《植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)》word版

1、植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)01 植物組織中自由水和束縛水含量的測(cè)定植物組織中的水分以自由水和束縛水兩種不同的狀態(tài)存在。自由水與束縛水含量的高低與植物的生長(zhǎng)及抗性有密切關(guān)系。自由水束縛水比值高時(shí)，植物組織或器官的代謝活動(dòng)旺盛，生長(zhǎng)也較快，抗逆性較弱；反之，則生長(zhǎng)較緩慢，但抗性較強(qiáng)。因此，自由水和束縛水的相對(duì)含量可以作為植物組織代謝活動(dòng)及抗逆性強(qiáng)弱的重要指標(biāo)。一、原理:自由水未被細(xì)胞原生質(zhì)膠體顆粒吸附而可以自由移動(dòng)、蒸發(fā)和結(jié)冰，也可以作為溶劑。束縛水則被細(xì)胞原生質(zhì)膠體顆粒吸附而不易移動(dòng)，因而不易被奪取，也不能作為溶劑。基于上述特點(diǎn)以及水分依據(jù)水勢(shì)差而移動(dòng)的原理，將植物組織浸入高濃度（低水勢(shì)）的糖溶液中一定

2、時(shí)間后，自由水可全部擴(kuò)散到糖液中，組織中便留下束縛水。自由水?dāng)U散到糖液后（相當(dāng)于增加了溶液中溶劑）便增加了糖液的重量，同時(shí)降低了糖液的濃度。測(cè)定此降低了的糖液的濃度，再根據(jù)原先已知的高濃度糖液的濃度及重量，可求出濃度降低了的糖液的重量。用濃度降低了的糖液的重量減去原來(lái)高濃度糖液的重量即為植物組織中的自由水的量（即擴(kuò)散到高濃度糖液中的水的量）。最后，用同樣的植物組織的總含水量減去此自由水的含量即是植物組織中束縛水的含量。二、材料、儀器設(shè)備及試劑（一）材料：小白菜、棉花葉片。（二）儀器設(shè)備：1.阿貝折射儀；2.分析天平或電子頂載天平（感量0.1mg）；3.烘箱；4.干燥器；5.稱量瓶；6.打孔器（

3、面積0.5cm2左右）；7.燒杯；8.瓷盤(pán)；9.托盤(pán)天平（1/100g）；10.量筒。（三）試劑：重量百分濃度為6065的蔗糖溶液：用托盤(pán)天平稱取蔗糖6065g，置燒杯中，加蒸餾水4035g，使溶液總重量為100g，溶解后備用。三、實(shí)驗(yàn)步驟1.植物組織中總含水量的測(cè)定（1）取稱量瓶3只（三次重復(fù)，下同），依次編號(hào)并分別準(zhǔn)確稱重。（2）在田間選取生長(zhǎng)一致的待測(cè)的植物數(shù)株，各選部位、長(zhǎng)勢(shì)、葉齡一致的有代表性葉子數(shù)片。用打孔器鉆取小圓片150片（注意避開(kāi)粗大的葉脈），立即裝到上述稱量瓶中（每瓶隨機(jī)裝入50片），蓋緊瓶蓋并精確稱重。（3）將稱量瓶連同小圓片置烘箱中105下烘15min以殺死植物組織細(xì)胞

4、，再于8090下烘至恒重（稱重時(shí)須置干燥器中，待冷卻后稱）。設(shè)稱量瓶重量為W1，稱量瓶與小圓片的重量為W2，稱量瓶與烘干的小圓片的重量為W3（以上重量單位均設(shè)為g，下同）。則植物組織的總含水量（）可按下式計(jì)算植物組織的總含水量（）（W2W3）/（W2W1）100根據(jù)上式可分別求出三次重復(fù)所得到的組織總含水量的值并進(jìn)一步求出其平均值。2.植物組織中自由水含量的測(cè)定（1）另取稱量瓶3只，編號(hào)并分別準(zhǔn)確稱重。（2）用打孔器打取小葉圓片150片（植物材料的選取同上），立即隨機(jī)裝入三個(gè)稱量瓶中（每瓶裝50片），蓋緊瓶蓋并立即稱重。（3）三個(gè)稱量瓶中各加入6065的蔗糖溶液5ml左右，再分別準(zhǔn)確稱重。（4

5、）各瓶于暗處置46h（經(jīng)減壓處理后，只需在暗處置1h），其間不時(shí)輕輕搖動(dòng)。到預(yù)定的時(shí)間后，充分搖動(dòng)溶液。用阿貝折射儀（見(jiàn)附注）分別測(cè)定各瓶糖液濃度，同時(shí)測(cè)定原來(lái)的糖液濃度。設(shè)稱量瓶重量為W1，稱量瓶與小圓片的重量為W2，稱量瓶與小圓片及糖液的重量為W4，糖液原來(lái)的濃度為C1，浸過(guò)植物組織后的糖液的濃度為C2。則植物組織中自由水的含量（）可由下式算出：植物組織中自由水的含量（）（W4W2）（C1C2）/(W2W1)C2100根據(jù)上式同樣可求出三個(gè)不同的測(cè)定值并進(jìn)一步求出其平均值。3.植物組織中束縛水含量的計(jì)算植物組織中束縛水的含量（）組織總含水量（）組織中自由水含量（）實(shí)驗(yàn)02 植物組織水勢(shì)的測(cè)

6、定（小液流法）一、 原理將植物組織分別放在一系列濃度遞增的溶液中，當(dāng)找到某一濃度的溶液與植物組織之間水分保持動(dòng)態(tài)平衡時(shí)，則可認(rèn)為此植物組織的水勢(shì)等于該溶液的水勢(shì)。因溶液的濃度是已知的，可以根據(jù)公式算出其滲透壓，取其負(fù)值，為溶液的滲透勢(shì)（），即代表植物的水勢(shì)（w）（waterpotential）。wPCRT（大氣壓）二、材料、儀器設(shè)備及試劑（一）材料：小白菜或其它作物葉片（二）儀器設(shè)備：1.帶塞青霉素小瓶12個(gè)；2.帶有橡皮管的注射針頭；3.鑷子；4.打孔器5.培養(yǎng)皿。（三）試劑：、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30mol/L蔗糖溶液；2.甲烯藍(lán)粉末。三、實(shí)驗(yàn)步驟（一）取干燥潔凈的

7、青霉素瓶6個(gè)為甲組，各瓶中分別加入0.050.30mol/L蔗糖溶液約4ml（約為青霉素瓶的23處），另取6個(gè)干燥潔凈的青霉素瓶為乙組，各瓶中分別加入0.050.30mol/L蔗糖溶液1ml和微量甲烯藍(lán)粉末著色，上述各瓶加標(biāo)簽注明濃度。（二）取待測(cè)樣品的功能葉數(shù)片，用打孔器打取小圓片約50片，放至培養(yǎng)皿中，混合均勻。用鑷子分別夾入58個(gè)小圓片到盛有不同濃度的甲烯藍(lán)蔗糖溶液的青霉素瓶中（乙組）。蓋上瓶塞，并使葉圓片全部浸沒(méi)于溶液中。放置約3060min，為加速水分平衡，應(yīng)經(jīng)常搖動(dòng)小瓶。（三）經(jīng)一定時(shí)間后，用注射針頭吸取乙組各瓶藍(lán)色糖液少許，將針頭插入對(duì)應(yīng)濃度甲組青霉素瓶溶液中部，小心地放出少量液

