DNA連接反應的步驟及說明

1、快速DNA連接試劑盒概述：克隆中兩個重要步驟包括外源DNA與載體的連接和重組DNA的轉(zhuǎn)化。連 接反應是通過連接酶完成的，連接反應需要ATP和鎂離子催化雙鏈DNA的 3 -OH和5 -P形成磷酸二酯鍵。DNA末端可以是 粘末端，也可以是平末端。 粘末端連接反應效率高于平末端連接效率。因此，在連接平末端分子時DNA濃 度要高于粘末端分子連接反應的DNA濃度。PEG可以使T4 DNA連接酶對平末端 和粘末端連接效率得到提高Pheiffer, B.H., Zimmerman, S.B., Nucleic Acids Res., 11, 7853-7871, 1983。由于PEG可以輔助提高連接效率，該

2、試 劑盒對于粘末端和平末端的連接只需十分鐘即可完成。試劑盒中提供獨特的 5XRapid Ligation Buffe，專為提高DNA連接效率設(shè)計。高的PEG濃度可以提 高連接反應效率但卻會使轉(zhuǎn)化效率 降低，因此應該對PEG濃度進行優(yōu)化。該試 劑盒中優(yōu)化的PEG濃度同時保證了高的連接效率和轉(zhuǎn)化效率。目錄號規(guī)格價格LINK-3030 次180 元保存：試劑盒中所有組分需-20C保存。請不要用其它試劑替代該試劑盒中的反應緩 沖液。試劑盒包裝組成：該試劑盒中提供的試劑可以完成30X20 ul DNA連接反應。試劑盒組成規(guī)格(30reactions )T4 DNA ligase30ul5XRapid L

3、igation Buffer(5x RLB)200 Ul特點：室溫(20-25C)連接 10-30 min。存儲緩沖液：10 mM Tris-HCl (pH 7.5)50 mM KCl1 mM Dithiothreitol50% Glycerol質(zhì)量控制：試劑盒中提供的T4 DNA連接酶沒有檢測到外切核酸酶或內(nèi)切核酸酶活性。 另外每一批連接酶都通 過SDS聚丙烯酰胺凝膠檢測蛋白污染(低于5%)。核酸外切酶污染檢驗T4 DNA連接酶與1mg經(jīng)超聲波處理的3H標記的E.coli DNA (105cpm/mg)在50ml反應體系中，采 用隨酶提供的Rapid Ligation Buffer，37C溫

4、育4小時。通過三氯乙酸(TCA)沉淀DNA,然后計算上清 液的放射活性。 通過計算上清液中被標記的總DNA放射活性，進而可以顯示出核酸外切酶活性。 檢測出外切酶活性低于0.1放射活性，這種方法可檢測出的底線是0.05%。核酸內(nèi)切酶檢測 在50ul反應體系里,T4DNA連接酶與1 mg超螺旋質(zhì)粒DNA37C 溫育4小時，用瓊脂糖凝膠電泳 檢測，只有0.1%轉(zhuǎn)變?yōu)槿笨诨蚓€性質(zhì)粒DNA。操作步驟：DNA片段克隆到質(zhì)粒載體上我們推薦載體與插入DNA的摩爾數(shù)比例為1:1或1:3。最佳的摩爾數(shù)比例因載 體類型的不同而不同，例如cDNA和基因組DNA克隆載體?？筛鶕?jù)以下公式計算 插入DNA用量：(ng of

5、 vector) x (kbp size o-f ins-ert), Insert,kbp size of vector: x molar ratio of = rtq of nv-ector實例:載體與插入片段的摩爾數(shù)比例為1:3,如連接反應中加入100ng 6kb載體， 插入片段大小為0.5kb，這時應加入插入片段的量為：x=25 皿16kbp size of vector(10Ong v-ector) x (O.5kbp size of insert)在一個PCR薄壁管中加入下列成份:100ng25ng4ul1ul至 20ul載體DNA 插入DNA 5XRLBT4DNA連接酶 ddH2O

6、室溫溫育十分鐘將連接反應液與感受態(tài)細胞做轉(zhuǎn)化。(感受態(tài)效率：1X107)線性DNA重新環(huán)化：在重新環(huán)化反應中DNA的量十分重要。同DNA片段克隆到載體相比，較 低的DNA濃度有利于增強重新環(huán)化，因為低的DNA濃度有利于分子內(nèi)部的連接 (重新環(huán)化)，而抑制分子之間的連接。實例:在一個PCR薄壁管中加入下列成份：載體 DNA2030ng5XRLB4ulT4 DNA連接酶1ulddH2O至 20ul室溫溫育十分鐘。將連接反應液與感受態(tài)細胞做轉(zhuǎn)化。（感受態(tài)效率：1X107）接頭連接反應：接頭（8個堿基或者更長）連接反應條件同DNA片段與質(zhì)粒載體連接相同。但是如果接頭的長度小于8個堿基或者GC含量較低，

7、那么連接反應 應該在16C 進行30分鐘到2小時。我們推薦載體/接頭摩爾比為：脫磷酸化載體：磷酸 化接頭1:100實例:在一個PCR薄壁管中加入下列成份：DNA 片段100ng接頭25ng5XRLB4ulT4 DNA連接酶 1ulddH2O至 20ul16C溫育1小時將連接反應液與感受態(tài)細胞做轉(zhuǎn)化。（感受態(tài)效率：1X107）在接頭連接反應中70C十分鐘可以使T4 DNA連 接酶失活，可根據(jù)試驗情況進 行純化。問題與建議：影響連接反應的因素很多，例如：連接反應本身、感受態(tài)細胞、媒介選擇、 限制性內(nèi)切酶對載體的消化能力、磷酸酶與載體的相互作用等。由于連接反應中 的組分對感受態(tài)細胞的抑制作用，因此在

8、做轉(zhuǎn)化之前應該對反應稀釋5倍。下 表列出了一些可能引起連接失敗的原因及建議?？赡茉蚪ㄗh解決方法在DNA中存在連接酶抑制物純化DNA，用酚抽提并且乙醇沉淀DNA連接酶失活更換新的T4 DNA連接酶反應緩沖液中ATP降解請于24個月內(nèi)使用5XRapid LigationBuffer并于-20C儲存限制性內(nèi)切酶的存在導致連接產(chǎn)物被通過酚抽提并且乙醇沉淀去除限制性內(nèi)切酶或者熱再次消化失活內(nèi)切酶反應物中DNA被非特異性核酸內(nèi)切酶降解盡量使用新的試劑，水要高壓滅菌實驗信息：1.連接效率粘末端DNA連接反應（EcoR I）平末端DNA連接反應（Sma I）粘末端DNA連接凌應（EcoR 平末端DNA連接反應（導版I葵旅200%忑 15050能圖1，以上兩圖為A公司的快速DNA連接試劑盒與SBS Genetech快 速DNA連接試劑盒的試驗對比。無論粘末端還是平末端SBS Genetech試劑盒的 連接效率均大于A公司。2.長插入片斷的連接對于長度為廣2kb的插入片段，我們推薦在室溫（20-25C）下做連接，連 接反應不超過30分鐘。雖然長