課題申報(bào)書-大鼠慢性高氧肺損傷

1、報(bào)告正文立項(xiàng)依據(jù)與研究?jī)?nèi)容（4000-8000字）： 項(xiàng)目的立項(xiàng)依據(jù)隨著機(jī)械通氣、表面活性物質(zhì)替代療法等新技術(shù)應(yīng)用，危重新生兒、尤其是早產(chǎn)兒存活率已顯著提高。然而，長(zhǎng)時(shí)間吸入高濃度氧，幸存者易發(fā)生肺部氧化應(yīng)激損傷。目前，高氧肺損傷已成為發(fā)達(dá)國(guó)家NICU最為棘手的問題之一和嬰兒慢性肺疾病的最常見形式。但高氧肺損傷的確切機(jī)制尚未完全闡明，更無有效的防治手段。因此深入研究其發(fā)病機(jī)制，積極防治高氧肺損傷，具有優(yōu)生優(yōu)育、提高人口素質(zhì)的戰(zhàn)略意義。高氧肺損傷是一個(gè)涉及許多細(xì)胞活動(dòng)的復(fù)雜過程，可分為早期的組織損傷（彌散性肺泡炎）和晚期的損傷后修復(fù)（肺間質(zhì)重構(gòu)）兩個(gè)過程。細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular

2、matrix,ECM）的重建參與了高氧肺損傷的整個(gè)病理過程，若ECM重建正常，則損傷完全修復(fù)，肺結(jié)構(gòu)正常；若ECM重建紊亂，將導(dǎo)致肺纖維化。因此，ECM重建是關(guān)系高氧肺損傷結(jié)局的關(guān)鍵因素。本實(shí)驗(yàn)室在國(guó)內(nèi)外率先開展了對(duì)早產(chǎn)大鼠高氧肺損傷中基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）和其抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMPs)表達(dá)的研究，已發(fā)現(xiàn)肺損傷時(shí)MMPs過度表達(dá)、MMPs/TIMPs失衡是ECM重建紊亂發(fā)生纖維化的關(guān)鍵原因 1（具體研究成果見研究基礎(chǔ)欄）。有關(guān)MMPs在高氧肺損傷中的作用已為少數(shù)國(guó)外學(xué)

3、者所重視，但高氧肺損傷后ECM重建過程中，引起MMPs過度增加的具體機(jī)制是什么？本實(shí)驗(yàn)室擬從MMPs的誘導(dǎo)劑和抑制劑兩方面深入研究。細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)劑（extracellular matrix metalloproteinase inducer,Emmprin）在上調(diào)MMPs表達(dá)中起關(guān)鍵作用。Emmprin是分子量為58KD的質(zhì)膜糖蛋白，具有酪氨酸蛋白激酶活性，不僅表達(dá)于正常組織，還表達(dá)于腫瘤組織如肺部腫瘤細(xì)胞，提示Emmprin參與體內(nèi)生理及病理過程2。目前，少數(shù)文獻(xiàn)已證明，體外Emmprin與人成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)后，成纖維細(xì)胞MMPs表達(dá)增加。進(jìn)一步研究表明，Emmprin在細(xì)胞表面

4、與自身受體或MMP結(jié)合，激活胞內(nèi)MAPK p38信號(hào)通路，該途徑激活促進(jìn)ECM降解3，4。但關(guān)于Emmprin/MAPK p38對(duì)MMPs調(diào)節(jié)的研究?jī)H限于腫瘤細(xì)胞，有關(guān)高氧肺損傷后肺ECM重建過程中，Emmprin如何調(diào)控MMPs/TIMPs平衡，目前國(guó)內(nèi)外尚無文獻(xiàn)報(bào)道。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（Transforming growth factor beta, TGF-）在下調(diào)MMPs表達(dá)中起關(guān)鍵作用。研究證明TGF-刺激可使肺成纖維細(xì)胞MMPs生成減少5。另有研究發(fā)現(xiàn)，TGF-抑制元件位于MMP-1基因啟動(dòng)子區(qū)，嚴(yán)密調(diào)控MMP-1在不同生理和病理情況下的表達(dá)6。進(jìn)一步的研究表明，TGF-對(duì)MMP-1的作

5、用通過SMAD信號(hào)途徑介導(dǎo)，該途徑激活可阻止ECM降解5。因此，推測(cè)TGF-/SMAD對(duì)MMPs/TIMPs平衡的調(diào)節(jié)可能是影響肺損傷后ECM重建的關(guān)鍵因素之一。有關(guān)高氧肺損傷后肺ECM重建過程中，TGF-如何調(diào)控MMPs/TIMPs平衡，目前國(guó)內(nèi)外尚無文獻(xiàn)報(bào)道。近年來對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn)，位于大多數(shù)細(xì)胞質(zhì)膜上約50-100nm大小的囊性凹陷結(jié)構(gòu)小窩（caveolae），是許多信號(hào)分子完成跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的“驛站”。小窩蛋白（caveolin）是小窩胞漿面包被的一種21-24kD的膜蛋白，是許多信號(hào)分子活性狀態(tài)的重要調(diào)節(jié)者。在無胞外信號(hào)刺激下，caveolin通常與富集于小窩質(zhì)膜上的各種信號(hào)分

6、子、受體及非受體型酪氨酸激酶等相結(jié)合，抑制這些信號(hào)物質(zhì)的活性；在激動(dòng)劑與受體結(jié)合后，caveolin分子構(gòu)象發(fā)生變構(gòu)或共價(jià)修飾，調(diào)節(jié)信號(hào)物質(zhì)的活化狀態(tài)，參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控7。有關(guān)caveolin在肺ECM重建中的作用，有學(xué)者提出肺泡型上皮細(xì)胞caveolin表達(dá)缺失可能是發(fā)生肺纖維化的亞細(xì)胞指標(biāo)。對(duì)caveolin-1基因敲除小鼠的研究，肺組織顯示肺泡隔因細(xì)胞增殖而增厚和肺纖維化。caveolin-1在肺發(fā)育的不同階段，可表達(dá)于不同血管和上皮細(xì)胞，呈時(shí)相分布8。研究發(fā)現(xiàn)，caveolin 1與TGF-型受體（TR）相互作用，抑制TGF-介導(dǎo)的SMAD-2和下游分子的磷酸化，從而調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)9。E

7、mmprin具有酪氨酸蛋白激酶活性，且其信號(hào)傳導(dǎo)為酪氨酸磷酸化依賴的MAPK p38途徑，申請(qǐng)者推測(cè)caveolin能與Emmprin相互作用，調(diào)控Emmprin介導(dǎo)的MAPK p38和下游分子的磷酸化。簡(jiǎn)圖如下：胞外信 caveolin +? caveolin/Emmprin作用 Emmprin/MAPK p38號(hào)刺激 變構(gòu)活化 + caveolin/TR作用 TGF-/SMAD信號(hào)整合 調(diào)控肺ECM重建 基于上述，申請(qǐng)者提出如下假設(shè)：高氧暴露下MMP誘導(dǎo)劑/抑制劑失衡是高氧肺損傷MMPs增加，ECM重建紊亂的主要原因。高氧暴露使質(zhì)膜小窩表達(dá)或功能異常，從而影響Emmprin/MAPK p3

8、8和TGF-/SMAD兩條信號(hào)通路整合，繼而導(dǎo)致MMPs增加，ECM重建紊亂。本人所在的研究室屬呼吸系統(tǒng)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。多年來，本人一直致力于新生兒高氧慢性肺損傷的研究，已成功建立了早產(chǎn)大鼠高氧肺損傷的動(dòng)物模型、掌握了支氣管肺泡灌洗術(shù)、體外型肺泡上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞培養(yǎng)、核酸、蛋白分析等技術(shù)，并對(duì)抗氧化酶、細(xì)胞因子水平、一氧化氮、MMPs/TIMPs失衡等因素在高氧肺損傷發(fā)病機(jī)制中所起的作用進(jìn)行了較深入的研究，同時(shí)應(yīng)用地塞米松、維甲酸、人類重組促紅細(xì)胞生成素、EGb761進(jìn)行了抗氧化損傷的干預(yù)研究（見研究基礎(chǔ)欄）。這些理論研究和技術(shù)方法的積累為本課題的開展奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 本研究如能完成，可

