醫(yī)學課件結核病實驗室檢查的臨床意義

1、主要內(nèi)容 一、結核桿菌的病原學基礎 二、結合分支桿菌全球的流行情況三、結核桿菌的實驗室檢測方法及臨床應用一、結核病的病原學基礎結核桿菌屬：一類細長略帶彎曲，有時呈分枝狀的桿菌，本屬細菌多具有抗酸性，又稱抗酸桿菌（acid-fast bacillus），細菌體內(nèi)含有分枝菌酸，細胞壁含有大量脂類，這與分枝桿菌的染色性、抵抗力和致病性等密切相關。本屬細菌已經(jīng)被鑒定的有70多種，可分為三大類：結核分枝桿菌、非典型分枝桿菌、麻風分枝桿菌；按生長速度可分為三類，即緩慢生長菌、迅速生長菌和不能培養(yǎng)菌三種類型結核分枝桿菌群結核分枝桿菌，是人和動物結核病的病原體，包括人結核分枝桿菌（Mycobacterium

2、tuberculosis）、牛分支桿菌（M.bovis）、非洲分支桿菌（M.africanum）和田鼠分枝桿菌（M.microti），前三種對人類治病，其中人型結核分枝桿菌感染發(fā)病率最高。結核分枝桿菌屬于緩慢生長分支桿菌及時準確的診斷結核病，有效地控制傳染源，對預防結核病至關重要。結核病實驗室檢查細菌學檢查免疫學檢查分子生物學檢查涂片染色鏡檢分枝桿菌分離培養(yǎng)分支桿菌藥敏試驗分枝桿菌菌種鑒定最原始最基礎的檢測方法涂片染色鏡檢抗酸染色的原理分枝桿菌的細胞壁內(nèi)含有大量的脂質(zhì)。包圍在肽聚糖的外面，所以分支桿菌一般不易著色，需要經(jīng)過加熱或是延長染色時間來促使其著色。但分支桿菌中的分支菌酸與染料結合后，就

3、很難被酸性脫色劑脫色，故名抗酸染色。涂片染色鏡檢臨床價值 適用于多種標本； 操作簡便，價格低廉。涂片鏡檢的臨床應用 一、確診涂陽結核病及開放性結核2份痰標本直接涂片抗酸桿菌鏡檢陽性；1份痰標本直接涂片抗酸桿菌鏡檢陽性+影像學檢查符合活動性肺結核表現(xiàn)。涂片鏡檢的臨床應用二、肺結核治療評估的主要依據(jù)之一治愈：涂陽肺結核患者完成規(guī)定療程，連續(xù)2次涂片結果陰性，其中1次是治療末的涂片。治療失敗：新涂陽患者治療第5個月末或療程結束時，痰涂片檢查陽性，涂陰肺結核患者治療過程中任何1次痰菌檢查陽性，均為治療失敗。缺點：不能區(qū)別結核分枝桿菌和非結核分支桿菌不能區(qū)別死菌跟活菌。 結核桿菌暴露于異煙肼時，某些條件

4、會失去抗酸性，出現(xiàn)假陰性。 檢測靈敏度較低（104-105 個細菌/毫升）。分枝桿菌分離培養(yǎng) 結核菌培養(yǎng)仍是目前診斷結核病的金標準尤其是藥敏試驗結果在指導臨床用藥及耐藥性檢測等方面具有重要作用, 是鑒定是否為活菌的可靠方法傳統(tǒng)的固態(tài)培養(yǎng)法 需要46周才能檢測到結核菌的生長而且陽性率也只有30-40 ；特異性差各種分枝桿菌均可生長。要確定是否為結核菌需結合分枝桿菌菌種鑒定和藥物敏感性試驗?？焖倥囵B(yǎng)法:檢測細菌生長過程中代謝產(chǎn)生的CO2或消耗的O2，顯微鏡直接觀察、變色液體培養(yǎng)基等?？焖倥囵B(yǎng)法陽性的報告時間大概是13周左右，比傳統(tǒng)的固態(tài)培養(yǎng)法快，但是儀器價格太昂貴。確診結核病 1份痰標本直接涂片抗