8、流，觀察藍(lán)色液流的升降動(dòng)向。（每次測(cè)定均要用待測(cè)濃度的甲烯藍(lán)蔗糖溶液清洗幾次注射針頭）。如此方法檢查各瓶中液流的升降動(dòng)向。若液流上升，說(shuō)明浸過(guò)小圓片的蔗糖溶液濃度變?。粗参锝M織失水）；表明葉片組織的水勢(shì)高于該濃度糖溶液的滲透勢(shì)；如果藍(lán)色液流下降則說(shuō)明葉片組織的水勢(shì)低于該糖溶液的滲透勢(shì)，若藍(lán)色液流靜止不動(dòng)，則說(shuō)明葉片組織的水勢(shì)等于該糖溶液的滲透勢(shì)，此糖溶液的濃度即為葉片組織的等滲濃度四、結(jié)果計(jì)算將求得的等滲濃度值代入如下公式：wCRTi1.0130.1。式中：w植物組織的水勢(shì)（單位：Mpa）溶液的滲透勢(shì)C等滲濃度（mol/L）R氣體常數(shù)（0.008314MPa/L/mol/K）T絕對(duì)溫度i解離

9、系數(shù)（蔗糖1，CaCl22.60）1大氣壓1.0130.1MPa。實(shí)驗(yàn)03 根系活力的測(cè)定（TTC法）植物根系是活躍的吸收器官和合成器官，根的生長(zhǎng)情況和活力水平直接影響地上部的生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)狀況及產(chǎn)量水本。本實(shí)驗(yàn)練習(xí)測(cè)定根系活力的方法，為植物營(yíng)養(yǎng)研究提供依據(jù)。一、 原理氯化三苯基四氮唑（TTC）是標(biāo)準(zhǔn)氧化電位為80mV的氧化還原色素，溶于水中成為無(wú)色溶液，但還原后即生成紅色而不溶于水的三苯甲腙，生成的三苯甲腙比較穩(wěn)定，不會(huì)被空氣中的氧自動(dòng)氧化，所以TTC被廣泛地用作酶試驗(yàn)的氫受體，植物根系中脫氫酶所引起的TTC還原，可因加入琥珀酸，延胡索酸，蘋(píng)果酸得到增強(qiáng)，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC還原

10、量能表示脫氫酶活性并作為根系活力的指標(biāo)。二、材料、設(shè)備儀器及試劑（一）材料：水培或砂培小麥、玉米等植物根系。（二）儀器設(shè)備：1. 分光光度計(jì)；2. 分析天平（感量0.1mg）；3. 電子頂載天平（感量0.1g）；4. 溫箱；5. 研缽；6. 三角瓶50ml；7. 漏斗；8. 量筒100ml；9. 吸量管10ml；10. 刻度試管10ml；11. 試管架；12. 容量瓶10ml；13. 藥勺；14. 石英砂適量；15. 燒杯10ml、1000ml。（三）試劑：1. 乙酸乙酯（分析純）。2. 次硫酸鈉（Na2S2O4），分析純，粉末。3.1TTC溶液準(zhǔn)確稱取TTC1.0g，溶于少量水中。定容到10

11、0ml。用時(shí)稀釋至各需要的濃度。4. 磷酸緩沖液（115mol/L，pH7）。5. 1mol/L硫酸用量筒取比重1.84的濃硫酸55ml，邊攪拌邊加入盛有500ml蒸餾水的燒杯中，冷卻后稀釋至1000ml。6. 0.4mol/L琥珀酸稱取琥珀酸4.72g，溶于水中，定容至100ml即成。三、實(shí)驗(yàn)步驟（1）TTC標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取0.4TTC溶液0.2ml放入10ml量瓶中，加少許Na2S2O4粉搖勻后立即產(chǎn)生紅色的甲月替。再用乙酸乙酯定容至刻度，搖勻。然后分別取此液0.25ml、0.50ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml置10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含甲月替25g、

12、50g、100g、150g、200g的標(biāo)準(zhǔn)比色系列，以空白作參比，在485nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）稱取根尖樣品0.5g，放入10ml燒杯中，加入0.4TTC溶液和磷酸緩沖液的等量混合液10ml，把根充分浸沒(méi)在溶液內(nèi)，在37下暗保溫13h，此后加入1mol/L硫酸2ml，以停止反應(yīng)。（與此同時(shí)做一空白實(shí)驗(yàn)，先加硫酸，再加根樣品，其他操作同上）。（3）把根取出，吸干水分后與乙酸乙酯34ml和少量石英砂一起在研缽內(nèi)磨碎，以提出甲月替。紅色提取液移入試管，并用少量乙酸乙酯把殘?jiān)礈於?、三次，皆移入試管，最后加乙酸乙酯使總量?0ml，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)485nm下比色，以空白試驗(yàn)作參

13、比測(cè)出吸光度，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可求出四氮唑還原量。四、結(jié)果計(jì)算四氮唑還原強(qiáng)度（mg/g(根鮮重)/h）四氮唑還原量（mg）/根重（g）時(shí)間(h)實(shí)驗(yàn)04 用真空滲入法測(cè)定環(huán)境因子對(duì)光合作用的影響綠色植物的葉綠體是光合作用進(jìn)行的場(chǎng)所，葉綠體色素是進(jìn)行光合作用光能吸收、傳遞與轉(zhuǎn)換的主要物質(zhì)，與作物光合作用及產(chǎn)量形成關(guān)系密切。不同作用作物葉綠素的含量與組成有差異，栽培措施、營(yíng)養(yǎng)狀況等條件的改變都會(huì)通過(guò)影響葉綠體色素的狀況而影響光合。了解葉綠體色素的組成與含量，無(wú)論對(duì)于深入理解光合作用的本質(zhì)，還是對(duì)于作物育種與制定合理的栽培措施都具有重要意義。一、原理真空滲入法可使葉肉細(xì)胞間隙充滿水分而下沉。在光合作用

14、過(guò)程中，植物吸收CO2而放出氧氣，由于氧在水中的溶解度很小，所以光合作用的結(jié)果，會(huì)使得下沉的葉片隨其下表面氣體逐漸增加而上浮，根據(jù)上浮所需的時(shí)間的長(zhǎng)短，即能推測(cè)光合作用的強(qiáng)弱。二、材料、儀器設(shè)備及試劑1. 小白菜、萵苣葉片；2. 直徑約1cm的打孔器；3. 注射器；4. 三角瓶；5. 小燒杯；6.溫度計(jì)；7. 冰塊。三、實(shí)驗(yàn)步驟1. 從供試植物上，選取生長(zhǎng)健全、年齡近似、厚薄均勻的成長(zhǎng)葉片數(shù)片，用直徑約1厘米的打孔器打小圓片50片左右，放入注射器中，加水使葉子浸沒(méi)。在排出空氣后用手指堵住前端小孔，同時(shí)把活塞向外抽拉，即可造成減壓而排出組織中的空氣。輕放活塞，水液即進(jìn)入組織。如此反復(fù)抽拉幾次，葉

15、片即可變成半透明狀而下沉，把下沉葉子連水倒入小燒杯中，放于黑暗處。2. 取100ml三角瓶四個(gè)，編號(hào)后，在各瓶中均加入新制冷開(kāi)水40ml，再向2，3，4號(hào)瓶中各加入相當(dāng)于麥粒大小的碳酸氫鈉粉末于水中令充分溶解，在2號(hào)瓶上用較厚白紙遮光，3號(hào)瓶用冰水降溫至10左右，1，2，4號(hào)瓶則用溫水浴保持2025的溫度。每瓶各放入下沉葉片10片，放在日光或較強(qiáng)燈光下進(jìn)行光合作用。3. 記錄各瓶?jī)?nèi)葉片上浮所需平均時(shí)間，或一定時(shí)間內(nèi)上浮葉片數(shù)實(shí)驗(yàn)05 葉綠體色素的提取、分離一、原理葉綠體中含有綠色素（包括葉綠素a和葉綠素b）和黃色素（包括胡蘿卜素和葉黃素）兩大類。它們與類囊體膜相結(jié)合成為色素蛋白復(fù)合體。這兩類色