9、望為探索高氧肺損傷后肺ECM重建紊亂的機(jī)制開拓新思路，并為尋找有效的預(yù)防和干預(yù)高氧肺損傷提供依據(jù)。 參考文獻(xiàn)Taylor PM, Woodfield RJ, Hodgkin MN et al.Breast cancer cell-derived EMMPRIN stimulates fibroblast MMP2 release through a phospholipase A(2) and 5-lipoxygenase catalyzed pathway. Oncogene 2002 Aug 22;21(37):5765-72Liang L, Major T, Bocan T.Charac

10、terization of the promoter of human extracellular matrix metalloproteinase inducer (EMMPRIN). Gene 2002 Jan 9;282(1-2):75-86Lim M, Martine T, Jablons D. Tumor-derived EMMPRIN(extrocellular matrix metalloproteinases inducer) stimulates collagenase transcription through MAPK p38. FEBS Lett 1998;441(1)

11、:8892Yuan W, Varga J. Transforming growth factor-beta repression of matrix metalloproteinase-1 in dermal fibroblasts involves Smad3. J Biol Chem 2001;276(42):38502-10White LA, Mitchell TI, Brinckerhoff CE. Transforming growth factor beta inhibitory element in the rabbit matrix metalloproteinase-1 (c

12、ollagenase-1) gene functions as a repressor of constitutive transcription. Biochim Biophys Acta 2000 Feb 29;1490(3):259-68Razani B, Zhang XL, Bitzer M, et al. Caveolin-1 regulates TGF-beta/SMAD signaling through an interaction with the TGF-beta type = 1 * ROMAN I receptor. J Biol Chem 2001;276 (9):6

13、7276738Ramirez MI, Pollack L, Millien G, et al. The alpha-Isoform of Caveolin-1 Is a Marker of Vasculogenesis in Early Lung Development. J Histochem Cytochem 2002;50(1):3342Drab M, Verkade P, Elger M, et al. Loss of caveolae, vascular dysfunction, and pulmonary defects in caveolin-1 gene-disrupted m

14、ice. Science 2001;293(5539):244952項(xiàng)目的研究?jī)?nèi)容、研究目標(biāo),以及擬解決的關(guān)鍵問題。研究目標(biāo)：建立早產(chǎn)大鼠慢性高氧肺損傷模型，探討Emmprin與TGF-調(diào)節(jié)失衡是否為高氧肺損傷MMPs增加，ECM重建紊亂的主要原因；探討小窩蛋白對(duì)Emmprin/MAPK p38和TGF-/SMAD兩條信號(hào)通路整合的影響，為高氧肺損傷發(fā)生機(jī)制和尋找有效防治措施提供理論依據(jù)。研究?jī)?nèi)容：Emmprin/MAPK p38信號(hào)通路活化狀態(tài)及高氧肺損傷所致ECM重建紊亂的相關(guān)性： 研究高氧肺損傷不同時(shí)間點(diǎn)肺組織中Emmprin、P38、磷酸化P38的表達(dá)。 研究高氧肺損傷Emmprin/

15、MAPK p38信號(hào)通路活化狀態(tài)與MMPs表達(dá)雙變量關(guān)系。TGF-/SMAD信號(hào)通路活化狀態(tài)及高氧肺損傷所致ECM重建紊亂的相關(guān)性： 研究高氧肺損傷不同時(shí)間點(diǎn)肺組織中TGF-、TR、SMAD、磷酸化SMAD的表達(dá)。 研究高氧肺損傷TR的激酶活性，計(jì)算磷酸化SMAD與非磷酸化SMAD比值。 研究高氧肺損傷TGF-/SMAD信號(hào)通路的活化狀態(tài)與MMPs/TIMPs的雙變量關(guān)系。caveolin-1對(duì)Emmprin/MAPK p38和TGF-/SMAD兩條信號(hào)通路及其與高氧肺損傷所致ECM重建紊亂的相關(guān)性：研究高氧肺損傷不同時(shí)間點(diǎn)肺組織中caveolin-1表達(dá)及酪氨酸磷酸化水平。研究高氧肺損傷肺組

16、織質(zhì)膜小窩內(nèi)caveolin-1與Emmprin的共定位。研究高氧肺損傷肺組織質(zhì)膜小窩內(nèi)caveolin-1與TR的共定位。擬解決的關(guān)鍵問題：成年動(dòng)物急性高氧肺損傷模型，因其肺發(fā)育已成熟，不能如實(shí)反映不成熟肺的損傷情況，并且與臨床上早產(chǎn)兒需長(zhǎng)期用氧情況差異較大。本項(xiàng)目采用早產(chǎn)大鼠慢性高氧肺損傷模型，能更如實(shí)模擬支氣管肺發(fā)育不良的發(fā)生情況。雖然此模型技術(shù)難度較大，但本研究組在早產(chǎn)大鼠模型制備方面已積累了豐富經(jīng)驗(yàn)，能成功完成此模型的復(fù)制。本研究假設(shè)caveolin與Emmprin的相互作用可調(diào)控Emmprin/MAPK p38信號(hào)通路活化；caveolin-1與TR的相互作用可調(diào)控TGF-/SMA

17、D信號(hào)通路活化。以往由于技術(shù)條件限制，未能從形態(tài)學(xué)上直接證實(shí)。借助共聚焦顯微鏡觀察和熒光雙重標(biāo)記技術(shù)可解決這一技術(shù)難題。擬采取的研究方案及可行性分析。研究方法： 本課題采用共聚焦顯微鏡（confocal microscope）、免疫熒光雙重標(biāo)記和免疫組織化學(xué)等研究方法，輔以蛋白質(zhì)與核酸分析技術(shù)（Western Blot、Northern Blot方法），檢測(cè)各指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化，并對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行定位、定性、定量分析。1.建立早產(chǎn)大鼠慢性高氧肺損傷模型： 參照申請(qǐng)者著作，實(shí)用兒科臨床雜志，.檢測(cè)caveolin-1酪氨酸磷酸化水平：應(yīng)用抗caveolin-1pAb 進(jìn)行免疫沉淀應(yīng)用抗磷酸化酪氨酸mAb

18、 進(jìn)行Western Blot分析. 檢測(cè)肺組織中Emmprin、P38、磷酸化P38 、TGF-、TGF-型受體（TR）及SMAD-2、磷酸化SMAD表達(dá)，探討高氧肺損傷所致ECM重建紊亂的分子機(jī)制： 蛋白質(zhì)水平檢測(cè)Western Blot。mRNA水平檢測(cè)Northern Blot（或RT-PCR）。 . 檢測(cè)肺組織中TR的激酶活性： TR分離提取免疫沉淀法（immunoprecipition） TR與純化的激酶底物GST-SMAD2（由美國(guó)國(guó)立癌癥研究機(jī)構(gòu)de Caestecher, M教授提供）反應(yīng)，應(yīng)用免疫印跡法檢測(cè)磷酸化SMAD2水平，計(jì)算TR的激酶活性。. 檢測(cè)肺組織質(zhì)膜小窩內(nèi)c