5、酸桿菌鏡檢陽性+1份痰標本結核分枝桿菌培養(yǎng)陽性即可確診。 痰涂片陰性，肺部影像學檢查符合活動性肺結核影像學表現(xiàn)+1份痰標本結核分枝桿菌培養(yǎng)陽性結核菌培養(yǎng)臨床價值用于耐多藥結核療效判定治愈：（1）患者完成療程，且在療程的后12個月，至少最后5次痰培養(yǎng)（每次間隔至少30天）連續(xù)陰性。 （2）如出現(xiàn)1次痰培養(yǎng)陽性，其后痰培養(yǎng)（間隔至少30天）最少連續(xù)3次陰性。失?。?治療的最后12個月，5次痰培養(yǎng)中有兩次或兩次以上陽性；或者在最后的3次，培養(yǎng)中有任何一次是陽性。分離培養(yǎng)的優(yōu)點敏感性較直接涂片法高，理論上10-100條菌/毫升可檢出陽性；特異性較直接涂片法高，可以從菌落生長速度、色素產(chǎn)生初步判斷非結核

6、分枝桿菌；分離出具有活力的純培養(yǎng)物，為進一步藥敏試驗提供基礎。分離培養(yǎng)的缺點需時長，根據(jù)接種量的大小，一般2-8周才能得到肉眼可見菌落。結果受標本保存運送時間、培養(yǎng)基成分和質(zhì)量、前處理方法等影響， 操作較直接涂片法復雜，需經(jīng)嚴格培訓 ，對實驗室要求也是較高。 成本是直接涂片法的7-8倍。結核病實驗室檢查細菌學檢查免疫學檢查分子生物學檢查涂片染色鏡檢分枝桿菌分離培養(yǎng)分支桿菌藥敏試驗分枝桿菌菌種鑒定體液免疫學檢查細胞免疫學檢查體液免疫學檢查（血清學檢查）結核抗體測定結核抗原測定循環(huán)免疫復合物測定 血清學診斷血清學診斷技術優(yōu)勢：是一種對疾病進行早期診斷的理想方法。無需活細胞培養(yǎng)和特殊儀器設備操作簡便

7、結果顯示快速目前用于血清學診斷的主要方法:酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELlSA)斑點金免疫滲濾法(DIGFA)免疫印跡法(Western Blotting)等等2011年WHO正式公告：由于目前的商業(yè)血清學試劑在結核檢測中存在較大差異，且檢測結果很高比例的假陽性和假陰性，因此不建議使用血清學方法作為結核桿菌的診斷實驗1 。1WHO Commercial Serodiagnostic Tests for Diagnosis of Tuberculosis. /publications/2011/9789241502054_eng.pdf血清學檢測的評價原因：由于所用的測定方法、使用的試劑種類或抗原、抗體

8、的不同等，導致測定結果差異較大，并且缺乏可比性。WHO對來自不同國家的19種試劑盒產(chǎn)品進行評估，結果表明：與痰培養(yǎng)相比，這些試劑盒檢測的靈敏度為1%60%，特異度為5399% 1 。結核病細胞免疫學檢查結核菌素皮膚實驗蛋白水平分子診斷:-干擾素釋放實驗（IGRA)遲發(fā)型細胞超敏反應1）方法：1:2000 OT或PPD液0.1毫升(5單位)，左前臂屈側中部皮內(nèi)注射，4872h測量皮膚硬結的直徑。結核菌素實驗（PPD試驗）2）判斷標準：陰性4mm弱陽性5-9mm陽性10-19mm，強陽性20mm或局部出現(xiàn)水泡與壞死3)結核菌素試驗的意義陰性：無結核菌感染；不能排除結核感染。陽性：曾有結核感染，并不

9、一定現(xiàn)在患病。強陽性：活動性結核病可能 A、變態(tài)反應尚未建立；B、免疫抑制如應用皮質(zhì)激素或營養(yǎng)不良等 PPD所含抗原為致病性分枝桿菌、環(huán)境分枝桿菌及卡介苗菌株所共有，其結果受到卡介苗接種及其他分枝桿菌感染的影響，特異性較差。 當出現(xiàn)免疫功能低下時可出現(xiàn)假陰性結果，敏感性低。 免疫力正常的陰性有一定意義。強陽性有一定意義。有結核變態(tài)反應、淋巴結核強陽性多。 經(jīng)濟、簡便，可以用于流行病學大規(guī)模的篩查和普查，但存在著明顯的缺陷。PPD試驗臨床價值結核感染者體內(nèi)存在特異的效應T淋巴細胞，效應T淋巴細胞再次受到結核抗原刺激時會分泌多種細胞因子（IFN-）。因此，檢測效應T淋巴細胞可用于結核病或結核潛伏感