16、素都不溶于水，而溶于有機(jī)溶劑，故可用乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑提取。提取液可用色譜分析的原理加以分離。因吸附劑對(duì)不同物質(zhì)的吸附力不同，當(dāng)用適當(dāng)?shù)娜軇┩苿?dòng)時(shí)，混合物中各種成分在兩相（固定相和流動(dòng)相）間具有不同的分配系數(shù)，所以移動(dòng)速度不同，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后，可將各種色素分開(kāi)。二、材料、儀器設(shè)備及試劑（一）材料：菠菜、小白菜葉片（二）儀器設(shè)備：1. 研缽；2. 漏斗；3. 三角瓶；4. 剪刀；5. 滴管；6. 培養(yǎng)皿（直徑11cm）；7. 康維皿或平底短玻管；8. 圓形濾紙（直徑11cm）；（三）試劑：1. 95乙醇；2. 石英砂；3. 碳酸鈣粉；4. 推動(dòng)劑：按石油醚；丙酮：苯（10:2:1）比例配制（V

17、V）。三、實(shí)驗(yàn)步驟1. 葉綠體色素的提取（1）取菠菜或其他植物新鮮葉片45片（2g左右），洗凈，擦干，去掉中脈剪碎，放入研缽中。（2）研缽中加23ml95乙醇，研磨至糊狀，再加1015ml95乙醇，提取35min，上清液過(guò)濾于三角瓶中，殘?jiān)?0ml95乙醇沖洗，一同濾于三角瓶中。（3）如無(wú)新鮮葉片，也可用事先制好的葉干粉提取。取新鮮葉片（以菠菜葉最好），先用105殺青，再在80下烘干，研成粉末，密閉貯存。用時(shí)稱葉粉2g放入小燒杯中，加95乙醇2030ml浸提，并隨時(shí)攪動(dòng)。待乙醇呈深綠色時(shí)，濾出浸提液備用。2. 葉綠體色素的分離：（1）取圓形定性濾紙一張（直徑11cm），在其中心戳一圓形小孔（

18、直徑約3mm）另取一張濾紙條（5cm1.5cm），用滴管吸取乙醇葉綠體色素提取液沿紙條的長(zhǎng)度方向涂在紙條的一邊，使色素?cái)U(kuò)散的寬度限制在0.5cm以內(nèi)，風(fēng)干后，再重復(fù)操作數(shù)次，然后沿長(zhǎng)度方向卷成紙捻，使浸過(guò)葉綠體色素溶液的一側(cè)恰在紙捻的一端。（2）將紙捻帶有色素的一端插入圓形濾紙的小孔中，使與濾紙剛剛平齊（勿突出）。（3）在培養(yǎng)皿內(nèi)放一康維皿，在康維皿中央小室中加入適量的推動(dòng)劑，把帶有紙捻的圓形濾紙平放在康維皿上，使紙捻下端浸入推動(dòng)劑中。迅速蓋好培養(yǎng)皿。此時(shí)，推動(dòng)劑借毛細(xì)管引力順紙捻擴(kuò)散至圓形濾紙上，并把葉綠體色素向四周推動(dòng)，不久即可看到各種色素的同心圓環(huán)。如無(wú)康維皿，也可在培養(yǎng)皿中放入一平底短

19、玻管或塑料藥瓶蓋，以盛裝推動(dòng)劑。所用培養(yǎng)皿底、蓋直徑應(yīng)相同，且應(yīng)略小于濾紙直徑，以便將濾紙架在培養(yǎng)皿邊緣上。（4）當(dāng)推動(dòng)劑前沿接近濾紙邊緣時(shí)，取出濾紙，風(fēng)干，即可看到分離的各種色素：葉綠素a為藍(lán)綠色，葉綠素b為黃綠色，葉黃素為鮮黃色，胡蘿卜素為橙黃色。用鉛筆標(biāo)出各種色素的位置和名稱。實(shí)驗(yàn)06 葉綠素含量的測(cè)定一、原理根據(jù)葉綠體色素提取液對(duì)可見(jiàn)光譜的吸收，利用分光光度計(jì)在某一特定波長(zhǎng)測(cè)定其吸光度，即可用公式計(jì)算出提取液中各色素的含量。根據(jù)朗伯比爾定律，某有色溶液的吸光度A與其中溶質(zhì)濃度C和液層厚度L成正比，即ACL式中：比例常數(shù)。當(dāng)溶液濃度以百分濃度為單位，液層厚度為1cm時(shí)，為該物質(zhì)的吸光系數(shù)

20、。各種有色物質(zhì)溶液在不同波長(zhǎng)下的吸光系數(shù)可通過(guò)測(cè)定已知濃度的純物質(zhì)在不同波長(zhǎng)下的吸光度而求得。如果溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)，則此混合液在某一波長(zhǎng)下的總吸光度等于各組分在相應(yīng)波長(zhǎng)下吸光度的總和。這就是吸光度的加和性。今欲測(cè)定葉綠體色素混合提取液中葉綠素a、b和類胡蘿卜素的含量，只需測(cè)定該提取液在三個(gè)特定波長(zhǎng)下的吸光度A，并根據(jù)葉綠素a、b及類胡蘿卜素在該波長(zhǎng)下的吸光系數(shù)即可求出其濃度。在測(cè)定葉綠素a、b時(shí)為了排除類胡蘿卜素的干擾，所用單色光的波長(zhǎng)選擇葉綠素在紅光區(qū)的最大吸收峰。二、材料、儀器設(shè)備及試劑（一）材料：新鮮（或烘干）的植物葉片。（二）儀器設(shè)備：1. 分光光度計(jì)；2. 電子頂載天平（感量0.

21、01g）；3. 研缽；4. 棕色容量瓶；5. 小漏斗；6. 定量濾紙；7. 吸水紙；8. 擦境紙；9. 滴管。（三）試劑：96乙醇（或80丙酮）；石英砂；碳酸鈣粉。三、實(shí)驗(yàn)步驟1. 取新鮮植物葉片（或其它綠色組織）或干材料，擦凈組織表面污物，剪碎（去掉中脈），混勻。2. 稱取剪碎的新鮮樣品0.2g，共3份，分別放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉及23ml95乙醇，研成均漿，再加乙醇10ml，繼續(xù)研磨至組織變白。靜置35min。3. 取濾紙1張，置漏斗中，用乙醇濕潤(rùn)，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，過(guò)濾到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇沖洗研缽、研棒及殘?jiān)鼣?shù)次，最后連同殘?jiān)黄鸬谷肼┒分小?. 用滴管

22、吸取乙醇，將濾紙上的葉綠體色素全部洗入容量瓶中。直至濾紙和殘?jiān)袩o(wú)綠色為止。最后用乙醇定容至25ml，搖勻。5. 把葉綠體色素提取液倒入光徑1cm的比色杯內(nèi)。以95乙醇為空白，在波長(zhǎng)665nm、649nm下測(cè)定吸光度。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算：將測(cè)定得到的吸光值代入下面的式子：Ca=13.95A6656.88A649；Cb=24.96A6497.32A665。據(jù)此即可得到葉綠素a和葉綠素b的濃度（Ca、Cb：mg/L），二者之和為總?cè)~綠素的濃度。最后根據(jù)下式可進(jìn)一步求出植物組織中葉綠素的含量：葉綠素的含量（mg/g）= 葉綠素的濃度提取液體積稀釋倍數(shù)/樣品鮮重（或干重）。實(shí)驗(yàn)07 希爾反應(yīng)的觀察一、原

23、理希爾反應(yīng)（Hillreaction）是綠色植物的離體葉綠體，在光下分解水放出氧氣同時(shí)還原電子受體的反應(yīng)。氧化劑2，6-二氯酚靛酚是一種藍(lán)色染料，接受電子和H后被還成無(wú)色，可以直接觀察顏色的變化也可用分光光度計(jì)還可以對(duì)還原量進(jìn)行精確測(cè)定。二、材料、儀器設(shè)備及試劑 （一）材料：菠菜或其它綠色植物新鮮葉片。 （二）儀器設(shè)備：1. 研缽；2. 石英砂；3. 小試管；4. 試管架；5. 漏斗；6. 紗布；7. 小燒杯；8. 剪刀。（三）試劑：0.12，6-二氯酚靛酚三、實(shí)驗(yàn)步驟 取新鮮的菠菜或其它植物葉片0.5g，剪碎后放入研缽中，研磨成勻漿。加50ml蒸餾水，通過(guò)56層紗布，過(guò)濾到小燒杯中，即得到葉