19、aveolin /Emmprin及caveolin-1/TR的共定位及表達(dá)：樣本制備： 制備組織切片加入抗caveolin mAbPE標(biāo)記的二抗加入抗Emmprin/TR的pAbFITC標(biāo)記二抗 共聚焦顯微鏡（TCSSP型，德國(guó)Leica公司）檢測(cè)共定位；應(yīng)用圖象分析軟件對(duì)caveolin表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行半定量。應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法處理數(shù)據(jù)：應(yīng)用SAS統(tǒng)計(jì)分析軟件，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。技術(shù)路線： 早產(chǎn)大鼠高氧肺損傷模型caveolaecaveolin酪氨酸磷酸化狀態(tài)（免疫沉淀、免疫印跡） Emmprin/MAPK p38 TGF-/SMAD信號(hào)通路研究信號(hào)通路研究Emmprin、P38、磷酸化P38T

20、GF-、TR、SMAD、磷酸化SMAD表達(dá)（免疫印跡與Northern Blot 表達(dá)（Western Blot和Northern Blot）或RT-PCR)TR激酶活性（免疫沉淀和免疫印跡）caveolin/Emprin共定位 (熒光雙標(biāo)記、共聚焦顯微鏡)caveolin/ TR共定位 (熒光雙標(biāo)記、共聚焦顯微鏡)可行性分析：申請(qǐng)者所在的研究室屬于呼吸系統(tǒng)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室臨床二室，本室在慢性阻塞性肺疾病和肺纖維化發(fā)病機(jī)制的研究領(lǐng)域已有大量工作積累，為本項(xiàng)目的研究打下了良好的工作基礎(chǔ)。申請(qǐng)者及所在研究室在產(chǎn)兒高氧損傷領(lǐng)域進(jìn)行了一系列開拓性研究，已熟練掌握急、慢性高氧肺損傷模型復(fù)制，蛋白、核酸分析

21、等技術(shù)。（詳見研究基礎(chǔ)欄）本項(xiàng)目研究的主要成員之一，香港合作者教授，是國(guó)際上新生兒肺損傷研究的前沿科學(xué)家，目前與本研究小組密切合作，進(jìn)行有關(guān)慢性肺損傷研究?；籼┹x教授除承擔(dān)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，并提供部分試劑。新一代共聚焦顯微鏡具有觀察亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的立體定位功能，用其檢測(cè)在體組織caveolin/Emmprin、caveolin/ TR信號(hào)分子在亞細(xì)胞位點(diǎn)的共定位表達(dá)，雖無文獻(xiàn)報(bào)道，在技術(shù)上難度較大，但申請(qǐng)者已掌握了多種熒光標(biāo)記技術(shù)，應(yīng)用共聚焦顯微鏡觀察caveolin-1在細(xì)胞質(zhì)膜上的定位表達(dá)也已獲成功。申請(qǐng)人所在單位的醫(yī)學(xué)中心的共聚焦顯微鏡和本實(shí)驗(yàn)室的基本研究設(shè)備，能保證本實(shí)驗(yàn)研究完成。本項(xiàng)目的特色與創(chuàng)

22、新之處。理論上的創(chuàng)新：研究Emmprin/MAPK p38信號(hào)通路在器官發(fā)育和組織病理?yè)p傷中的作用,國(guó)內(nèi)外尚無文獻(xiàn)報(bào)道。本課題研究caveolin對(duì)Emmprin/MAPK p38、TGF-/SMAD共調(diào)節(jié)機(jī)制，將為早產(chǎn)兒高氧肺損傷發(fā)病機(jī)制開辟新的研究領(lǐng)域，并為其防治開拓新思路。方法上的創(chuàng)新：以在體組織為研究對(duì)象，應(yīng)用免疫熒光雙重標(biāo)記共聚焦顯微鏡技術(shù)研究caveolin/Emmprin、caveolin/TR共定位，國(guó)內(nèi)外未見文獻(xiàn)報(bào)道，可望為深入研究小窩蛋白對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控機(jī)制開辟新途徑。年度研究計(jì)劃及預(yù)期研究結(jié)果。年度研究計(jì)劃及預(yù)測(cè)進(jìn)展 本課題研究?jī)?nèi)容預(yù)計(jì)用3年時(shí)間完成. 2004年1月8月

23、購(gòu)買所需試劑。建立預(yù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。進(jìn)行各項(xiàng)預(yù)實(shí)驗(yàn)。 2004年9月2005年2月 建立動(dòng)物模型。完成標(biāo)本的收集。 2005年3月7月 完成MMPs、TIMPs、TGF-、TR、SMAD2及其mRNA表達(dá)的研究，并進(jìn)行階段性總結(jié)。 2005年8月2005年12月 完成caveolin-1表達(dá)和caveolin-1/TR共定位研究，并進(jìn)行階段性總結(jié)。 2006年1月2006年6月 完成caveolin-1的酪氨酸磷酸化狀態(tài)研究，并進(jìn)行階段性總結(jié)。 2006年7月12月 研究數(shù)據(jù)資料分析、總結(jié)、論文撰寫及成果鑒定。 預(yù)期研究成果本項(xiàng)目所建立的早產(chǎn)新生大鼠慢性高氧肺損傷模型，不僅為本課題提供了研究對(duì)象

24、，而且為研究高氧肺損傷后肺ECM重建提供了模型。本研究可望為闡明早產(chǎn)兒高氧肺損傷機(jī)制提供新的線索：高氧暴露下MMP誘導(dǎo)劑/抑制劑失衡是高氧肺損傷MMPs增加，ECM重建紊亂的主要原因。高氧暴露使質(zhì)膜小窩表達(dá)或功能異常，從而影響Emmprin/MAPK p38和TGF-/SMAD兩條信號(hào)通路整合，繼而導(dǎo)致MMPs增加，ECM重建紊亂。本研究?jī)?nèi)容也可能為預(yù)防和干預(yù)高氧肺損傷提供理論依據(jù)。（二）研究基礎(chǔ)與工作條件工作基礎(chǔ)1. 與本項(xiàng)目有關(guān)的研究工作積累和已取得的研究工作成績(jī)本課題組多年來一直進(jìn)行高氧肺損傷的發(fā)病機(jī)制及防治的研究，做了許多基礎(chǔ)和臨床研究工作。已成功建立早產(chǎn)新生大鼠高濃度氧（85%95%

25、）急性肺損傷和慢性肺纖維化的模型；已完成肺組織中各種抗氧化酶活力、羥脯氨酸含量與肺纖維化的相關(guān)性研究；內(nèi)源性一氧化氮在高氧肺損傷中雙重作用的研究；體外高氧對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞分泌IL-8的影響研究；TGF-在早產(chǎn)大鼠高氧肺損傷肺組織中表達(dá)的研究；基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑在高氧肺損傷中的作用機(jī)制的研究；及促紅細(xì)胞生成素、地塞米松、維甲酸對(duì)新生鼠高氧肺損傷的干預(yù)研究。獲獎(jiǎng)?wù)n題目前正承擔(dān)的相關(guān)科研項(xiàng)目：1. 2. 相關(guān)研究工作發(fā)表的文章：附：基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑在高氧肺損傷中的作用1. 高氧組病理學(xué)改變 2. 高氧組MMPs表達(dá) 圖1 肺發(fā)育不良，示肺泡 圖2 細(xì)胞增生、間質(zhì)纖維 圖3 MMP-2強(qiáng)陽(yáng)

26、性表達(dá)數(shù)目減少、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單 化改變3. 酶譜法測(cè)BALF中明膠酶活性 4. 高氧暴露后MMPs、TIMPs表達(dá)增加 MMP-2 MMP-9 TIMP-1 TIMP-23d O2 0.460.36 0.900.64 2.000.47 0.300.23 air 0.070.10 0.070.16 0.870.58 0.030.087d O2 1.330.60 0.110.45 2.600.71 1.150.34 air 0.360.43 0.170.35 1.700.35 0.060.1014d O2 3.400.53 2.750.66 3.370.45 2.430.18air 1.300.90 0