10、染者的診斷。由于效應T細胞存活時間很短，而且具有特異性，因此可以作為機體是否正處于被感染的指標，無論是否有臨床癥狀?；贗GRA原理的產(chǎn)品目前已被美國、加拿大、英國、德國、意大利、瑞士、法國、荷蘭、日本等二十余個國家寫入本國的結核診療指南中。目前應用的進口IGRA主要有兩種商品化的試劑：1）澳大利亞Cellestis公司的 Quanti FERON-TB GOLD In Tube（QFT-GIT）2）英國Oxford Immunotec公司的T-SPOT.TB蛋白水平分子診斷:-干擾素釋放實驗（IGRA)T-SPOT.TB原理T-SPOT.TB是以擁有專利的特異抗原（ESAT-6/CFP-10

11、），通過酶聯(lián)免疫斑點技術（ELISPOT）檢測受試者體內(nèi)是否存在結核效應T淋巴細胞，從而判斷目前該受試者是否感染結核桿菌（現(xiàn)癥感染）的新方法。結核桿菌特異抗原：早期分泌抗原靶6（Early Secreted Antigenic Rarget 6，ESAT-6）培養(yǎng)濾液蛋白10（Culture Filtrate Protein 10，CFP 10）T-SPOT.TB臨床性能指標 特異性只針對結核分枝桿菌復合群敏感，與絕大多數(shù)環(huán)境分枝桿菌和卡介苗（BCG）無交叉反應 美國FDA數(shù)據(jù)：特異性97.1%(297/306) 國內(nèi)臨床數(shù)據(jù)：特異性94.1%(478/508) 靈敏度基本不受免疫力低下/受抑

12、制影響，在肺外結核患者中有很高的檢出率 美國FDA數(shù)據(jù)：靈敏度95.6%(175/183) 國內(nèi)臨床數(shù)據(jù)：靈敏度95.3%(624/655)實驗結果的解釋 陰性結果提示患者體內(nèi)不存在針對結核桿菌特異的效應T細胞。假陰性結果：感染階段不同；少數(shù)免疫系統(tǒng)功能不全患者 陽性結果提示患者體內(nèi)存在針對結核桿菌特異的效應T細胞，患者存在結核感染。但是否是活動性結核病，需結合臨床癥狀和其它檢測指標綜合判斷。假陽性結果： 4種環(huán)境分枝桿菌感染時：M.kansasii（堪薩斯）、M.szulgai（蘇氏）、M.marinum（海）、M.gordonae（戈登）方法學的優(yōu)點檢測特異性的提高幫助臨床區(qū)分卡介苗接種和

13、環(huán)境分枝桿菌感染引起的“假陽性”，避免了臨床的無效用藥檢測靈敏度的提高有利于臨床對結核病的早發(fā)現(xiàn)、早治療，避免了疾病的傳播與擴散快速48小時出結果方法學的局限不能區(qū)分活動性TB與潛伏感染不能夠提示臨床患者的病變部位，需要結合臨床的判斷目前還不能夠根據(jù)斑點數(shù)量的多少來判斷患者是活動性結核病或是潛伏感染者不適合用于結核病患者治療的療效監(jiān)測檢測收費高（600-700元/次）體外r-干擾素釋放試驗活動性結核病通過有效的抗結核治療后，結核桿菌載量下降，效應T細胞數(shù)量會隨之減少，所以理論上IGRA結果應從陽性轉變?yōu)殛幮?，但臨床實踐中發(fā)現(xiàn)IGRA結果轉陰率非常低。2012年發(fā)表的一篇meta分析中指出，T-

14、SPOT.TB在結核病患者抗結核治療后轉陰率為5.71%-13.93%，說明IGRA在評價抗結核治療方面作用是有限的。 Chiappini E, Fossi F, Bonsignori F, et al. Utility of interferon- release assay results to monitor anti-tubercular treatment in adults and children. Clin Ther, 2012, 34: 1041-1048. IGRA在評價抗結核治療中的作用是有限的結核病實驗室檢查細菌學檢查免疫學檢查分子生物學檢查涂片染色鏡檢分枝桿菌分離培養(yǎng)

15、分支桿菌藥敏試驗分枝桿菌菌種鑒定體液免疫學診斷細胞免疫學診斷聚合酶鏈反應（PCR）DNA測序DNA探針技術基因芯片技術分子生物學檢測方法近年來核酸擴增技術和雜交分析技術的發(fā)展，為分枝桿菌的檢測、鑒定和藥敏實驗提供了極大的方便，可將診斷時間從幾周降低到幾天甚至是幾個小時。研究、應用報道較多的結核病基因診斷技術主要包括聚合酶鏈反應(PCR)、核酸探針雜交、DNA序列測定、基因芯片、基因分型等。實時熒光PCR技術本實驗室所使用的結核分枝桿菌核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）采用單管單人份的分裝技術，操作過程非常簡便；并引入熒光檢測技術，簡化了檢測步驟，并且整個擴增及擴增后檢測都無需打開擴增管蓋，從根本上

