斷以試驗動物死亡與否為終點。 過敏試驗：異性蛋白 有可能存在異性蛋白的藥物應作過敏試驗。20 降壓物質試驗： 降壓物質是指某些藥物中含有的能導致

7、血壓降低的雜質，包括組胺、類組胺或其他導致血壓降低的物質。 無菌試驗檢查藥品及敷料是否染有活菌： 無菌檢查指示控制制品染菌狀況的一種檢測手段。要使藥品真正達到無菌，首先應嚴格執(zhí)行GMP管理制度。含量表示方法：百分含量適用于結構明確的小分子藥物 或經水解后變成小分子的藥物 生物效價或酶活力單位適用于酶類、 蛋白質類藥物21四、含量測定含量測定方法： 理化分析法： 化學分析法：重量測定法、滴定分析法 電化學分析法 光譜分析法：比色法、紫外分光、熒光分光光法 色譜分析法：HPLC法（RP-HPLC、 HPIEC 、HPGFC、 灌注色譜法、HPCE法） 酶法：酶活力測定法、酶分析法 電泳法 生物檢定

8、法22酶分析法 以酶能專一而高效地催化某化學反應為基礎，通過對酶反應速度的測定或對生成物等濃度的測定而檢測相應物質的含量。包括酶活力測定法和酶法分析兩種類型。 23以酶為分析對象的分析方法以酶為分析工具或分析試劑的分析方法 酶活力測定法 酶分析法以酶能夠高效、專一地催化某些化學反應為基礎，通過對酶反應速度的測定或生成物等濃度的測定而檢測相應物質的含量原理：定義：目的：測定某種酶的活力或活性，用酶的活力單位和比活性表示以酶為試劑測定樣品中酶以外的其它物質的含量 酶反應速度用單位時間反應底物的減少或產物的增加來表示酶活力測定法1. 概念：酶活力：指酶催化一定化學反應的能力酶活力的測定即是測定一個被

9、酶所催化的化學反應的速度A B 酶2. 酶活力評價指標酶的活力單位（enzymatic activity unit） 酶的比活性（specific activity）定義：一定條件下，單位時間內轉化一定量底物所需酶的量。酶在25以最適當?shù)牡孜餄舛取⒆钸m當?shù)木彌_液離子強度以及最適當?shù)膒H等條件下，每分鐘能轉化1 mol底物的酶量為一個活性單位，用IU表示。定義：每毫克蛋白質中所含的酶單位數(shù)，用IU/（mg 蛋白質）表示每毫克酶的活力單位數(shù) 在酶高度純凈，酶的分子量已知時，可采用分子活力表示3. 酶促反應的條件及影響因素：使所有待測定的酶分子都應該能夠正常地發(fā)揮它的作用。如何選擇酶促反應的條件：

10、底物濃度影響：反應速率受到底物濃度影響 pH影響：pH影響酶的活性和反應方向S100KmpH7pH10乳酸丙酮酸如：乳酸脫氫酶 溫度影響：這一影響體現(xiàn)在兩個方面直接影響化學反應速度影響酶通常選用25，30或37 （0.1） 輔助因子影響： 有些酶需要金屬離子，有些酶則需要相應的輔酶物質。為了提高酶在反應系統(tǒng)中的穩(wěn)定性，有時需要某些相應的物質。如對巰基酶可加入二巰基乙醇、二巰基蘇糖醇等。 空白和對照： 通過不加酶，或不加底物，或二者都加（但酶需經過失效處理）； 空白是指雜質反應和自發(fā)反應引起的變化量；提供未知因素的影響。 對照是指用純酶或標準酶制劑測得的結果，主要用于比較或標定。ii) 常用方法

11、有：適當條件下將酶和底物混合 測定生成一定量產物所需的時間，即終點法 隔一定時間，間斷或連續(xù)地測定反應變化 反應一定時間后停止反應，定量測定底物減少或產物生成的量 i) 包括物理法、化學法和酶分析法4. 測定方法：按取樣和檢測方式分為取樣測定和連續(xù)測定： 取樣測定 酶反應開始后不同的時間，取出一定量反應液，并用適當?shù)姆椒ㄍＶ蛊浞磻螅瑢Ξa物和底物進行定量分析，求得單位時間內酶促反應變化量的方法。加入酶變性劑加熱使酶變性 基于底物和產物在物理化學性質上的不同，在反應過程中對反應系統(tǒng)進行直接連續(xù)檢測的方法。 連續(xù)測定 幾乎所有酶反應都可根據(jù)產物或底物的化學性質找出具體測定方法取樣測定法目前仍廣泛采

12、用，這是因為： 它不需要特殊儀器； 由于色源底物和熒光源底物的發(fā)展，可在原來的底物分子上接上相應的有色基團、發(fā)色基團或熒光基團。從準確性和測定效率看，連續(xù)法都比取樣測定好。 檢測方法：常用UV-Vis和熒光分光光度法 UV-Vis分光光度法： 熒光分光光度法如：細胞色素氧化酶的底物為細胞色素C，該物質的還原態(tài)在550nm的摩爾吸收系數(shù)為2.18104，而氧化態(tài)為0.80104，可利用這種吸收度差別來進行測定。 產物和底物之一有熒光，熒光強度變化可指示反應速度。特別適于酶量或底物量極低時的快速分析。 旋光度法產物和底物在某波長或波段處有明顯的特征吸收差別。某些酶反應過程常伴隨著旋光變化，在沒有其