24、綠體粗懸浮液。取試管兩支。每管中加入葉綠體懸浮液5ml，0.12，6-二氯酚靛酚溶液56滴，搖勻。將其中一管置于直射光下，另一管置于暗處，注意日光下的試管液顏色變化。58min后，將置于暗處的試管取出，比較兩管溶液顏色變化，并解釋原因。實(shí)驗(yàn)08 核酮糖1，5二磷酸羧化酶活性的測(cè)定核酮糖1，5二磷酸羧化酶（ribulose1，5bisphosphatecarboxylase，RuBPCase）是光合作用碳代謝中的重要的調(diào)節(jié)酶，是植物中最豐富的蛋白質(zhì)，主要存在于葉綠體的可溶部分，總量約占葉綠體可溶蛋白5060。本實(shí)驗(yàn)用分光光度法測(cè)定酶的羧化能力。一、原理： 在RuBPCase的催化下，1分子的核酮

25、糖1，5二磷酸（RuBP）與1分子的CO2結(jié)合，產(chǎn)生2分子的3磷酸甘油酸（PGA），PGA可通過(guò)外加的3磷酸甘油酸激酶和甘油醛3磷酸脫氫酶的作用，產(chǎn)生甘油醛3磷酸，并使還原型輔酶I（NADH）氧化.因此，由輔酶I氧化的量就可計(jì)算RuBPCase的活性，由340nm吸光度的變化可計(jì)算還原型輔酶I氧化的量。為了使NADH的氧化與CO2的固定同步，從而需要加入磷酸肌酸（CrP）和磷酸肌酸激酶的ATP再生系統(tǒng)。ADPCrP磷酸肌酸激酶ATPCr二、材料、儀器設(shè)備（一）材料：菠菜葉片、小麥及水稻葉片。（二）儀器設(shè)備：1. 紫外分光光度計(jì)；2. 冷凍離心機(jī)，3. 勻漿器；4. 移液管；5. 秒表。（三）試

26、劑：1. 5mmolLNADH；2. 25mmol/L RuBP；3. 0.2mol/L NaHCO3；4. RuBPCase提取介質(zhì)：40mmol/L（pH7.6）TrisHCl緩沖溶液，內(nèi)含10mmol/L MgCl2、0.25mmol/L EDTA、5mmol/L 谷胱甘肽；5. 反應(yīng)介質(zhì)：100mmol/L TrisHCl緩沖液，內(nèi)含12mmol/L MgCl2和0.4mmol/L EDTA-Na2，pH7.8；6. 160u/ml 磷酸肌酸激酶溶液；7. 160u/ml 甘油醛3磷酸脫氫酶溶液；8. 50mmol/L ATP；9. 50mmol/L 磷酸肌酸；10. 160u/ml

27、磷酸甘油酸激酶溶液；11. 菠菜的RuBPCase提取液。三、實(shí)驗(yàn)步驟1. 酶粗提液的制備取新鮮菠菜葉片10g，洗凈擦干，放勻漿器中，加入10ml預(yù)冷的提取介質(zhì)，高速勻漿30S，停30S，交替進(jìn)行3次；勻漿經(jīng)4層紗布過(guò)濾，濾液于20000g 4下離心15min，棄沉淀；上清液即酶粗提液，置0保存?zhèn)溆谩?. RuBPCase活力測(cè)定按下表配制酶反應(yīng)體系3. 反應(yīng)介質(zhì)4. 將配制好的反應(yīng)體系搖勻，倒入比色杯內(nèi)，以蒸餾水為空白，在紫外分光光度計(jì)上340nm處反應(yīng)體系的吸光度作為零點(diǎn)值。將0.1mlRuBP加于比色杯內(nèi)，并馬上計(jì)時(shí)，每隔30S測(cè)一次吸光度，共測(cè)3min。以零點(diǎn)到第1min內(nèi)吸光度下降的

28、絕對(duì)值計(jì)算酶活力。由于酶提取液中可能存在PGA，會(huì)使酶活力測(cè)定產(chǎn)生誤差，因此除上述測(cè)定外還需做一個(gè)不加RuBP的對(duì)照。對(duì)照的反應(yīng)體系與上述酶反應(yīng)體系完全相同，不同之處只是把酶提取液放在最后加，加后馬上測(cè)定此反應(yīng)體系在340nm處的吸光度，并記錄前1min內(nèi)吸光度的變化量，計(jì)算酶活力時(shí)應(yīng)減去這一變化量。四、結(jié)果計(jì)算RuBPCase的酶活力（mol/ml酶液/min）AN10/(6.222dt)式中：A反應(yīng)最初1min內(nèi)340nm處吸光度變化的絕對(duì)值（減去對(duì)照液最初1min的變化量）；酶活力為每min每ml酶液固定CO2mol數(shù)；N稀釋倍數(shù)6.22每molNADH在340nm處的吸光系數(shù)；2表示每

29、固定1molCO2有2molNADH被氧化；t測(cè)定時(shí)間為1mind比色光程（cm）。實(shí)驗(yàn)09 紅外線CO2氣體分析儀法測(cè)定植物光合速率與呼吸速率紅外線CO2氣體分析儀（IRGA）工作原理：許多由異原子組成的氣體分子對(duì)紅外線都有特異的吸收帶。CO2的紅外吸收帶有四處，其吸收峰分別在2.69m、2.77m、4.26m和14.99m處，其中只有4.26m的吸收帶不與H2O的吸收帶重疊，紅外儀內(nèi)設(shè)置僅讓4.26m紅外光通過(guò)的濾光片，當(dāng)該波長(zhǎng)的紅外光經(jīng)過(guò)含有CO2的氣體時(shí)，能量就因CO2的吸收而降低，降低的多少與CO2的濃度有關(guān)，并服從朗伯比爾定律。分別供給紅外儀含與不含CO2的氣體，紅外儀的檢測(cè)器便可

30、通過(guò)檢測(cè)紅外光能量的變化而輸出反映CO2濃度的電訊號(hào)。.密閉系統(tǒng)斜率法一、原理把IRGA與光合作用同化室連接成密閉的氣路系統(tǒng)。將植物材料密封在透明的同化室內(nèi)，給以適當(dāng)?shù)墓庹?，同化室?nèi)CO2濃度將因植物光合而下降，用IRGA配以適當(dāng)?shù)挠涗泝x可繪出同化室內(nèi)CO2濃度隨光合時(shí)間下降的曲線。在同化室不漏氣、光強(qiáng)度穩(wěn)定、室內(nèi)空氣不斷得到攪動(dòng)的情況下，該曲線將是一條平滑曲線，在曲線的任一點(diǎn)作切線，即可根據(jù)切線的斜率，密閉系統(tǒng)的容積和同化室面積求出在該點(diǎn)的CO2濃度下的光合速率。二、材料、儀器設(shè)備及試劑（一）材料：植物葉片（二）儀器設(shè)備：1. 密閉氣路光合測(cè)定裝置：將QGD07型紅外線CO2氣體分析儀、XW

31、T264型自動(dòng)記錄儀、MXQ型氣體取樣器（圖4）、光合作用同化室、溫度轉(zhuǎn)換器（測(cè)溫探頭可放在同化室內(nèi)，輸出信號(hào)接記錄儀）或半導(dǎo)體點(diǎn)溫計(jì)、橡皮管（內(nèi)徑67mm）、塑料氣球，按圖6所示連接成套，放在一輛醫(yī)用小推車上。2. 量子輻射照度計(jì)；3. 葉面積儀；4. 鐵架臺(tái)（帶試管夾）；5. 050溫度計(jì)（用以校正葉室溫度）；6. 剪刀；7. 帶蓋搪瓷盤(pán)；8. 紗布。（三）試劑：1. 無(wú)水氯化鈣（無(wú)水硫酸鈣）；2. 燒堿石棉（10目）或堿石灰。三、實(shí)驗(yàn)步驟（一）光合速率的測(cè)定1. 安裝儀器（1）將安裝好的密閉氣路光合測(cè)定裝置安放在靠待測(cè)植株12m處，接通紅外儀、錄儀、取樣器、溫度轉(zhuǎn)換器的供電電源。打開(kāi)紅外

