IgG的分離與提純硫酸銨沉淀法

1、IgG的分離與提純-硫酸銨沉淀法以抗原免疫動物來制備的抗血清是一個非常復(fù)雜的混合物，包括血清的全部成分。但是同抗原特異性結(jié)合的抗體則主要是血清中的免疫球蛋白組分。通常用于制備酶標(biāo)抗體或熒光抗體的免疫球蛋白必須高度純化并具有特異性，不應(yīng)含有非抗體的血清蛋白。因此，為了濃縮和提高抗體的效價，或為制備免疫球蛋白特異性抗體時，通常也需要分離和純化免疫球蛋白。Y球蛋白（IgG）是血清免疫球蛋白的主要成分，約占全部免疫球蛋白的75%,因此，抗體的分離純化主要是分離純化IgG。純化IgG小量幾十ml的話，用proteinA或proteinG就可以，疏水柱等也可以純化；大量的話，上百ml，可以使用stream

2、lineproteinA。之前根據(jù)載量估計一下需要的柱子體積。實驗室中常用硫酸銨沉淀后過DEAE纖維素柱，比較簡便可獲較純的抗體。下面以此方法為例介紹IgG的分離與提純。材料與試劑配制動物血清硫酸銨飽和溶液硫酸銨800g850gH2O1000ml加熱至絕大部分溶質(zhì)溶解為止，趁熱過濾，置室溫過夜，然后以28%NH4OH調(diào)pH至7.0（不調(diào)pH值也可以）。注：硫酸銨以質(zhì)量優(yōu)者為佳，因次品中含有少量重金屬對蛋白質(zhì)巰基有影響。如次品必須除去重金屬，可在溶液中通入H2S,靜置過夜后濾過，加熱蒸發(fā)H2S即可。0.01Mol/LpH7.4PB液A液：0.10Mol/LNaH2PO4液NaH2PO42H2O1

3、5.60g加H2O至1000.mlB液：0.10Mol/LNa2HPO4液Na2HPO412H2O35.80g加H2O至1000ml取A液19ml，B液81ml加水至1000ml即可。1%BaCl2溶液納氏液HgI115.00gKI80.00g加H2O至500.00ml溶化后過濾，然后再加20%NaOH500.00ml，混合即可。0.50Mol/L的HC1液和0.50Mol/L的NaOH液。洗脫液：0.03Mol/L的NaCl液。透析袋（或玻璃紙）。操作方法取20ml血清，加生理鹽水20ml，再逐滴加入（NH4）2SO4飽和溶液10ml,使成20%（NH4）2SO4溶液，邊加邊攪拌，充分混合后

4、，靜置30min。3000r/min離心20min，棄去沉淀，以除去纖維蛋白。在上清液中再加(NH4)2SO4飽和溶液30ml,使成50%(NH4)2SO4溶液，充分混合,靜置30min。3000r/min離心20min,棄上清。于沉淀中加20ml生理鹽水，使之溶解，再加(NH4)2SO4飽和溶液10ml,使成33%(NH4)2SO4溶液，充分混合后，靜置30min。3000r/min離心20min,棄上清，以除去白蛋白。重復(fù)步驟5，23次。用10ml生理鹽水溶解沉淀，裝入透析袋。透析除鹽，在常水中透析過夜，再在生理鹽水中于4C透析24h，中間換液數(shù)次。以1%BaCl2檢查透析液中的SO42-

5、或以納氏試劑檢查NH4(取34ml透析液，加試劑12滴，出現(xiàn)磚紅色即認(rèn)為有NH4存在)，直至無SO42-或NH4出現(xiàn)為止。也可采用SephadexG25或電透析除鹽。離心去沉淀(去除雜蛋白)，上清液即為粗提IgG(即Y球蛋白，如以36%的飽和硫酸銨沉淀血清的產(chǎn)物即為優(yōu)球蛋白，Euglobin，含Y球蛋白)。過DEAE纖維素層析柱。以0.01Mol/LpH7.4PBS(0.03Mol/LNaCl)洗脫，收集洗脫液。也可采用SephadexG150或G200柱。蛋白質(zhì)及其定量鑒定。IgG的純度鑒定可采用下列方法之一鑒定。區(qū)帶電泳：玻片瓊脂或醋酸纖維膜電泳均可。加樣電泳后，只在Y球蛋白的遷移部位出現(xiàn)一條帶。操作時，同時可用全血清樣品，不同濃度(NH4)2SO4鹽析樣品進行電泳,以資比較。瓊脂雙相雙擴散鑒定：預(yù)先準(zhǔn)備該IgG免疫異種動物所獲的抗IgG血清。將IgG與抗IgG血清進行雙相雙擴散，如IgG提純的話，則在兩樣品孔之間出現(xiàn)一條沉淀線。免疫電泳鑒定：孔內(nèi)加待測樣品，電泳后，在槽內(nèi)加抗IgG血清，瓊脂擴散24h,觀察結(jié)果。如果提取的IgG純的話，則只出現(xiàn)一條弧形的沉淀線，且沉淀線位于Y球蛋白區(qū)。此鑒定必須同時進行全血清及抗血清抗體的免疫電泳，以資比較。圓盤電泳鑒定：用全血清樣品及提純樣品同時進行圓盤電泳。全血清樣品在圓盤電泳上出現(xiàn)數(shù)十條區(qū)帶，而