27、.330.31 2.820.89 0.080.1021d O2 3.730.46 3.350.60 3.880.11 1.900.38air 0.300.14 0.600.10 2.540.55 0.300.14圖4 高氧組條帶亮度增強(qiáng)，示活性增強(qiáng) 高氧組與對(duì)照組比較均P0.05 工作條件研究所需實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，均有實(shí)驗(yàn)合格證。申請(qǐng)者所在醫(yī)院的分子醫(yī)學(xué)中心設(shè)備可協(xié)助完成Western blot 、northern blot、免疫沉淀等實(shí)驗(yàn)。Caveolin-1抗體由Division of Hematology/Oncology/BMT Department of Pediatrics Emory U

28、niversity School of Medicine教授有償提供。本項(xiàng)目所需的其它抗體、分子探針和試劑國(guó)外均有售，或由合作者Fok TF贈(zèng)送?？傊暾?qǐng)人所在的醫(yī)院及大學(xué)的實(shí)驗(yàn)條件，完全能夠滿足該項(xiàng)目的研究要求。申請(qǐng)人簡(jiǎn)歷承擔(dān)科研項(xiàng)目情況1 由本項(xiàng)目申請(qǐng)者負(fù)責(zé)。 主要探討EGB761對(duì)高氧肺損傷早產(chǎn)新生大鼠支氣管肺泡灌洗液中細(xì)胞因子如TNF-、IL-8，IL-1、IL-6、MMPs、TIMPs及其 mRNA的影響。2早產(chǎn)兒貧血臨床治療的研究 由本項(xiàng)目申請(qǐng)者負(fù)責(zé)。3支氣管肺泡灌洗技術(shù)在新生兒肺部疾病中的應(yīng)用研究 “新技術(shù)、新業(yè)務(wù)”資助項(xiàng)目。登記序號(hào)： 項(xiàng)目編號(hào)：中醫(yī)藥、中西醫(yī)結(jié)合科研項(xiàng)目課題

29、設(shè)計(jì)書課題名稱：痛痹顆粒對(duì)骨關(guān)節(jié)炎細(xì)胞凋亡和增殖的機(jī)理研究申報(bào)單位： 江蘇省中醫(yī)院課題負(fù)責(zé)人： 朱萱萱計(jì)劃年限：郵政編碼： 210029 聯(lián)系電話： 8661714130306申報(bào)日期：江蘇省中醫(yī)藥局制填寫提綱一、立項(xiàng)依據(jù)：與選題直接相關(guān)的國(guó)內(nèi)外現(xiàn)狀、水平和發(fā)展趨勢(shì)；選題的理論和實(shí)踐依據(jù)；研究目的、意義；本研究達(dá)到的科學(xué)技術(shù)水平，預(yù)期社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益和應(yīng)用推廣前景。二、科研假說或技術(shù)構(gòu)思，主要研究?jī)?nèi)容、關(guān)鍵技術(shù)、目標(biāo)（達(dá)到的主要技術(shù)指標(biāo)或技術(shù)經(jīng)濟(jì)指標(biāo)），技術(shù)特征及創(chuàng)新之處，開發(fā)項(xiàng)目應(yīng)說明開發(fā)規(guī)模。三、研究試驗(yàn)方法及技術(shù)路線（工藝路線）。四、現(xiàn)有工作條件和基礎(chǔ)：開展本項(xiàng)研究的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)有的主要儀器

30、設(shè)備及應(yīng)用合格實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的基本條件等；已有工作基礎(chǔ)，預(yù)試驗(yàn)情況。五、計(jì)劃進(jìn)度：根據(jù)總的研究期限、年度計(jì)劃進(jìn)度，分別列出具體的目標(biāo)和進(jìn)度的考核指標(biāo)。六、參加（協(xié)作）單位意見及具體分工（附協(xié)議書）。七、經(jīng)費(fèi)概算（包括其他部門的撥款、貸款、自籌記憶取得的自主）和核算依據(jù)，以及分年度使用計(jì)劃。填寫說明一、內(nèi)容填寫自備附頁(yè)，用紙大小和封頁(yè)一致，字跡清楚，裝訂整齊后按申報(bào)要求上報(bào)。二、填寫提綱所列內(nèi)容，要全面詳細(xì)、如實(shí)填寫。三、封面上“登記序號(hào)”“項(xiàng)目編號(hào)”請(qǐng)勿填寫。立項(xiàng)依據(jù)1.1 研究目的、意義骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）又稱退行性關(guān)節(jié)病，以關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生彌漫性龜裂、纖維化和脫失及因骨組織

31、增生性變化為特征的一組臨床征候群，是多見于中年以后的慢性進(jìn)行性關(guān)節(jié)疾患。該病發(fā)病率隨年齡增長(zhǎng)而升高，據(jù)調(diào)查，在美國(guó)目前2億多人口中，就有骨關(guān)節(jié)炎4500萬(wàn)，發(fā)病率占總?cè)丝诘?0%，在老年人中所占比例更高，50歲以上人群中，OA的患病率僅次于心血管疾病，位居第二位。在我國(guó)，根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，5564歲的人群中發(fā)病率達(dá)40%，而65歲以上人群的患病率達(dá)60%90%。隨著計(jì)劃生育政策的長(zhǎng)久實(shí)施及經(jīng)濟(jì)發(fā)展，我國(guó)已進(jìn)入老齡化社會(huì)，OA的發(fā)病率還將越來越高，這不僅嚴(yán)重危害人民的生活、健康，對(duì)社會(huì)也將造成很大負(fù)擔(dān)。同時(shí)世界其他國(guó)家也面臨著同樣的問題，因而OA引起了國(guó)際、國(guó)內(nèi)醫(yī)學(xué)界的相當(dāng)重視。近年來對(duì)OA

32、的研究頗多，在發(fā)病機(jī)制、檢測(cè)手段以及治療方法上均取得較大進(jìn)步，但總的來說還缺乏令人滿意的突破性進(jìn)展。西藥治療OA的主要手段是非甾體藥，但存在副作用大、作用單一及有較多禁忌癥等缺點(diǎn)。雖然中藥治療OA也取得了一些經(jīng)驗(yàn)，但對(duì)其具體的作用機(jī)制有深入研究的卻很少，因此在中醫(yī)理論的指導(dǎo)下，運(yùn)用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，對(duì)療效確切的中藥復(fù)方進(jìn)行深入的機(jī)理研究，使中藥治療OA的療效在國(guó)際先進(jìn)行列中占一席之地，是擺在我們面前非常重要的課題。1.2 國(guó)內(nèi)外現(xiàn)狀水平和發(fā)展趨勢(shì)近十年來，國(guó)內(nèi)外對(duì)OA進(jìn)行了較深入地研究，大致歸納如下： 流行病學(xué)研究已廣泛開展在近100種不同類型的關(guān)節(jié)疾病中，OA是影響人類健康最常見的關(guān)節(jié)疾患之一，

33、沒有明顯的種族和地域差異，本病的患病率隨年齡增加而增高，故隨著人類平均壽命的延長(zhǎng)，患病率也有增高的趨勢(shì)。Felson等報(bào)道70歲以下人群膝OA患病率為7%（男6.4%，女11.4%），80歲以上為11.2%（男5.4%，女15.8%）；而放射學(xué)膝OA70歲以上為27.4%（男30.4%，女25.1%），80歲以上為43.7%。Butter等報(bào)道，44歲以下、4559歲、60歲以上人群中，放射血OA 患病率各為6.2%、21.6%和42.0%。國(guó)內(nèi)陳順樂等隊(duì)13541名鋼鐵工人的調(diào)查結(jié)果顯示，癥狀性O(shè)A患病率2.2%；無癥狀性O(shè)A患病率53%，其中3039、4049、5059歲患病率各為11%、