13、它更好的方法可用時，可考慮用旋光度測定法 其它法酶偶聯(lián)測定、電化學測定、放射化學法等5. 計算：測定酶反應速度V (velocity)求酶的濃度或含量C (concentration)V=kC+b 酶反應進程曲線：不同酶量的產物濃度CB時間t反應速度Vt檢驗酶反應和測定系統(tǒng)是否正確酶濃度曲線：反應速度Vt酶量C生物制品：是應用普通的生物技術獲得的微生物、細胞及組織等生物材料制備用于人類疾病預防、治療和診斷的藥品。第二節(jié) 生物制品35一、生物制品的分類1.疫苗類藥物：細菌疫苗、病毒疫苗、聯(lián)合疫苗、 2.抗毒素及抗血清類藥物：被動免疫制劑3.血液制品4.重組DNA制品：細胞因子、生長因子、酶、抗體

14、5.診斷制品 6.其他制品36二、質量控制特點生物制品的質量需要從原材料、生產過程到最終產品進行全過程控制，對原液、半成品和成品進行微生物學、化學和物理學檢定。質量突出體現(xiàn)在安全性和有效性。37三、物理化學檢定生物制品的物理化學檢定包括鑒別、物理性狀檢查、分子量測定法、蛋白質含量測定、防腐劑含量測定、純度檢查、安全性檢查、生物制品的效力測定等381.生物制品的鑒別生鑒別方法包括理化方法和生物學方法理化方法：常用的有HPLC法生物學方法：依據(jù)生物制品的生物學特點，利用免疫學等方法進行真?zhèn)蔚呐袛?，常用的有免疫印跡法、免疫斑點法、免疫雙擴散法、酶聯(lián)免疫法等39例 重組人生長激素的鑒別：在相關蛋白質檢

15、查項下記錄的色譜圖中，供試品主峰的保留時間響應與相應的對照品(重組人生長激素或甲?；亟M人生長激素對照品)的保留時間一致；取對照品溶液和供試品溶液各10 L，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，供試品的肽圖譜應與對照品的肽圖譜一致。40例 ChP中注射用重組人促紅素(CHO細胞)、注射用重組人干擾素1b、注射用重組人干擾素2a、注射用重組人干擾素2b、注射用重組人白介素-2等33種生物制品均采用免疫印跡法鑒別。該法是以供試品與特異性抗體結合后，抗體再與酶標抗體特異性結合，通過酶學反應的顯色，對供試品的抗原特異性進行檢查。412.物理性狀檢查主要包括外觀、真空度及溶解時間檢查。制品外觀異常往往會涉及

16、制品的安全和效力，一般以澄明度來檢查外觀類型不同的制品。真空封口的凍干制品應進行真空度及溶解時間檢查，通?？捎酶哳l火化真空測定器檢查其真空度，凡有真空度者瓶內應出現(xiàn)藍紫色輝光。423.分子量的測定 通常采用十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定。多數(shù)蛋白質與陰離子表面活性劑SDS按重量比結合成復合物，使蛋白質分子所帶的負電荷遠遠超過天然蛋白質分子的凈電荷，消除了不同蛋白質分子的電荷效應，使蛋白質按分子大小分離。 434.蛋白質含量測定很多生物制品的有效成分是蛋白質。類毒素、抗毒素、血液制品和基因工程產品等需要測定蛋白質含量，以檢查其有效成分，計算純度和比活性。ChP采用的測定方法有

17、凱氏定氮法、酶試劑法(Lowry法)和雙縮脲法。44凱氏定氮法 通過測定供試品的總氮含量以及經鎢酸沉淀法去除蛋白的供試品濾液中的非蛋白氮含量，計算出蛋白質的含量。45一般步驟是將一定量的供試品置于凱氏燒瓶中，加硫酸、硫酸鹽及適當?shù)拇呋瘎訜嵯?，使有機分子破壞分解，將氮完全轉變?yōu)榱蛩徜@，加氫氧化鈉溶液堿化，將游離出的氨蒸餾出來，并由2硼酸溶液吸收，然后用硫酸滴定液進行滴定。 5.純度檢查抗毒素、類毒素、血液制品和基因工程產品在制造中，經過精制提純，故要求檢查純度，通常采用電泳法和高效液相色譜法檢查。46四、安全性檢定生物制品的安全檢定有一般安全檢查；殺菌、滅活和脫毒情況的檢查；外源性污染物檢查和過敏性物質檢查。47一般安全檢查包括無菌試驗、熱原試驗等。2. 疫苗和類毒素制品的菌毒種多為致病性強的微生物，如未被殺死或解毒不完全，在生物制品的使用中就會發(fā)生嚴重事故，因此需要進行活毒檢查、解毒試驗和殘余毒力試驗。 483. 抗毒素是采用異種蛋白為原料所制成，因此需要檢查過敏原是否符合限度要求。4. 外源性污染物檢查主要有