第21章基因診斷與基因治療ppt課件

1、第 二 十 一 章基因診斷與基因治療Genetic Diagnosis and Gene Therapy.基因(gene) 基因是為生物活性產(chǎn)物編碼的DNA功能片斷，這些產(chǎn)物主要是蛋白質(zhì)或各種RNA。.基因變異致病類型內(nèi)源基因的變異基因構(gòu)造突變基因表達(dá)異常外源基因的入侵.第 一 節(jié)基因診斷Gene Diagnosis. 二、分類 DNA診斷以DNA為檢測(cè)對(duì)象的診斷方法。 RNA診斷以mRNA為檢測(cè)對(duì)象的診斷方法。一、基因診斷的概念和特點(diǎn) 一、定義利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)和方法，直接檢測(cè)基因構(gòu)造及其表達(dá)程度能否正常，從而對(duì)疾病作出診斷的方法。.三、特點(diǎn)針對(duì)性強(qiáng) 特異性高靈敏度高 適用

2、性強(qiáng)，診斷范圍廣.二、 基因診斷常用技術(shù)方法 一、核酸分子雜交技術(shù)二、聚合酶鏈反響三、基因測(cè)序四、基因芯片五、DNA指紋.一、核酸分子雜交(molecular hybridization)技術(shù) 核酸分子雜交可用以檢測(cè)樣本中能否存在與探針序列互補(bǔ)的同源核酸序列。 核酸探針 是一類具有放射性標(biāo)志或化學(xué)標(biāo)志的并與目的目的DNA或RNA分子序列互補(bǔ)的寡核苷酸片段。 . 探針是可以同某種待研討的核酸序列或蛋白多肽鏈特異結(jié)合的任何分子，經(jīng)標(biāo)志之后可用來(lái)檢測(cè)目的DNA/RNA 或蛋白質(zhì)分子。 實(shí)驗(yàn)流程：提取DNA(限制酶切)凝膠電泳膜轉(zhuǎn)移雜交放射自顯影分析.建立在核酸雜交技術(shù)根底上的常用基因診斷方法1、限制

3、性內(nèi)切酶(restriction endonuclease)酶譜分析法2、DNA限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)分析法 3、等位基因特異寡核苷酸 (allele specific oligonucleotide, ASO)探針雜交法.1、限制性內(nèi)切酶酶譜分析法 是利用限制性內(nèi)切酶和特異性DNA探針來(lái)檢測(cè)能否存在基因變異的一種方法。.Mst酶切位點(diǎn)(CCTNAGG)53正常基因53突變基因1.15kb1.35kb鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析AT .+0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶著患

4、者鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析.2、DNA-RFLP分析法 中性突變是指在人基因組中，平均每200對(duì)堿基可發(fā)生一對(duì)變異的景象。 DNA多態(tài)性是指中性突變導(dǎo)致個(gè)體間核苷酸序列的差別。 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性是指DNA多態(tài)性假設(shè)發(fā)生在限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)上，酶切水解該DNA片段就會(huì)產(chǎn)生長(zhǎng)度不同的片段。.RFLP分析法.3、ASO雜交法 根據(jù)知基因突變位點(diǎn)的核苷酸序列，人工合成相應(yīng)于正常和突變基因堿基序列的兩種寡核苷酸探針，用它們分別與受檢者DNA進(jìn)展分子雜交來(lái)檢測(cè)能否存在等位基因突變。 .ASO雜交法探針：M N M N M N M N 正?；?純合突變 雜合突變 基因缺陷 新的突變類

5、型？ +.二、聚合酶鏈反響 (polymerase chain reaction, PCR) 是利用特異的引物，特異地?cái)U(kuò)增目的DNA的方法。 實(shí)驗(yàn)流程：提取DNAPCR凝膠電泳顯色分析.5Primer 15Primer 2Cycle 2Cycle 155 55 5 5Template DNA55 555 5 551、根本任務(wù)原理.Cycle 355 555 5 555 5 55 555 52530 次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)展100萬(wàn)倍以上。.2、常用的PCR方法： 常規(guī)PCR、巢式PCR、多重PCR、多種PCR、不對(duì)稱PCR、反轉(zhuǎn)錄PCR、定量反轉(zhuǎn)錄PCR、mRNA差別顯示PCR、原位