34、27%和62%。汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院統(tǒng)計(jì)551例，結(jié)果40歲以下、4049、5059和60歲以上各占12.2%、17.4%、26.1%和44.3%。另外不同關(guān)節(jié)OA易感性不同。美國(guó)在衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)中心調(diào)查結(jié)果，OA患病率以手最高，以下依次為足、膝、髖。國(guó)內(nèi)陳順樂等調(diào)查結(jié)果OA是頸椎最多，以下依次為腰椎、膝、手和腕。本病性別差異在脊柱差別不大，但手、膝、髖OA均以女性較多，且女性骨關(guān)節(jié)炎的遺傳易感性較男性高。在Framingham的研究中，F(xiàn)elaon等發(fā)現(xiàn)女性體重減少11磅，骨關(guān)節(jié)炎形成的風(fēng)險(xiǎn)相應(yīng)減少50%。 Saase等調(diào)查結(jié)果，膝OA患病率男、女峰值分別為24.7%和54.6%。根據(jù)1994年統(tǒng)計(jì)，在

35、美國(guó)，骨關(guān)節(jié)炎的消耗為155億美元，約為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的3倍，其中一半以上消耗緣于工作喪失。在我國(guó)雖未作全國(guó)大范圍的普查，但隨著老齡化社會(huì)進(jìn)程的不斷加快，OA的發(fā)病率會(huì)越來越高，這必將給家庭、社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)。 病因、發(fā)病機(jī)制有了巨大突破目前基礎(chǔ)研究認(rèn)為軟骨的損傷與退變是OA的根本，隨著分子生物學(xué)免疫學(xué)的發(fā)展，近年來眾多學(xué)者對(duì)OA關(guān)節(jié)軟骨退行性改變的原因從不同角度進(jìn)行了大量研究，其發(fā)病機(jī)制仍未完全明了，又提出了許多學(xué)說，如軟骨下骨內(nèi)高壓學(xué)說：由于骨血液動(dòng)力學(xué)的改變，在骨髓腔容積不變的前提下增加內(nèi)容物引起壓力增高，即表現(xiàn)為骨內(nèi)壓力增高。骨內(nèi)高壓持續(xù)增高存在下關(guān)節(jié)滑液pH值下降，成分改變，干擾并破壞

36、了軟骨細(xì)胞的正常代謝導(dǎo)致細(xì)胞變性壞死，膠原纖維解聚，蛋白多糖分解，軟骨下骨破壞、修復(fù)，最終產(chǎn)生骨性關(guān)節(jié)炎。自由基學(xué)說：認(rèn)為自由基對(duì)軟骨細(xì)胞DNA和PG的合成具有抑制作用。自由基作用軟骨細(xì)胞后，引發(fā)膜脂質(zhì)過氧化，使脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物丙二醛增多，丙二醛可與DNA發(fā)生交聯(lián)，自由基也可直接攻擊軟骨細(xì)胞DNA即合成DNA所需的酶，使DNA鏈斷裂、堿基損傷從而影響了DNA的合成，也造成前列腺（PG）合成障礙。骨關(guān)節(jié)炎時(shí)，滑膜、滑液、血管翳內(nèi)常有中性白細(xì)胞、巨嗜細(xì)胞浸潤(rùn)，其表面受免疫復(fù)合物、補(bǔ)體等作用能釋放大量O2-和H2O2；細(xì)胞因子學(xué)說：細(xì)胞因子對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展起了重要作用，如白細(xì)胞介素-1（IL

37、-1）、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子（TNF）等在OA中水平明顯增高。IL-1具有刺激軟骨細(xì)胞分泌一氧化氮、前列腺E和IL-6的作用，引起滑膜炎癥和疼痛，同時(shí)IL-1也是軟骨基質(zhì)降解的主要驅(qū)動(dòng)因子；軟骨酶降解學(xué)說：OA軟骨細(xì)胞的基質(zhì)降解酶類的合成與分泌率明顯增加，并與關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。參與降解基質(zhì)大分子的降解酶類可以增加達(dá)到幾倍。酸性和中性蛋白酶可以降解蛋白多糖的核心蛋白?；|(zhì)金屬蛋白酶，尤其是基質(zhì)溶素和膠原酶，參與關(guān)節(jié)軟骨的降解過程，這些酶類可以降解細(xì)胞外基質(zhì)的所有成分，與循環(huán)系統(tǒng)中的纖維蛋白溶酶和局部合成的纖溶酶原一起，快速降解軟骨。在滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的IL-1和

38、TNF的作用下，軟骨細(xì)胞以酶原的形式分泌大量的基質(zhì)金屬蛋白酶，而對(duì)金屬蛋白酶組織抑制劑無影響，使二者失衡從而增加對(duì)軟骨主要成分型膠原和蛋白聚糖合成的抑制作用，使軟骨進(jìn)行性破壞；一氧化氮學(xué)說：NO是一種細(xì)胞間信使分子，可介導(dǎo)許多生物學(xué)現(xiàn)象。NOS可催化重要炎性介質(zhì)NO的產(chǎn)生，OA患者血清、滑液中NO含量明顯高于正常。NO可通過抑制軟骨細(xì)胞增殖，促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡，改變蛋白多糖和膠原蛋白的合成與分泌功能，同時(shí)使軟骨細(xì)胞分泌透明質(zhì)酸減少，滑膜粘蛋白解聚，抑制軟骨細(xì)胞合成軟骨基質(zhì)，促進(jìn)軟骨細(xì)胞糖酵解，使軟骨破壞。細(xì)胞凋亡學(xué)說：細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡的形式之一，許多正常組織均可發(fā)現(xiàn)凋亡，但凋亡亢進(jìn)與不足則會(huì)引

39、起相關(guān)疾病，在骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨中軟骨細(xì)胞的凋亡有異常表現(xiàn)，且凋亡細(xì)胞數(shù)目與骨關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度明顯相關(guān)。凋亡小體存在于軟骨細(xì)胞小孔或間隙內(nèi)，其產(chǎn)生的焦磷酸鹽能從溶液中沉積鈣，有NTPPH（nucleosid triphosphate pyrophos phohydrolase）和堿性磷酸酶作用,造成余下軟骨細(xì)胞修復(fù)過程失敗，而逐漸發(fā)展成關(guān)節(jié)軟骨的完全丟失。OA軟骨細(xì)胞凋亡主要通過兩種相互獨(dú)立的途徑完成，一種是同滑膜炎癥無關(guān)的途徑,由NO介導(dǎo);另一種是同滑膜炎癥相關(guān)的途徑,由Fas介導(dǎo)。典型的OA不存在明顯的炎癥反應(yīng),此時(shí)軟骨細(xì)胞凋亡以NO途徑為主;當(dāng)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)時(shí),則通過as途徑加劇軟骨細(xì)胞凋亡和

40、關(guān)節(jié)破壞。NO通過兩種方式造成組織及細(xì)胞損傷。一是高濃度的NO能抑制多種與線粒體呼吸傳遞系統(tǒng)及檸檬酸循環(huán)有關(guān)的酶,從而抑制線粒體呼吸,造成組織損傷;二是NO與超氧化陰離子2-反應(yīng),生成氧化亞硝基陰離子ONOO-,在酸性條件下(如病理?xiàng)l件)迅速分解為OH-和NO2自由基,這兩種自由基具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性,可造成組織細(xì)胞損傷。在OA患者中,受損區(qū)軟骨細(xì)胞的凋亡比例明顯高于未受損區(qū)。Fas表達(dá)的結(jié)果與其相符,OA受損區(qū)的Fas表達(dá)遠(yuǎn)高于未受損區(qū),提示Fas表達(dá)可誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡。除NO途徑和Fas途徑外,還有一些因素可導(dǎo)致軟骨細(xì)胞凋亡、關(guān)節(jié)破壞,如IL-1、IL-8、TNF-、PGE2、Aggreca