16、克服了PCR遺留污染。熒光探針PCR檢測技術綜合了PCR擴增的高敏感性、探針雜交的高特異性及熒光能量轉移的實時跟蹤特性，使檢測的準確性大大提高，并可充分保證檢測的穩(wěn)定性及重復性。結核桿菌PCR檢測的臨床意義1.在痰菌陰性結核快速診斷有重要臨床應用價值。在臨床工作中，痰菌陰性，經(jīng)臨床綜合分析后診斷為肺結核的患者，約占肺結核患者的60%-70%。有報道指出痰菌陰性的肺結核患者，如果未經(jīng)抗結核治療，經(jīng)過1-3年的隨訪，將有40%-60%的患者發(fā)展為菌陽甚至更典型的肺結核。所以獲得病原學的診斷至關重要結核桿菌PCR檢測的臨床意義2012年發(fā)表在中國防癆雜志中的一篇文章的研究指出在476例菌陰肺結核病患

17、者中，PCR法檢出116例陽性，檢測的靈敏度為24.4%而菌陽肺結核患者的檢測靈敏度為97.0%結核桿菌PCR檢測的臨床意義2、PCR法可以作為臨床痰涂片和痰培養(yǎng)的補充，為臨床診斷和治療提供幫助涂片陽性并不能區(qū)分是結核分枝桿菌還是非結核分枝桿菌，這兩者的治療是有很大的差異的，NTM對于常用的抗結核藥經(jīng)常都是無效的，所以對于涂片陽性的標本，很有必要在在做MTB-DNA的檢測，進一步確認是否是真的MTB的感染。結核桿菌PCR檢測的臨床意義3.可作為結核性關節(jié)炎和泌尿系統(tǒng)結核早期診斷的一個可靠指標。118 例疑似結核病患者, 其中關節(jié)炎患者 52 例, 泌尿系感染患者 66 例, 應用 FQ-PCR

18、 技術分別檢測患者關節(jié)腔積液和尿液中的 TB-DNA ,并與抗酸染色法的檢出率比較。結果 52 例關節(jié)炎患者中 ,確診結核性關節(jié)炎患者36 例 , TB-DNA 陽性 22 例,22 例全部為確診病例, 陽性率61.1%。抗酸染色的陽性只有2例,陽性率5.6%;66 例泌尿系統(tǒng)疾病患者中, 確診泌尿系結核患者52例 , TB-DNA 陽性 32例 ,32 例全部為確診病例 , 陽性率為 61.5 %, 抗酸染色的陽性只有 4例, 陽性率 7.7%。結論 應用 FQ-PCR 技術檢測患者關節(jié)腔積液和尿液中的 TB-DNA ,具有高度敏感性和特異性,可作為結核性關節(jié)炎和泌尿系統(tǒng)結核早期診斷的一個可

19、靠指標。 2010年發(fā)表在中國防癆雜志結核桿菌PCR檢測的臨床意義4、PCR用于臨床療效觀察比涂片、培養(yǎng)實用，對估計有可能復發(fā)的病例有一定的幫助有些耐藥菌或患者經(jīng)化療后痰排菌可能轉化為型結核分枝桿菌，抗酸染色不能有效檢測，而檢測細菌，不受其表型變化影響，所以較抗酸染色法對 有更強的檢出能力，能更有效地發(fā)現(xiàn)傳染源、降低漏診率，是早期診斷肺結核比較好的指標。L 型的結核分支桿菌是形成慢性傳染源的主要原因, 也是結核病惡化、復發(fā)的細菌學根源。所以對年老體弱、合并有其它機體疾病、痰中含菌量多 、肺部結核病變廣泛 、有空洞存在 、化療期滿、微生物學檢查(涂片加培養(yǎng))陰轉但 PCR 仍持續(xù)陽性的患者,應采取繼續(xù)密切觀察,或同時考慮更改治療方案或延長治療時間及隨訪時間等做法。美國CDC建議：在同時獲得核酸檢測和涂片結果后，根據(jù)其結果不同可分為4種情況1.對于核酸檢測和抗酸桿菌涂片結果均為陽性的患者，需高度懷疑結核病，在等待培養(yǎng)結