32、儀電源開(kāi)關(guān)預(yù)熱12h，紅外儀量程開(kāi)關(guān)置于I檔（0500ppm，1ppm1mg/L）。把紅外儀和溫度轉(zhuǎn)換器的信號(hào)輸出與記錄儀的兩個(gè)信號(hào)輸入接線柱用導(dǎo)線接通。旋轉(zhuǎn)記錄儀第一支筆量程選擇開(kāi)關(guān)于10mV位置（與紅外儀輸出信號(hào)電壓匹配），旋轉(zhuǎn)記錄儀第二支筆量程選擇開(kāi)關(guān)于2V位置（與溫度轉(zhuǎn)換器輸出溫度050信號(hào)電壓匹配）。2. 調(diào)、校儀器（1）紅外儀預(yù)熱完畢后，開(kāi)啟記錄儀電源開(kāi)關(guān)、記錄儀信號(hào)輸入開(kāi)關(guān)和取樣器前面板上的氣泵開(kāi)關(guān)，將取樣器F1旋鈕置“零氣”位置，F(xiàn)2旋鈕置“測(cè)量”位置，開(kāi)始調(diào)整紅外儀的零點(diǎn)（此時(shí)，無(wú)CO2無(wú)水分的零氣循環(huán)經(jīng)過(guò)紅外儀），約12min，調(diào)節(jié)紅外儀的調(diào)零旋鈕使指針?lè)€(wěn)定在“0”點(diǎn)位置，

33、穩(wěn)定后，調(diào)節(jié)記錄儀第一支筆的“調(diào)零”旋鈕使記錄筆到零點(diǎn)位置，紅外儀調(diào)零完畢。（2）拔下紅外儀進(jìn)氣口處的橡皮管，改接CO2標(biāo)準(zhǔn)氣（已知準(zhǔn)確CO2濃度）鋼瓶，出口放空，讓標(biāo)準(zhǔn)氣流經(jīng)紅外儀分析氣室（流量以1Lmin左右為宜）開(kāi)始校正，此時(shí)紅外儀指針應(yīng)指在標(biāo)準(zhǔn)氣濃度所對(duì)應(yīng)的刻度（A值）上，否則可調(diào)節(jié)紅外儀“校正”旋鈕，校正完畢后恢復(fù)原氣路。（3）把玻璃溫度計(jì)感溫端與葉室內(nèi)的溫度轉(zhuǎn)換器探頭放在一起（注意遮蔭），從玻璃溫度計(jì)上讀出溫度，迅速旋轉(zhuǎn)記錄儀第二支筆的調(diào)零旋鈕，使記錄筆置該溫度所對(duì)應(yīng)的位置，校正溫度。3. 測(cè)定（1）旋轉(zhuǎn)取樣器面板上F1旋鈕至“測(cè)量”位置，把植物葉片平展放入同化室后關(guān)閉同化室（注意

34、勿讓操作者的呼吸氣進(jìn)入葉室），開(kāi)啟葉室風(fēng)扇。觀察記錄筆開(kāi)始左移時(shí)，迅速旋轉(zhuǎn)記錄儀“走紙變速”開(kāi)關(guān)至合適檔（以所劃曲線45角為宜），開(kāi)始記錄CO2濃度變化（此時(shí)記錄筆應(yīng)從350ppm左右開(kāi)始記錄）和溫度變化，用鉛筆在記錄紙上記下所測(cè)葉片的編號(hào)、走紙速度，用量子輻射照度計(jì)測(cè)量所測(cè)葉片的受光強(qiáng)度（光子通量密度）并記錄，待記錄筆左移至310ppm左右時(shí)，關(guān)閉走紙開(kāi)關(guān)，停止記錄，第一次測(cè)定完畢。（2）旋轉(zhuǎn)取樣器面板上的F2旋鈕至“補(bǔ)充”位置后，迅速?gòu)?fù)原，讓氣球內(nèi)的高濃度CO2氣進(jìn)入同化室以補(bǔ)充CO2濃度至350ppm左右，觀察記錄筆左移后迅速開(kāi)啟走紙開(kāi)關(guān)，進(jìn)行第二次重復(fù)測(cè)定，測(cè)量光照強(qiáng)度并記錄，當(dāng)記錄筆

35、左移至310ppm左右時(shí)，關(guān)閉走紙開(kāi)關(guān)，第二次重復(fù)測(cè)定完畢。如此再進(jìn)行第三次重復(fù)測(cè)定。（3）三次重復(fù)測(cè)定完畢后，關(guān)閉同化室內(nèi)風(fēng)扇，用記號(hào)筆在葉片的葉室內(nèi)外相交處作標(biāo)記，打開(kāi)葉室，剪下葉片的測(cè)定部分，用紙牌編號(hào)后包在濕紗布內(nèi)并放置于帶蓋搪瓷盤(pán)內(nèi)，待測(cè)葉面積。然后再測(cè)定第二張葉片的光合速率。（4）測(cè)定結(jié)束后，用葉面積儀測(cè)定各葉片面積（如有便攜式葉面積儀，可在測(cè)定光合后，立即測(cè)出葉面積）。 4. 計(jì)算II.密閉系統(tǒng)落差法原理在密閉的系統(tǒng)中，由于同化室中的葉片進(jìn)行光合后，系統(tǒng)中的CO2濃度不斷下降，可用單位時(shí)間內(nèi)同化室中CO2濃度的減少量或CO2濃度減少量所需的時(shí)間，根據(jù)葉片面積、同化室體積，計(jì)算光合

36、速率。二、材料、儀器設(shè)備及試劑材料：待測(cè)植物葉片。（二）儀器設(shè)備：1.GXH305型紅外線CO2氣體分析儀（或QGD07型紅外儀，使用該紅外儀需要配用MXQ氣體取樣器和數(shù)字萬(wàn)用電表）；2.電子秒表；3.同化室（根據(jù)需要自制，內(nèi)裝兩個(gè)小風(fēng)扇和一個(gè)測(cè)定溫度的傳感器）；4.量子輻射照度計(jì)。（三）試劑：燒堿石棉或堿石灰。三、實(shí)驗(yàn)步驟1. 按要求將氣路系統(tǒng)的各部分連接起來(lái)，若使用QGD07型紅外儀，把數(shù)字萬(wàn)用電表上選擇開(kāi)關(guān)旋至200mV電壓檔上，與紅外儀0200mV輸出相連接。2. 接通電源，打開(kāi)紅外儀電源預(yù)熱12h，打開(kāi)氣泵電源，旋轉(zhuǎn)零氣調(diào)節(jié)開(kāi)關(guān)至“零點(diǎn)”上，此時(shí)紅外儀通入無(wú)CO2氣體，調(diào)節(jié)紅外儀“調(diào)

37、零”旋鈕，顯示在“零點(diǎn)”位置，并觀察零點(diǎn)的穩(wěn)定性。3. 將待測(cè)葉片放入同化室，密閉后開(kāi)啟同化室內(nèi)的風(fēng)扇，當(dāng)CO2濃度穩(wěn)定下降時(shí)，開(kāi)始測(cè)定，讀取開(kāi)始的CO2濃度值C1，開(kāi)始計(jì)時(shí)，CO2下降至C2（約下降2030ppm），終止計(jì)時(shí)，記錄C1、C2、t（或確定從測(cè)定開(kāi)始到結(jié)束所需時(shí)間），并同時(shí)用照度計(jì)測(cè)定光照強(qiáng)度，測(cè)定葉室內(nèi)的溫度。一次測(cè)定完成之后，向同化室內(nèi)補(bǔ)充CO2，進(jìn)行重復(fù)測(cè)定（使用MXQ取樣器，補(bǔ)充CO2操作見(jiàn)密閉氣路斜率法）。測(cè)定結(jié)束，用葉面積儀測(cè)量葉片的面積。4. 計(jì)算光合速率PnCV273P/tS22.4(273t)0.1013上式中，Pn光合速率（單位mol/m2/s）；CCO2濃度