41、n G1區(qū)等。 治療方面有了不少新方法目前中西醫(yī)治療OA的藥物較多，西藥治療OA主要有三大類，第一類為快作用藥，即非甾體藥，特點(diǎn)是發(fā)揮作用快，但副作用較大，對(duì)胃腸、肝腎、血小板均有較大影響，OA多為老年人，長(zhǎng)期服用此類藥尤其不能耐受，且部分藥物價(jià)格不菲，而且由于過分的鎮(zhèn)痛，導(dǎo)致病人失去警惕過分運(yùn)動(dòng)，以致出現(xiàn)“消炎痛髖”，從長(zhǎng)期療效來看反而不佳，最新觀點(diǎn)認(rèn)為乙酰氨基酚應(yīng)作為治療OA的首選藥，但尚有一定爭(zhēng)議，且同樣存在上述副作用；第二類為慢作用藥，發(fā)揮作用慢，療效不確切，價(jià)格昂貴，臨床上尚未廣泛運(yùn)用；第三類為軟骨保護(hù)劑，尚未問世。關(guān)節(jié)清理術(shù)、膝關(guān)節(jié)置換術(shù)，適應(yīng)癥較少，費(fèi)用高，創(chuàng)傷大，病人難以接受。

42、中哦藥治療OA的研究取得了可喜的進(jìn)步，但中藥治療仍存在較多共性的問題：多屬臨床經(jīng)驗(yàn)，無對(duì)照組，特別是西藥對(duì)照組觀察，處方不固定。缺乏用客觀的最新的國(guó)際公認(rèn)的、量化的臨床觀察指標(biāo)及療效判斷標(biāo)準(zhǔn)為手段來尋找治療OA的中藥。未針對(duì)OA發(fā)病機(jī)制進(jìn)行臨床及動(dòng)物試驗(yàn)從生化、免疫、病理、細(xì)胞分子水平來探討中藥的藥物作用機(jī)理。缺乏高效的、作用綜合、副作用小的新藥。中醫(yī)認(rèn)為OA屬痹癥中的痹、痛痹、骨痹，認(rèn)為其病因與年老體衰、長(zhǎng)期勞損、外感風(fēng)寒濕邪有關(guān)，明確指出肝腎虧虛、氣血不足、筋骨失養(yǎng)為OA的發(fā)病基礎(chǔ)，而寒濕、痰瘀為病理因素及病理產(chǎn)物。周尊謙等人在傳統(tǒng)中醫(yī)理論基礎(chǔ)上，闡述了膝OA骨內(nèi)高壓血瘀證氧自由基之間的密

43、切關(guān)系；謝林等論述了膝OA與血瘀證之間的內(nèi)在聯(lián)系，旨在為運(yùn)用活血化淤藥治療OA提供理論依據(jù)。治療方面從古到今絕大部分醫(yī)家皆針對(duì)其病因病機(jī)采用益肝腎、強(qiáng)筋骨、補(bǔ)氣血治其本；散寒通絡(luò)、化痰勝濕治其標(biāo)。獨(dú)活寄生湯是用于治療風(fēng)寒濕痹、關(guān)節(jié)疼痛和腦血管后遺癥的傳統(tǒng)固防，具有補(bǔ)肝腎、活血通絡(luò)之功，臨床常見本方加減治療OA，療效比較肯定。朱健兒以本方加味治療262例，總有效率94.7%。單文龍等用本方加減治療骨關(guān)節(jié)炎24例，有效率為87.5%。陸智報(bào)道用本方加減治療104例，總有效率91.3%。 實(shí)驗(yàn)研究方面有了較大的進(jìn)展隨著對(duì)OA發(fā)病機(jī)理的不斷深入認(rèn)識(shí)，對(duì)OA的實(shí)驗(yàn)研究方面也開始了向多層次多角度的方向發(fā)展

44、。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)不再只局限于微循環(huán)和一般抗炎、鎮(zhèn)痛試驗(yàn)，現(xiàn)已使用針對(duì)OA的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，并采用相關(guān)的指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。目前實(shí)驗(yàn)研究?jī)?nèi)容主要有以下幾個(gè)方面，研究最多的是OA的血液流變學(xué)、氧自由基及一氧化氮含量等，這些試驗(yàn)一般均可通過建立骨關(guān)節(jié)炎的模型來完成，也可通過使用其它相似的模型檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)來進(jìn)行，如可建立急性血淤模型來檢查血液流變學(xué)指標(biāo)，使用老齡動(dòng)物通過檢測(cè)體內(nèi)SOD及MDA含量推斷藥物的抗氧自由基的能力等。在NO對(duì)OA影響的實(shí)驗(yàn)中，一般采用硝酸還原酶法來測(cè)定NO含量，運(yùn)用PT-PCR技術(shù)測(cè)定NOS基因表達(dá)。IL-1、IL-6、TNF等細(xì)胞因子、軟骨降解酶尤其是基質(zhì)金屬蛋白酶、誘導(dǎo)關(guān)節(jié)滑膜炎癥的物質(zhì)如纖

45、溶酶原/纖溶酶原激活物和前列腺素PGE2、軟骨細(xì)胞的細(xì)胞凋亡及增殖情況、性激素水平等也越來越多地被作為檢測(cè)指標(biāo)使用到實(shí)驗(yàn)研究中來。1.3 選題的理論和實(shí)踐依據(jù)祖國(guó)醫(yī)學(xué)并無骨關(guān)節(jié)炎的病名，從歷代文獻(xiàn)來看本病應(yīng)歸屬于“骨痹”、“痛痹”范疇。我們認(rèn)為OA病人除了肝腎虧虛，寒濕痹阻外，一般OA病人體重超重較多，也即為痰濕偏盛之體，另外脾虛生濕及寒濕痹阻日久濕聚成痰，痰淤交阻是引起膝關(guān)節(jié)腫脹畸形、活動(dòng)受限的重要因素，所謂頑癥怪病皆質(zhì)之于痰淤?；诂F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)OA發(fā)病機(jī)理的深入研究，我們?cè)谘a(bǔ)益肝腎、活血通絡(luò)基礎(chǔ)上，結(jié)合中藥對(duì)緩解軟骨降解，增加軟骨細(xì)胞功能，抑制滑膜增生及炎癥的研究成果，于1995年即對(duì)備急千

46、金要方中的獨(dú)活寄生湯進(jìn)行化裁，重用活血化淤，加用化痰清熱之品，總結(jié)制定出了高效、藥源廣泛、安全可行的痛痹顆粒，并于1999年采用痛痹顆粒的組方治療膝OA，方中以獨(dú)活為君藥，以祛下焦與筋骨間風(fēng)寒濕邪；威靈仙舒筋通絡(luò)止痹痛；淫羊藿、懷牛膝補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨，通經(jīng)絡(luò)，其中懷牛膝為引經(jīng)藥；當(dāng)歸養(yǎng)血柔肝、舒筋活血；川芎則通達(dá)四肢關(guān)節(jié)，為血中氣藥；虎杖活血清熱解毒，同時(shí)防諸藥辛燥太過。諸藥合用共起補(bǔ)肝腎、祛風(fēng)濕、化瘀痰之功，冀能消炎止痛，保護(hù)軟骨。通過36例的臨床研究、觀察，結(jié)果表明本方療效顯著且副作用小。因此有必要對(duì)痛痹顆粒治療骨性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制尤其是該方對(duì)軟骨細(xì)胞的細(xì)胞凋亡與增殖機(jī)理做進(jìn)一步的研究，冀能