6、PCR、實(shí)時(shí)PCR等等。.3、在PCR技術(shù)根底上的常用基因診斷方法PCR-SSCP法*PCR-ASO法PCR-RFLP法PCR-限制酶譜法PCR-STR短串聯(lián)反復(fù)序列，short tandem repeat. SSCP是指一樣長(zhǎng)度的單鏈DNA因其堿基序列不同，甚至單個(gè)堿基不同，都能夠構(gòu)成不同的空間構(gòu)象，從而在中性聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)泳動(dòng)速率不同的景象。 單鏈構(gòu)象多態(tài)性 (single strand conformation polymorphism, SSCP).PCR-SSCP分析 是指PCR產(chǎn)物變性后，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，正?；蚝妥儺惢虻倪w移位置不同，借此可分析確定致病基因的存在。.

7、正常人純合突變雜合突變Leber 遺傳性神經(jīng)病患者 PCR/SSCP分析 線粒體DNA第11778位GA所致+.三、基因測(cè)序(gene sequencing) 即測(cè)定某一基因的堿基序列。 實(shí)驗(yàn)流程：提取DNA分別出有關(guān)基因測(cè)序分析診斷 基因測(cè)序的方法：化學(xué)裂解法DNA鏈末端合成終止法DNA自動(dòng)測(cè)序.四、基因芯片gene chip) 基因芯片，又稱DNA芯片、DNA陣列、寡核苷酸微芯片DNA chip、DNA arrays、oligonucleotide micro-chip是指將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針，有規(guī)律地陳列固定于支持物上，然后與待測(cè)的標(biāo)志樣品的基因按堿基配對(duì)原理進(jìn)展雜

8、交，再經(jīng)過(guò)激光聚焦熒光檢測(cè)系統(tǒng)等對(duì)芯片進(jìn)展掃描，并配以計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)每一探針上的熒光信號(hào)作出比較和檢測(cè)，從而迅速得出定性和定量的結(jié)果。.基因芯片的運(yùn)用1、在診斷中的運(yùn)用 核酸序列分析、基因表達(dá)分析、尋覓新基因、突變基因和基因多態(tài)性檢測(cè)等2、在藥學(xué)研討中的運(yùn)用 藥物挑選、藥物作用機(jī)制研討、耐藥菌株、藥敏檢測(cè)、毒理學(xué)研討、環(huán)境化學(xué)毒物的挑選、基因掃描等.五、DNA指紋(DNA fingerprint) 在人基因組DNA中有高度可變的“小衛(wèi)星區(qū)域，采用“小衛(wèi)星基因探針，在同一限制酶切產(chǎn)物的DNA雜交圖譜上，同一個(gè)體不同組織來(lái)源的DNA的譜帶完全一致，而不同個(gè)體之間同卵雙生除外譜帶都不一樣，好像人的指紋

9、具有高度個(gè)體特異性一樣，因此這種雜交圖譜被稱為DNA指紋或遺傳指紋genetic fingerprint。. 簡(jiǎn)言之：DNA指紋或遺傳指紋是指采用“小衛(wèi)星基因探針進(jìn)展DNA分子雜交 Southern 印跡，Southern blotting所得的圖譜。 實(shí)驗(yàn)流程：提取DNA限制酶切凝膠電泳膜轉(zhuǎn)移雜交放射自顯影分析.三、基因診斷的運(yùn)用遺傳疾病腫瘤感染性疾病傳染性流行病判別個(gè)體疾病易感性器官移植組織配型法醫(yī)學(xué)中個(gè)體識(shí)別、親子鑒定.總結(jié) 基因診斷的概念、特點(diǎn)、常用的技術(shù)方法及運(yùn)用。.復(fù)習(xí)題1、名詞解釋： 基因診斷、DNA診斷、RNA診斷、RFLP分析、SSCP、基因芯片、DNA指紋2、簡(jiǎn)述基因診斷的