38、落差C1C2（ppm）；t測(cè)定時(shí)間（S）；S葉片面積（單位m2）；V同化室（包括氣路系統(tǒng)）體積（單位L）；t同化室的溫度；P大氣壓（單位Mpa）。密閉氣路落差法測(cè)定裝置除了進(jìn)行光合速率測(cè)定外，也能夠進(jìn)行呼吸速率、CO2光合速率曲線的測(cè)定。測(cè)定步驟同光合速率測(cè)定方法。更換群體同化箱，可以進(jìn)行群體光合速率的測(cè)定，測(cè)定步驟略。實(shí)驗(yàn)10 葉綠體光誘導(dǎo)熒光強(qiáng)度的測(cè)定一、原理葉綠體色素在照光時(shí)能輻射出熒光。研究葉綠體色素?zé)晒庑再|(zhì)，有助于了解它的分子激發(fā)態(tài)，分子之間的能量傳遞以及分子在活體內(nèi)的排列。葉綠體光誘導(dǎo)熒光強(qiáng)度的變化（以下簡(jiǎn)稱可變熒光）是由于葉綠體吸收光能后，光能在轉(zhuǎn)化和電子傳遞過(guò)程中受阻，能量不能

39、正常的傳遞下去，而以熒光的形式釋放出來(lái)，使熒光的強(qiáng)度增加。如果這種變化是由光的影響引起的，就叫光誘導(dǎo)的可變熒光。當(dāng)然，也可由其它條件誘導(dǎo)的可變熒光。在室溫條件下，葉綠體在685nm處呈現(xiàn)一個(gè)熒光發(fā)射峰，它是由光系統(tǒng)II發(fā)射出來(lái)的，這部分熒光稱為固定熒光（F0），是物理性的，它與光系統(tǒng)II的原初反應(yīng)和電子傳遞無(wú)關(guān)當(dāng)對(duì)葉綠體進(jìn)行光誘導(dǎo)時(shí)，而發(fā)射出的熒光叫可變熒光（F）。固定熒光和可變熒光之和稱為總熒光（Fmax）。由此可見(jiàn)，可變熒光（F）可以代表光系統(tǒng)II反應(yīng)中心可能利用及轉(zhuǎn)化能量的能力。所以，F(xiàn)在一定程度上代表光系統(tǒng)II反應(yīng)中心的活性。而可變熒光與固定熒光的比值則表示光系統(tǒng)II的光能轉(zhuǎn)換效率。因

40、此，可作為葉綠體光化學(xué)活性的一個(gè)重要指標(biāo)。二、材料、儀器設(shè)備及試劑材料：玉米、菠菜葉片儀器設(shè)備：1.冰箱；2.組織搗碎機(jī)；3.冷凍離心機(jī)；4.玻璃勻漿器；5.動(dòng)力學(xué)分光光度計(jì)。（三）試劑：葉綠體制備緩沖液（簡(jiǎn)稱制備液）。0.05mol/L 磷酸緩沖液，內(nèi)含0.3mol/L 蔗糖和0.1mol/L KCl，pH7.2。三、實(shí)驗(yàn)步驟1. 葉綠體的制備稱取10g棄去大葉脈的新鮮植物葉片，先用自來(lái)水沖洗，再用蒸餾水洗凈，吸干水分后，放在冰箱里冷凍。然后用剪刀剪碎，置于預(yù)冷的組織搗碎機(jī)的玻璃缸內(nèi)，加入50ml制備液，用4層紗布將勻漿過(guò)濾，濾液在0下用1000g離心10min。棄去上清液，在沉淀中加入40

41、ml制備液懸浮，再次用1000g離心10min，取出沉淀，用15ml制備液在玻璃勻漿器內(nèi)勻漿，則得葉綠體懸浮液備用。2. 將儀器調(diào)整好，并把必要的參數(shù)調(diào)到預(yù)定值，使儀器運(yùn)轉(zhuǎn)正常。在光電倍增管前加一個(gè)684nm的濾光片，并把激發(fā)光波長(zhǎng)調(diào)到436nm或480nm。3. 調(diào)整基線將空白緩沖液倒入比色杯中，放入樣品室的樣品架上，打開(kāi)激發(fā)光譜錄基線，如果信號(hào)過(guò)大，說(shuō)明濾光片漏光，需更換。4. 樣品測(cè)定將待測(cè)的葉綠體樣品放入比色杯，并放到樣品室內(nèi)。打開(kāi)激發(fā)光，記錄固定熒光。再打開(kāi)誘導(dǎo)光，記錄最大熒光強(qiáng)度（Fmax）。四、結(jié)果計(jì)算：根據(jù)記錄的圖譜，計(jì)算出固定熒光（F0）和總熒光（Fmax）的數(shù)值，并按下述公

42、式計(jì)算可變熒光和可變熒光產(chǎn)率?？勺儫晒釬FmaxF0；可變熒光率F/F0實(shí)驗(yàn)11 微量定容測(cè)壓法測(cè)定植物的呼吸速率一、原理微量檢壓計(jì)不僅用來(lái)研究有機(jī)體或部分組織的呼吸作用和發(fā)酵作用，而且也可以研究有關(guān)O2與CO2及其它氣體交換的反應(yīng)。如光合作用，酶的活性等。測(cè)壓法的原理是在固定體積并保持恒溫的密閉系統(tǒng)中，氣體產(chǎn)生或消失的總量，可以利用氣體定律計(jì)算求得。二、材料、儀器設(shè)備及試劑（一）材料：待測(cè)的小麥、水稻萌發(fā)種子。（二）儀器設(shè)備：1. 瓦布格呼吸計(jì)（微量呼吸檢質(zhì)計(jì)）；2. 移液管；3. 量筒；4. 小鑷子；5. 稱量瓶。（三）試劑：1. 20KOH；2. 凡士林；3. 橡皮筋數(shù)根；4. 吸水紙；

43、5. Brodie氏溶液：NaCl 23g，牛膽酸鈉5g，溶于500ml水中，另加少許染料（酸性品紅）使溶液染色，并加數(shù)滴濃麝香草酚酒精溶液作為防腐劑。三、實(shí)驗(yàn)步驟 （一）種子吸氧量的測(cè)定1. 取不同處理種子若干（體積約0.5ml左右），稱其鮮重，然后用排水法測(cè)定其體積，先用濾紙將種子外面水分吸干，另取10ml量筒一個(gè)，內(nèi)盛45ml的水，將種子放入量筒內(nèi)觀察水分上升體積，二次水分體積之差即為種子體積，將種子取出，用濾紙吸干附在種子外表的水分，然后將種子放入反應(yīng)瓶的底部，再加0.5ml水2. 在中央小槽內(nèi)加入20KOH0.2ml，為了增大吸收CO2的能力，可用12cm濾紙折疊后插入中央小槽內(nèi)。并

44、在中央小槽口上涂上少量凡士林，防止堿液逸出。3. 側(cè)管的玻璃棒涂以凡士林后塞緊。壓力計(jì)口亦涂上凡士林和反應(yīng)瓶連接，轉(zhuǎn)動(dòng)反應(yīng)瓶，使封口凡士林呈透明為止，然后用橡皮筋將反應(yīng)瓶固定在壓力計(jì)上。4.將壓力計(jì)固定在水槽上，并打開(kāi)活塞，平衡1015min，在此過(guò)程中要檢查反應(yīng)瓶是否漏氣。（二）空白試驗(yàn)（作溫壓計(jì)用）：因壓力計(jì)左管口是與大氣相通，實(shí)驗(yàn)時(shí)室內(nèi)氣壓或水槽溫度微小變化對(duì)讀數(shù)均有影響，為此，必須進(jìn)行校正。校正方法：即反應(yīng)瓶中除不加種子外，其他處理與測(cè)壓計(jì)完全相同。（三）測(cè)定：當(dāng)反應(yīng)瓶?jī)?nèi)溫度與水槽溫度平衡后，將壓力計(jì)上的活塞關(guān)閉。開(kāi)始振蕩。并記錄開(kāi)始時(shí)間，每隔15min記錄測(cè)壓計(jì)及溫壓計(jì)左管液面高度，

