熒光化學發(fā)光在植物分子生物學科學應(yīng)用

1、熒光化學發(fā)光在植物分子生物學科學應(yīng)用Outline1、熒光技術(shù)2、化學發(fā)光技術(shù)1、熒光技術(shù)熒光技術(shù)的分類熒光強度時間分辨熒光熒光偏振熒光共振能量傳遞均相時間分辨熒光1）熒光強度（FI）S1inner orbitalouter orbitalnucleousExcitation Signal Ex EmSoEmission SignalFI應(yīng)用的優(yōu)勢靈敏度高，使用方便、安全可以靈活地利用各種類型的熒光探針和熒光染料對目標物質(zhì)進行特異性標記，大大減少雜質(zhì)的信號干擾可以進行活細胞或活體檢測（細胞毒性?。┛梢赃M行多重專一性標記（如藍色細胞核/紅色線粒體）FI應(yīng)用范圍生物大分子的定量分析核酸、蛋白質(zhì)酶活

2、性分析糖甘酶、蛋白酶、脫氫酶、過氧化物酶鈣流檢測報告基因檢測（GFP）FI應(yīng)用核酸定量分析Picogreen熒光染料可以排除蛋白質(zhì)等的信號干擾（用于檢測蛋白質(zhì)樣品中的微量核酸）Arabidopsis Chromatin DNAThe Plant Cell, 18461858, 2003(15)Tobacco RNAThe Plant Cell, 22032217, 2003(15)FI應(yīng)用糖苷酶活性分析b-D-glucosidase 4-MUb-D-glucopyranoside b-D-fucosidase 4-MUb-D-fucoside Decreased Glucosidase and

3、 Fucosidase Activity in nai1-1 and nai1-2 Arabidopsis Mutants. (Plant Cell, 15361549, 2004-16)FI應(yīng)用蛋白酶活性分析Fractionation of Soybean Proteases after Oxidative Stress. (H2O2 treated vs. control) (Plant Cell, 431443, 1999-11)Arginine-specific Protease Z-Gly-Gly-Arg-AMCFI應(yīng)用的局限性背景熒光干擾微孔板的自發(fā)熒光細胞的內(nèi)源熒光2）時間分辨熒

4、光（TRF）Elapsed TimeIntensity ExcitationAutoFluorescenceFluorescein Emission Europium EmissionLong Decay Time .- Measurement -利用時間特性達到超高靈敏度Europium ion鑭系元素鑭系元素螯合物時間分辨熒光素鑭系元素螯合物孵育(結(jié)合)洗滌（去除非結(jié)合） 檢測 缺點：需洗滌；洗滌強度很難一致，結(jié)果重復(fù)性差。FI / TRF應(yīng)用的局限性（非均相技術(shù)） 熒光偏振（FP）熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）均相時間分辨熒光（HTRF）均相技術(shù)的優(yōu)勢孵育(結(jié)合) 檢測 優(yōu)點：無需洗滌；均

5、一性、重復(fù)性好“Add, Mix, and Read”3）熒光偏振（FP）PolarizerAnalyzer偏振光熒光分子運動熒光分子靜止100 %0 %熒光偏振（FP）原理0 %熒光偏振是一種測量分子旋轉(zhuǎn)速率的技術(shù)。P = I | + I |_I | I |_標記的配體(低偏振值）目標分子與標記的配體結(jié)合 （高偏振值）FP應(yīng)用方式偏振值與分子大小的關(guān)系FP應(yīng)用的優(yōu)勢均相 (無分離/洗滌），在溶液中測量 ；可以實時檢測（動力學檢測）；快速，容易實現(xiàn)高通量測量的是比值，結(jié)果與熒光基團的絕對濃度無關(guān)FP應(yīng)用范圍受體配體相互作用多肽蛋白質(zhì)結(jié)合 蛋白質(zhì)核酸結(jié)合酶活性分析淀粉酶、蛋白酶、磷酸激酶、磷酸酶