10、特點(diǎn)、常用技術(shù)方法及可用于診斷的疾病。簡(jiǎn)述基因變異致病的類型及內(nèi)源性基因變異的類型。簡(jiǎn)述限制性內(nèi)切酶譜分析法、ASO探針雜交法、PCR-SSCP分析、基因芯片、DNA指紋等的實(shí)驗(yàn)流程。.第 二 節(jié)基因治療Gene Therapy.一、基因治療的概念早期是指用正常的基因整合入細(xì)胞基因組，以校正和置換致病基因的一種治療方法。 目前廣義上來(lái)講是指將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細(xì)胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揚(yáng)作用，以到達(dá)治療疾病目的的方法。一、基因治療的概念.二、基因治療的根本方法1、基因矯正 (gene correction)2、基因置換 (gene replacement)3、基因增補(bǔ) (gene augment

11、ation)4、基因失活 (gene inactivation) . 1、基因矯正 (gene correction) 指將致病基因的異常堿基進(jìn)展糾正，而正常部分予以保管。 納米鉗.A G C T G T G A A G T C G T GT C G A C A C T T C A G C A CabnormalgeneGene correctionnormalgeneTACG.2、基因置換 (gene replacement) 指用正常的基因經(jīng)過(guò)體內(nèi)基因同源重組，原位交換致病基因，使細(xì)胞內(nèi)的DNA完全恢復(fù)正常形狀。.A G C T G T G C A A G T C G T GT C G A

12、 C A C G T T C A G C A CnormalgeneA G C T G T G C A A G T C G T GT C G A C A C G T T C A G C A CnormalgeneA G C T G T G T A A G T C G T GT C G A C A C A T T C A G C A CabnormalgeneGene replacement.3、基因增補(bǔ) (gene augmentation) 將目的基因?qū)氩∽兗?xì)胞或其他細(xì)胞，不去除異?；颍墙?jīng)過(guò)目的基因的非定點(diǎn)整合，使其表達(dá)產(chǎn)物彌補(bǔ)缺陷基因的功能或使原有基因表達(dá)加強(qiáng)。.A G C T G

13、 T G C A A G T C G T GT C G A C A C G T T C A G C A CnormalgeneA G C T G T G T A A G T C G T GT C G A C A C A T T C A G C A CabnormalgeneGene augmentation.4、基因失活 (gene inactivation) 指將特定的序列導(dǎo)入細(xì)胞后，在轉(zhuǎn)錄或翻譯程度阻斷某些基因的異常表達(dá)，已到達(dá)治療疾病的目的。.幾種常見(jiàn)的基因失活技術(shù)反義核酸技術(shù)核酶技術(shù)三鏈技術(shù)干擾RNA技術(shù)肽核酸基因敲除.反義(antisence)核酸技術(shù) 是指用人工合成的RNA或DNA

14、來(lái)阻斷基因的轉(zhuǎn)錄或復(fù)制，使編碼基因不能轉(zhuǎn)錄為mRNA，因此不能翻譯成相應(yīng)的蛋白質(zhì)。.反義RNA技術(shù) 反義RNA是指與mRNA互補(bǔ)，且能抑制與疾病發(fā)生直接相關(guān)基因表達(dá)的RNA。 反義RNA技術(shù)是指利用反義RNA在mRNA程度上封鎖基因表達(dá)，最終可經(jīng)過(guò)調(diào)理劑量，來(lái)治療由基因突變或過(guò)度表達(dá)所致的疾病或嚴(yán)重感染性疾病。 .T C G A C A C A T T C A G C A CA G C T G T G T A A G T C G T GabnormalgeneGene inactivationabnormalmRNA U C G A C A C A U U C A G C A C反義RNA A

15、 G C U G U G U A A G U C G U GAbnormal proteinAbnormal protein.核酶(ribozyme)技術(shù) 經(jīng)過(guò)核酶分子結(jié)合到靶RNA分子中適當(dāng)?shù)牟课?，?gòu)成錘頭核酶構(gòu)造，催化對(duì)靶RNA分子的剪切，從而破壞靶RNA分子到達(dá)治療疾病的目的。.5353靶RNA核酶分子核酶技術(shù).三鏈技術(shù)(triplex approach) 又稱為反基因戰(zhàn)略(antigene stragegy)，是利用脫氧寡核苷酸能與雙螺旋雙鏈DNA專注性序列結(jié)合，構(gòu)成三鏈DNA，從而在轉(zhuǎn)錄程度或復(fù)制程度阻止基因轉(zhuǎn)錄或復(fù)制的技術(shù)。 能構(gòu)成三鏈DNA的脫氧寡核苷酸稱為三鏈DNA構(gòu)成脫氧寡核