45、讀數(shù)時(shí)關(guān)閉振蕩器，并將壓力計(jì)的右管液面調(diào)至150mm處，再記錄左管液面高度，共計(jì)四次（共1h，讀數(shù)時(shí)不能將活塞打開(kāi)！）將結(jié)果按下表記錄。四、結(jié)果計(jì)算（一）求K值（二）根據(jù)實(shí)際壓力差值（h1.求氧的吸收量（l）hK；計(jì)算呼吸速率（耗O2）呼吸速率（l/g/h）hK/樣品重(g)時(shí)間(h)實(shí)驗(yàn)12 小籃子法（廣口瓶法）測(cè)定植物的呼吸速率一、原理植物進(jìn)行呼吸時(shí)放出CO2，計(jì)算一定的植物樣品在單位時(shí)間內(nèi)放出CO2的數(shù)量，即為該樣品的呼吸速率。呼吸放出的CO2可用氫氧化鋇溶液吸收，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用已知濃度的草酸溶液滴定剩余的堿液，從空白和樣品二者消耗草酸溶液之差即可計(jì)算出呼吸過(guò)程中釋放的CO2的量。二、材料

46、、設(shè)備儀器及試劑（一）材料：發(fā)芽的小麥種子或其它萌發(fā)的種子。（二）儀器設(shè)備：1.呼吸測(cè)定裝置；2.天平；3.鐘表；4.酸式及堿式滴定管；5.溫度計(jì)（三）試劑：1. 0.05mol/L 左右的Ba（OH）2：稱取Ba（OH）2 8.6g溶于1000ml蒸餾水中；2. 144mol/L 草酸溶液：準(zhǔn)確稱取重結(jié)晶的H2C2O4.2H2O 2.8651g溶于蒸餾水中定容至1000ml，每ml相當(dāng)于1mgCO2；3. 酚酞指示劑：1g酚酞溶于100ml 95乙醇中，貯于滴瓶中。三、實(shí)驗(yàn)步驟1. 取500ml廣口瓶一個(gè)，瓶口瓶用打有三孔的橡皮塞塞緊，一孔插一盛堿石灰的干燥管，使呼吸過(guò)程中能進(jìn)入無(wú)CO2的空

47、氣，一孔插溫度計(jì)，另一孔直徑約1cm，供滴定用，平時(shí)用一小橡皮塞塞緊，瓶塞下面掛一鐵絲紗小籃，以便裝植物樣品，整個(gè)裝置即謂“廣口瓶呼吸測(cè)定裝置”。 2. 在瓶口準(zhǔn)確加入約0.05mol/L 的Ba(OH)2溶液20ml，立即塞緊橡皮塞（不帶小籃），充分搖動(dòng)廣口瓶2min，待瓶?jī)?nèi)CO2全部被吸收后，拔出小橡皮管塞，加入酚酞指示劑2滴，把滴定管插入孔中，用標(biāo)準(zhǔn)草酸溶液進(jìn)行空白滴定，直到紅色剛剛消失為止。3. 倒出廢液，用無(wú)CO2的蒸餾水（煮沸過(guò)的）洗凈后，重加上述Ba（OH）2溶液20ml，同時(shí)稱取植物樣品510g，裝入小籃子中，掛于橡皮塞下，塞緊瓶塞，開(kāi)始記錄時(shí)間，經(jīng)過(guò)2030min，其間輕輕搖

48、動(dòng)數(shù)次，使溶液表面的BaCO3薄膜破壞，有利于充分吸收CO2。然后用草酸滴定，方法如前。（注意：防止口中呼出的氣體浸入瓶?jī)?nèi)?。┧?、結(jié)果計(jì)算呼吸速率（mgCO2/g(FW)/h）（AB）1/(Wt)上式中，A：空白滴定用去的草酸量（ml）；B：樣品滴定用去的草酸量（ml）；W：樣品鮮重（g）；t：測(cè)定時(shí)間（h）。每毫升144mol/L 的草酸相當(dāng)于1mgCO2。實(shí)驗(yàn)13 過(guò)氧化氫酶活性測(cè)定（高錳酸鉀滴定法）過(guò)氧化氫酶普遍存在于植物的所有組織中，其活性與植物的代謝強(qiáng)度及抗寒、抗病能力有一定關(guān)系，故常加以測(cè)定。一、原理過(guò)氧化氫酶（catalase）屬于血紅蛋白酶，含有鐵，它能催化過(guò)氧化氫分解為水和分

49、子氧，在此過(guò)程中起傳遞電子的作用，過(guò)氧化氫則既是氧化劑又是還原劑。可根據(jù)H2O2的消耗量或O2的生成量測(cè)定該酶活力大小。在反應(yīng)系統(tǒng)中加入一定量（反應(yīng)過(guò)量）的過(guò)氧化氫溶液，經(jīng)酶促反應(yīng)后，用標(biāo)準(zhǔn)高錳酸鉀溶液（在酸性條件下）滴定多余的過(guò)氧化氫。即可求出消耗的H2O2的量。二、材料、儀器設(shè)備及試劑（一）材料：小麥葉片（二）儀器設(shè)備：1. 研缽；2. 三角瓶；3. 酸式滴定管；4. 恒溫水浴；5. 容量瓶。（三）試劑：1. 10%H2SO4；2. 0.2 mol/L pH7.8磷酸緩沖液；3. 0.1mol/L 高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)液稱：取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷卻蒸餾水配制成1000ml，

50、再用0.1mol/L 草酸溶液標(biāo)定；4. 0.1mol/L H2O2市售30%H2O2大約等于17.6mol/L，取30%H2O2溶液5.68ml，稀釋至1000ml，用標(biāo)準(zhǔn)0.1mol/L KMnO4溶液（在酸性條件下）進(jìn)行標(biāo)定；5. 0.1mol/L 草酸：稱取優(yōu)級(jí)純H2C2O4.2H2O 12.607g，用蒸餾水溶解后，定容至1000ml。四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）酶液提?。喝⌒←溔~片2.5g加入pH7.8的磷酸緩沖溶液少量，研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶中，用該緩沖液沖洗研缽，并將沖洗液轉(zhuǎn)至容量瓶中，用同一緩沖液定容，4000rpm離心15min，上清液即為過(guò)氧化氫酶的粗提液。（二）取50m

51、l三角瓶4個(gè)（兩個(gè)測(cè)定，另兩個(gè)為對(duì)照），測(cè)定瓶加入酶液2.5ml，對(duì)照加煮死酶液2.5ml，再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2，同時(shí)計(jì)時(shí)，于30恒溫水浴中保溫10min，立即加入10%H2SO42.5ml。用0.1mol/L KMnO4標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，至出現(xiàn)粉紅色（在30min內(nèi)不消失）為終點(diǎn)。五、結(jié)果酶活性用每g鮮重樣品1min內(nèi)分解H2O2的mg數(shù)表示：過(guò)氧化氫酶活性（H2O2mg/g/min）（AB）VT/(WVS1.7t)式中：A對(duì)照KMnO4滴定ml數(shù)；B酶反應(yīng)后KMnO44相當(dāng)于1.7mgH2O2。實(shí)驗(yàn)14 氮藍(lán)四唑（NBT）法測(cè)定超氧物歧化酶（SOD）活力一、原理超氧物歧