47、證實(shí)痛痹顆粒的臨床療效，明確其作用機(jī)制，并初步探討本病發(fā)病的可能機(jī)理，為新藥問世提供客觀的依據(jù)，所以進(jìn)行設(shè)計(jì)并立題。1.4本研究達(dá)到的科學(xué)技術(shù)水平，預(yù)期社會(huì)效益和應(yīng)用推廣前景繼承和發(fā)揚(yáng)祖國(guó)醫(yī)學(xué)，保持中醫(yī)特色，以臨床療效為前提，以實(shí)驗(yàn)研究為基礎(chǔ)，制造規(guī)范化大鼠的膝OA模型，從發(fā)病機(jī)理探討本藥的作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)采用可靠地國(guó)際公認(rèn)的方法復(fù)制動(dòng)物模型，并采用最新的檢測(cè)指標(biāo)IL-1、TNF、SOD、MDA、NO等，總之本研究基于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)OA發(fā)病機(jī)制的最新研究成果，從生化、免疫等多個(gè)角度多個(gè)層次，系統(tǒng)觀察并進(jìn)行歸納總結(jié)，確保本課題不但可行而且先進(jìn)，冀能填補(bǔ)省內(nèi)外運(yùn)用中藥治療OA的空白，并希望以此為基礎(chǔ)，

48、進(jìn)一步從細(xì)胞水平（包括本藥對(duì)軟骨細(xì)胞及細(xì)胞凋亡與增殖的影響）研究中藥對(duì)OA的長(zhǎng)久作用及影響，從而達(dá)到擠身國(guó)際先進(jìn)水平的目的，讓中藥真正走向世界。目前，中藥治療OA的方法頗多，但大多以臨床療效研究為主，大樣本、規(guī)范化的研究很少，中醫(yī)中藥治療機(jī)理的研究，雖有涉及，但大多分散且存在一定的重復(fù)性，理想的治療藥物尚未問世，具有公認(rèn)療效的小兒遷延性腹瀉臨床治療方案尚未確立，其療效評(píng)價(jià)體系尚需研究確定，尤其是缺少中醫(yī)藥治療學(xué)整體研究思路與方法，使中藥復(fù)方治療OA的療效機(jī)理尚未能全面揭示，影響了該領(lǐng)域研究的深入。而痛痹顆粒是在中醫(yī)理論指導(dǎo)下選用千金要方中獨(dú)活寄生湯進(jìn)行加減所得，并采用可靠的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ图白钚碌膰?guó)際

49、公認(rèn)的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，觀察其對(duì)OA的確切療效及作用機(jī)理，這必將對(duì)OA的中醫(yī)理論產(chǎn)生較大影響，同時(shí)對(duì)臨床治療也起到更好的指導(dǎo)作用，從而產(chǎn)生較好的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。隨著改革開放的形勢(shì)發(fā)展，以及中國(guó)加入WTO與國(guó)際接軌的進(jìn)程的不斷完善，祖國(guó)醫(yī)學(xué)國(guó)際地位不斷的提高，我們將從祖國(guó)醫(yī)學(xué)寶庫(kù)中發(fā)掘出的治療OA的高效藥物與現(xiàn)代新技術(shù)、新方法進(jìn)行研究總結(jié)，從而為人類造福，為振興中醫(yī)事業(yè)做出應(yīng)有的貢獻(xiàn)。2.科研假說或技術(shù)構(gòu)想：主要內(nèi)容、技術(shù)關(guān)鍵目的，技術(shù)特征及創(chuàng)新之處，開發(fā)項(xiàng)目應(yīng)說明開發(fā)規(guī)模。2.1主要內(nèi)容探討OA的病因病機(jī)，提出新見解，發(fā)展中醫(yī)理論。運(yùn)用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，開展實(shí)驗(yàn)研究，從分子生物學(xué)、免疫學(xué)、生理生

50、化學(xué)等多方面來探討“痛痹顆?！敝委熛A的療效機(jī)制及藥理毒理作用。2.2主要技術(shù)關(guān)鍵膝OA模型的復(fù)制目前所使用的OA動(dòng)物模型一般可分為兩大類，其一是誘發(fā)模型，即通過各種操作方法如制動(dòng)、手術(shù)、關(guān)節(jié)內(nèi)注藥、關(guān)節(jié)內(nèi)植入軟骨碎片或微粒等誘導(dǎo)OA產(chǎn)生；另一類為自發(fā)模型，即不用任何外界干預(yù)，動(dòng)物自發(fā)OA，如C57黑鼠等。在選擇動(dòng)物模型時(shí)一般應(yīng)考慮動(dòng)物的種屬（包括其生活習(xí)性、關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)、組織學(xué)及病理學(xué)特征）、不同方法的造模機(jī)制和OA模型的特點(diǎn)，并應(yīng)參照研究目的加以選擇。在誘發(fā)模型中，常用的方法是手術(shù)造成關(guān)節(jié)的應(yīng)力改變及關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入木瓜蛋白酶， 這兩種方法都能復(fù)制出較成功較高的OA模型，且操作較為簡(jiǎn)單。具體的造

51、模機(jī)制在于低應(yīng)力可以造成軟骨厚度減少，SO染色變淡，水分增加，蛋白聚糖聚集度損傷等變化，木瓜蛋白酶作為一種蛋白水解酶會(huì)引起關(guān)節(jié)軟骨的退行性改變。在具體的造模過程中我們選用以上兩種方法來分別復(fù)制動(dòng)物模型。用于動(dòng)物模型的動(dòng)物一般有狗、兔、鼠等，我們選用大鼠做OA模型，因?yàn)樵撃Ｐ完P(guān)節(jié)軟骨退變的組織學(xué)特征與人類相似，且動(dòng)物來源較廣泛，且經(jīng)濟(jì)。關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的獲取和培養(yǎng)基于來源廣泛，操作可行的原則，目前用于體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞一般均為兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞原代培養(yǎng)所得。軟骨需在嚴(yán)格無菌的條件下分離，經(jīng)過一系列的漂洗、消化等工作后獲取軟骨細(xì)胞。目前還沒有專門用于軟骨細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液，國(guó)外采用的培養(yǎng)液種類繁多，有199

52、、1640、F12、改良Eagle等，國(guó)內(nèi)的有199、1640、DMEM（高糖）等，其中加入胎牛血清（占15%），一般以使用DMEM培養(yǎng)液居多。在培養(yǎng)液中還含有一些輔助添加劑，包括25mmol/L Hepes、1mmol/L 丙酮酸鈉、2mmol/L 谷氨酰胺、50umol/L 二硫基乙醇以及10萬(wàn)單位/L的青霉素和10萬(wàn)單位/L的鏈霉素，PH7.4。培養(yǎng)過程中一般使用5%CO237的恒溫培養(yǎng)箱。采用的檢測(cè)手段及指標(biāo)在病理組織形態(tài)學(xué)的檢查中，一般采用以下幾個(gè)觀察指標(biāo)：大體肉眼觀察軟骨及滑膜表面情況；HE染色觀察有關(guān)的形態(tài)變化；Masson三色染色觀察膠原的變化；Sanfranin-O即沙紅O染

53、色用于組織學(xué)評(píng)分，評(píng)分方法按Mankin法；電鏡下觀察軟骨細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)形態(tài)變化及其周圍膠原纖維的變化。在細(xì)胞培養(yǎng)的相關(guān)檢測(cè)中，我們采用MTT法檢測(cè)軟骨細(xì)胞的增殖能力，用全自動(dòng)生化分析儀對(duì)檢測(cè)總蛋白含量，使用細(xì)胞流式儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡的測(cè)定，對(duì)iNOS、NO含量的測(cè)定則使用分型NOS試劑盒和NO試劑盒。2.3目標(biāo)（達(dá)到的主要技術(shù)指標(biāo)或技術(shù)經(jīng)濟(jì)指標(biāo)）、技術(shù)特征及創(chuàng)新之處?，F(xiàn)代科學(xué)技術(shù)與中醫(yī)藥理論相結(jié)合，深入研究中醫(yī)藥治療OA的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供更加科學(xué)有利的客觀依據(jù)，發(fā)揮中醫(yī)藥治療OA的特色和優(yōu)勢(shì)，為臨床常見、嚴(yán)重影響人類健康的OA研究出有效、安全、便于推廣應(yīng)用的中醫(yī)藥治療方法，使能迅速緩解癥狀，