16、苷酸t(yī)riplex-forming oligonucleotide,TFO)。.復(fù)制、轉(zhuǎn)錄三鏈DNA技術(shù).干擾RNA(interference RNA,RNAi)技術(shù) RNAi是指在特定因子作用下，有導(dǎo)入胞內(nèi)的雙鏈RNA降解生成的約22nt左右的SiRNAs(single strand RNAi)。 RNAi技術(shù)是指利用堿基互補(bǔ)配對(duì)原那么，使RNAi和靶DNA結(jié)合，同時(shí)誘導(dǎo)激活體內(nèi)的基因沉默因子，從而使靶DNA降解。.dsRNARNAi-DNARNA、DNA降解干擾RNA技術(shù)RNAi.RNAi技術(shù)的特點(diǎn)特異性強(qiáng)效率性高作用時(shí)間長(zhǎng)可經(jīng)過(guò)細(xì)胞屏障而發(fā)揚(yáng)作用.肽核酸(peptide nucleic

17、acid,PNA)技術(shù) PNA是指DNA-肽復(fù)合物。 PNA技術(shù)是利用多肽與DNA的特異性結(jié)合，專注地抑制某一基因的表達(dá)。.肽肽核酸技術(shù).基因敲除(gene knock-out)技術(shù) 指有目的的去除動(dòng)物體內(nèi)某種基因的技術(shù)。.三、基因治療的其他方法1、“自殺基因的運(yùn)用 某些病毒或細(xì)菌的基因所表達(dá)的酶能將對(duì)人體無(wú)毒或低毒的藥物前體在人體細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒性產(chǎn)物，從而導(dǎo)致攜帶該基因的受體細(xì)胞也被殺死，故稱這類基由于自殺基因。 自殺基因 無(wú)毒、低毒的藥物前體 細(xì)胞毒性產(chǎn)物細(xì)胞死亡.2、基因疫苗的運(yùn)用 將編碼外源性抗原的基因插入到含真核表達(dá)系統(tǒng)的質(zhì)粒上，然后將質(zhì)粒直接導(dǎo)入人或動(dòng)物體內(nèi)，讓其在宿主細(xì)胞內(nèi)表

18、達(dá)抗原蛋白，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)對(duì)。.重組表達(dá)質(zhì)粒外源性抗原基因基因疫苗.二、基因治療的根本程序一、治療性基因的選擇 目的基因的選擇二、基因載體的選擇三、靶細(xì)胞的選擇四、基因轉(zhuǎn)移五、外源基因表達(dá)的挑選 利用載體中的標(biāo)志基因 有neor標(biāo)志基因時(shí)，用 418進(jìn)展挑選六、回輸體內(nèi) 靜脈回輸 自體骨髓移植 埋入皮下組織病毒載體*非病毒載體體細(xì)胞生殖細(xì)胞間接體內(nèi)療法(ex vivo)直接體內(nèi)療法(in vivo). 常見(jiàn)基因載體的優(yōu)缺陷載體 優(yōu)點(diǎn) 缺陷逆轉(zhuǎn)錄病毒 基因組小并且簡(jiǎn)單 僅感染分裂細(xì)胞 穩(wěn)定整合于宿主基因組 隨機(jī)整合能夠?qū)е峦蛔?生物學(xué)特性清楚 經(jīng)常只需短暫表達(dá) 可高效轉(zhuǎn)入復(fù)制中的細(xì)胞 病毒滴度低107pfu/ml 對(duì)宿主無(wú)害 能夠會(huì)于有復(fù)制才干的病毒重組腺病毒相關(guān)病毒 基因組小 未知 可特異整合于人染色體19q 需腺病毒輔助復(fù)制 以人細(xì)胞作為宿主 攜帶外源基因才干有限 無(wú)毒，無(wú)致病性 難