6、fragmentsAmylaseAmyloseFP應(yīng)用淀粉酶活性分析 熒光標記的Amylose被分解成小片段(偏振值下降)淀粉酶會促進生物體內(nèi)淀粉粒的降解，進而產(chǎn)生更多的能量物質(zhì)，來響應(yīng)某些環(huán)境刺激或促進種子萌發(fā)。FP應(yīng)用的局限性使用具有較短壽命的熒光素（如Fluorescein）依賴于分子結(jié)合造成的分子體積的顯著改變LARGE molecule4）熒光共振能量傳遞（FRET） Binding NO Binding均相檢測（無分離和洗滌步驟）實時連續(xù)地觀察活細胞的動態(tài)變化FRET應(yīng)用的優(yōu)勢FRET應(yīng)用范圍酶活性分析蛋白酶、磷酸激酶蛋白質(zhì)核酸相互作用酵母雙雜交系統(tǒng)、噬菌體展示系統(tǒng)所篩選克隆的復(fù)證

7、鈣流檢測、離子通道研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)研究FRET應(yīng)用鈣流檢測以熒光蛋白為基礎(chǔ)的Ca2+ sensor供體：CFP受體：YFP Guard cell（Arabidopsis）胞漿鈣離子動態(tài) (Plant J, 1999-19, p735-747)FRET應(yīng)用示例鈣流檢測FRET應(yīng)用胞內(nèi)激酶活性分析Indicators for protein phosphorylation in living cells已知蛋白激酶特異性的底物結(jié)構(gòu)域磷酸化識別結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)磷酸化是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的重要標志 FRET應(yīng)用的局限性信噪比經(jīng)常不佳，通常為1：1 -背景主要來自受體被直接激發(fā)的信號供體：鑭系元素螯合物受體：X

8、L6655）均相時間分辨熒光（HTRF）PAPCExcitationat 320nmEmissionat 665nmTimeIntensityHTRF應(yīng)用的優(yōu)勢靈敏度更高的FRETPYenergy transferAPCEuExcitationat 320nmEmissionat 665nmTimeIntensity2、化學發(fā)光技術(shù)化學發(fā)光技術(shù)的分類發(fā)光發(fā)光共振能量傳遞1）發(fā)光（Lum）SubstrateProduct +LightEnzyme優(yōu)勢：超高靈敏度Lum應(yīng)用范圍鈣流檢測基因調(diào)控ATP檢測發(fā)光免疫分析發(fā)光應(yīng)用鈣流檢測 水母發(fā)光蛋白AequorinCa+Kinetics of the

9、-glucan（葡聚糖）elicitor-induced enhancement of the Ca2+cyt in soybean cells. （Biological Procedures Online 2002- 4/1, p105-118）發(fā)光應(yīng)用示例鈣流檢測發(fā)光應(yīng)用基因調(diào)控pSP-luc+ (轉(zhuǎn)化擬南芥細胞)Cultured cells show diurnal rhythms (Arabidopsis) (Plant Cell Physiol, 2004-45/1, p57-67)CCA1的啟動子區(qū)域CCA1在晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)起中心作用的轉(zhuǎn)錄因子發(fā)光應(yīng)用示例基因調(diào)控2）發(fā)光共振能量傳遞

10、（BRET）Donor = Renilla luciferase (Rluc)Acceptor = YFPBRET應(yīng)用范圍蛋白組學:蛋白-蛋白相互作用胞內(nèi)細胞器間的相互作用對酵母雙雜交結(jié)果的驗證受體研究:受體的同源和異源二聚體化受體應(yīng)答傳導(dǎo)途徑孤兒受體的篩選BRET應(yīng)用示例蛋白質(zhì)相互作用 發(fā)光光譜（關(guān)注530/480 ratio）COP1的二聚體化COP1-光形態(tài)建成的關(guān)鍵抑制因子COP1蛋白突變體的二聚體化研究 (PNAS, 2004-101/17, p67986802)BRET應(yīng)用示例蛋白質(zhì)相互作用cytoplasmic localization signal (CLS)技術(shù)總結(jié)熒光技術(shù) 利用熒光物質(zhì)進行特異性標記；特異性好，靈敏度高；特別適合于細胞研究和分子間相互作用研究。發(fā)光技術(shù) 靈敏度超高，特別適合于基因表達和