52、化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于動(dòng)、植物體內(nèi)，是一種清除超氧陰離子自由基的酶。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)超氧物歧化酶抑制氮藍(lán)四唑（NBT）在光下的還原作用來(lái)確定酶活性大小。在有氧化物質(zhì)存在下，核黃素可被光還原，被還原的核黃素在有氧條件下極易再氧化而產(chǎn)生O2，可將氮藍(lán)四唑還原為藍(lán)色的甲腙，后者在560nm處有最大吸收。而SOD可清除O2，從而抑制了甲腙的形成。于是光還原反應(yīng)后，反應(yīng)液藍(lán)色愈深，說(shuō)明酶活性愈低，反之酶活性愈高。據(jù)此可以計(jì)算出酶活性大小。二、材料、儀器設(shè)備及試劑（一）材料；水稻或小麥葉片（二）儀器設(shè)備：1.高速臺(tái)式離心機(jī)；2.分光光度計(jì)；3.微量進(jìn)樣器；4.熒光燈（反

53、應(yīng)試管處照度為4000Lx）；5.試管或指形管數(shù)支。（三）試劑1. 0.05mol/L 磷酸緩沖液（pH7.8）；2. 130mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液：稱1.9399gMet用磷酸緩沖液定容至100ml；3.750mol/L 氮藍(lán)四唑溶液：稱取0.06133gNBT用磷酸緩沖液定容至100ml，避光保存；4. 100mol/L EDTANa2溶液：稱取0.03721gEDTANa2用磷酸緩沖液定容至1000ml；5. 20mol/L 核黃素溶液：稱取0.0753g核黃素用蒸餾水定容至1000ml避光保存。三、實(shí)驗(yàn)步驟1. 酶液提取取一定部位的植物葉片（視需要定，去葉脈）0.5g于預(yù)

54、冷的研缽中，1ml預(yù)冷的磷酸緩沖液在冰浴上研磨成漿，加緩沖液使終體積為5ml。取1.52ml于1000rpm下離心20min，上清液即為SOD粗提液。2. 顯色反應(yīng)取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支為測(cè)定管，另2支為對(duì)照管，按下列加入各溶液：試劑（酶）用量（ml）終濃度（比色時(shí)）0.05mol/L 磷酸緩沖液1.5130mmol/L Met溶液0.313mmol/L 750mol/L NBT溶液0.375mol/L 100mol/L EDTANa2液0.310mol/L 20mol/L 核黃素0.320mol/L 酶液0.052支對(duì)照管以緩沖液代替酶液蒸餾水0.25總體積3.0混勻后將1

55、支對(duì)照管置暗處，其它各管于4000Lx日光下反應(yīng)20min（要求各管受光情況一致，溫度高時(shí)間縮短，低時(shí)延長(zhǎng)）。3. SOD活性測(cè)定與計(jì)算至反應(yīng)結(jié)束后，以不照光的對(duì)照管做空白，分別測(cè)定其它各管的吸光度。四、結(jié)果計(jì)算已知SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50為一個(gè)酶活性單位表示，按下式計(jì)算SOD活性。SOD總活性(AckAE)V/(Ack0.5WVt)上式中，SOD比活力SOD總活性蛋白質(zhì)含量式中SOD總活性以每克鮮重酶單位表示；比活力單位以酶單位mg蛋白表示Ack照光對(duì)照管的吸光度AE樣品管的吸光度V樣品液總體積（ml）Vt測(cè)定時(shí)樣品用量（ml）W樣鮮重（g）蛋白質(zhì)含量單位為：mg蛋白g鮮重。

56、實(shí)驗(yàn)15 淀粉酶活性的測(cè)定一、原理淀粉酶（amylase）包括幾種催化特點(diǎn)不同的成員，其中淀粉酶隨機(jī)地作用于淀粉的非還原端，生成麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖，同時(shí)使淀粉漿的粘度下降，因此又稱為液化酶；淀粉酶每次從淀粉的非還端切下一分子麥芽糖，又被稱為糖化酶；葡萄糖淀粉酶則從淀粉的非還原端每次切下一個(gè)葡萄糖。淀粉酶產(chǎn)生的這些還原糖能使3，5二硝基水楊酸還原，生成棕紅色的3氨基5硝基水楊酸。淀粉酶活力的大小與產(chǎn)生的還原糖的量成正比?？梢杂名溠刻侵谱鳂?biāo)準(zhǔn)曲線，用比色法測(cè)定淀粉生成的還原糖的量，以單位重量樣品在一定時(shí)間內(nèi)生成的還原糖的量表示酶活力。幾乎所有植物中都存在有淀粉酶，特別是萌發(fā)后的禾谷類種

57、子淀粉酶活性最強(qiáng)，主要是和淀粉酶。淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速鈍化；而淀粉酶不耐熱，在7015min則被鈍化。根據(jù)它們的這種特性，在測(cè)定時(shí)鈍化其中之一，就可測(cè)出另一個(gè)的活力。本實(shí)驗(yàn)采用加熱鈍化淀粉酶測(cè)出淀粉酶的活力，再與非鈍化條件下測(cè)定的總活力（）比較，求出淀粉酶的活力。二、材料、儀器設(shè)備及試劑（一）材料：萌發(fā)的小麥種子（芽長(zhǎng)約1cm）。（二）儀器設(shè)備：1. 分光光度計(jì)；2. 離心機(jī)；3. 恒溫水浴（37，70，100）；4.具塞刻度試管；5. 刻度吸管；6. 容量瓶。（三）試劑（均為分析純）：1. 標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖溶液（1mg/ml）：精確稱取100mg麥芽糖，用蒸餾水溶解并定容至100ml

58、；2. 3，5二硝基水楊酸試劑：精確稱取1g3，5二硝基水楊酸，溶于20ml2mol/L NaOH溶液中，加入50ml蒸餾水，再加入30g酒石酸鉀鈉，待溶解后用蒸餾水定容至100ml。蓋緊瓶塞，勿使CO2進(jìn)入。若溶液混濁可過(guò)濾后使用；3.01mol/L pH5.6的檸檬酸緩沖液：A液（0.1mol/L 檸檬酸）：稱取C6H8O7.H2O 21.01g，用蒸餾水溶解并定容至1L；B液（0.1mol/L 檸檬酸鈉）：稱取Na3C6H5O7.2H2O 29.41g，用蒸餾水溶解并定容至1L。取A液55ml與B液145ml混勻，即為0.1mol/L pH5.6的檸檬酸緩沖液；4.1淀粉溶液：稱取1g淀

59、粉溶于100ml0.1mol/L pH5.6的檸檬酸緩沖液中。三、實(shí)驗(yàn)步驟（一）麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取7支干凈的具塞刻度試管，編號(hào)，按表（詳教材）加入試劑。搖勻，置沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷卻，加蒸餾水定容至20ml。以1號(hào)管作為空白調(diào)零點(diǎn)，在540nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定。以麥芽糖含量為橫座標(biāo)，吸光度值為縱座標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.（二）酶液制備：稱取1g萌發(fā)3天的小麥種子（芽長(zhǎng)約1cm），置于研缽中，加少量石英砂和2ml蒸餾水，研磨成勻漿。將勻漿倒入離心管中，用6ml蒸餾水分次將殘?jiān)慈腚x心管。提取液在室溫下放置提取1520min，每隔數(shù)min攪動(dòng)1次，使其充分提取。然后在3000rpm下離

60、心10min，將上清液倒入100ml容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，即為淀粉酶原液。吸取上述淀粉酶原液10ml，放入50ml容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，即為淀粉酶稀釋液。（三）酶活力的測(cè)定：取6支干凈的具塞刻度試管，編號(hào)，按表（詳教材）進(jìn)行操作。 （四）結(jié)果計(jì)算：淀粉酶活力=CVT/(WVsT)(mg/g/min)。式中，C為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的麥芽糖含量（mg）；VT為淀粉酶原液總體積（ml）；Vs為反應(yīng)所用淀粉酶原液體積（ml）；W為樣品重量（g）；t為反應(yīng)時(shí)間（min）。實(shí)驗(yàn)16 植物過(guò)氧化物酶同工酶測(cè)定（凝膠園盤(pán)電泳）凡能催化同一種化學(xué)反應(yīng)，但其分子結(jié)構(gòu)和帶電性質(zhì)不同的一組酶