54、大大減輕病人痛苦，降低膝骨關(guān)節(jié)炎的致殘率和復(fù)發(fā)率，且副作用小的簡(jiǎn)、便、廉、驗(yàn)的中藥制劑問世。治療膝OA的新藥生產(chǎn)及對(duì)其在治療中所起作用機(jī)制的深入探討，既符合國(guó)情又能夠走向世界，產(chǎn)生較大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益，這必然形成高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)進(jìn)入高新領(lǐng)域，對(duì)促進(jìn)科技進(jìn)步，發(fā)展中醫(yī)藥，有著積極的作用，同時(shí)這也是中藥現(xiàn)代化研究的發(fā)展方向和新的探索。3.實(shí)驗(yàn)研究方法及技術(shù)路線。3.1對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠骨性關(guān)節(jié)炎的防治作用 OA模型的制備：（1）取SD雄性大鼠50只，體重200220g，固定，常規(guī)備皮消毒，沿髕韌帶內(nèi)側(cè)緣切口，切斷雙后肢內(nèi)側(cè)副韌帶及膝前內(nèi)側(cè)筋膜擴(kuò)張部，并在斷端處修剪去除約2mm，造成雙后肢膝外翻畸形。術(shù)后第二

55、天放造模大鼠于拖箱內(nèi)每天趕其行走30m。（2）取SD雄性大鼠50只，體重200220g，4%木瓜蛋白酶溶液與0.03mol/L半胱氨酸溶液1：1混置0.5小時(shí)后，分別在第1、3、5、7天于實(shí)驗(yàn)大鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入混合液20ul。方法：將造模后的大鼠隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（維骨力組）、治療組，另設(shè)正常對(duì)照組，分別灌胃給藥或蒸餾水，連續(xù)7周。七周后將動(dòng)物麻醉后，立即將大鼠以仰臥位固定，頸總?cè)⊙?，接入試管中?000rmp15min離心獲取含藥血清；切開關(guān)節(jié)囊，進(jìn)行大體觀察后，然后以銳利刀片切取膝關(guān)節(jié)前正中部分的滑膜組織，作HE染色，電鏡下觀察。再用銳利刀片切取股骨內(nèi)倮軟骨使其呈2mm1mm全層軟

56、骨標(biāo)本，2.5%戊二醛溶液固定，電鏡下觀察。所余之股骨內(nèi)倮連同軟骨下骨一并切下，10%福爾馬林溶液固定24小時(shí)以上，分別作HE、沙紅-O及Masson三色染色后光鏡檢查，取樣后即可將動(dòng)物處死。觀察指標(biāo)：大體肉眼觀察軟骨及滑膜表面情況；HE染色觀察有關(guān)的形態(tài)變化；Masson三色染色觀察膠原的變化；Sanfranin-O即沙紅O染色用于組織學(xué)評(píng)分，評(píng)分方法按Mankin法（附評(píng)分等級(jí)表如下）；電鏡下觀察軟骨細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)形態(tài)變化及其周圍膠原纖維的變化。評(píng)分等級(jí).結(jié)構(gòu)正常 0表面結(jié)構(gòu)微小不規(guī)則 1表面結(jié)構(gòu)中等不規(guī)則 2表面結(jié)構(gòu)嚴(yán)重不規(guī)則 3過渡層出現(xiàn)裂隙 4輻射層出現(xiàn)裂隙 5鈣化層出現(xiàn)裂隙 6過渡層消

57、失 7輻射層消失 8鈣化層消失 9結(jié)構(gòu)完全破壞 10.細(xì)胞切線的區(qū)域正常 0細(xì)胞腫脹 1細(xì)胞消失 2過渡和輻射的區(qū)域正常 0少量的細(xì)胞增多 1中等量的細(xì)胞增多 2大量的細(xì)胞增多 3少量的克隆 4中等量的克隆 5大量的克隆 6少量的細(xì)胞減少 7中等量的細(xì)胞減少 8大量的細(xì)胞減少 9細(xì)胞消失 10.變異標(biāo)記 完整 0多層 1模糊 2血管的交叉 3.血管翳形成沒有 0少量 1中等量 2大量 33.2 對(duì)體外培養(yǎng)兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的影響 兔膝軟骨細(xì)胞的原代培養(yǎng) 無菌條件下取兩周齡新西蘭白兔后肢關(guān)節(jié)，用刀片取關(guān)節(jié)表面軟骨，收集在含磷酸緩沖液（PBS）的無菌小培養(yǎng)皿內(nèi)，反復(fù)清洗除去軟骨片表面的血液，以及可能

58、勿帶之滑膜組織。漂洗完畢后，用無菌的眼科小剪刀在培養(yǎng)皿中將其細(xì)切至不大于1mm3。切碎后將其裝入10u試管內(nèi)，按1：10量加入消化酶類進(jìn)行化學(xué)解離。先用0.25%胰酶消化30min，然后去除胰酶，加入0.2%膠原酶消化78小時(shí)后，1500rpm10min離心，棄上清，加入PBS，搖勻在同上離心棄上清，在加PBS反復(fù)三次，最后一次加含15%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打均勻，200目篩網(wǎng)過濾，放入培養(yǎng)瓶中， 5%CO237培養(yǎng)箱培養(yǎng)，定期換液，并觀察照相，長(zhǎng)滿后用0.25%胰酶消化傳代。 對(duì)軟骨細(xì)胞增殖反應(yīng)的作用 將在培養(yǎng)瓶中長(zhǎng)滿的細(xì)胞消化，接入96孔培養(yǎng)板中，100ul/孔， 待細(xì)胞長(zhǎng)

59、成單層后，將舊液棄去，用PBS輕輕蕩洗一遍，然后加入含藥血清，100ul/孔，每組4個(gè)復(fù)孔。二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱孵育72h后，取上清液。每孔加入MTT試劑20ul（5g/L）既無血清培養(yǎng)液100ul，再孵育4h。取上清，每孔加入200ul溶甲瓚液，以主波長(zhǎng)570nm，參比波長(zhǎng)690nm于酶標(biāo)儀上比色，讀取吸光度（A）值。 對(duì)軟骨細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的影響 單層細(xì)胞培養(yǎng)板制作同上，加入含藥血清，每組4個(gè)復(fù)孔，于5%CO237培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，棄去舊液，用0.25%胰酶消化待細(xì)胞有變圓趨勢(shì)即取出消化液，加入PBS，用吸管輕輕吹打，使成單個(gè)細(xì)胞懸液，移入離心管離心，1000rpm，5min，去掉上清液，約留0.5ml細(xì)胞懸液，用振蕩器使細(xì)胞分散，用細(xì)滴管或注射器將細(xì)胞迅速注入4冷乙醇中（乙醇終濃度為70%），用細(xì)胞流式儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞數(shù)目，計(jì)算凋亡百分率。 對(duì)軟骨細(xì)胞蛋白合成和NO含量的影響 同樣將各組含藥血清加入已長(zhǎng)成單層細(xì)胞的培養(yǎng)板內(nèi)，CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后，收集上清液，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)總蛋白含量，用分型NOS試劑盒和NO試劑盒檢測(cè)各組iNOS、NO含量。拆方后對(duì)軟骨細(xì)胞的影響 進(jìn)行拆方實(shí)驗(yàn)，篩選出補(bǔ)肝腎組方、祛風(fēng)濕組方和化瘀痰