食品檢測技術(蛋白質)

1、第六節(jié) 蛋白質及氨基酸態(tài)氮的測定一、蛋白質概況 蛋白質是含氮的有機化合物，分子量很大。主要由C、H、O、N、S五種元素組成。某些蛋白質中還含有微量的 P、Cu、Fe、I 等。 在食品和生物材料中常包括蛋白質，可能還包括有非蛋白質含氮的化合物，如核酸、含氮碳水化合物、生物堿等；含氮類脂、卟啉和含氮的色素。蛋白質維持生命活動的物質根底。 是塑造一切細胞和組織結構必不可少的組成成分。 蛋白質是人體重要的營養(yǎng)物質。 人體11%13%總熱量來自蛋白質。無論動物、植物都含有蛋白質，只是含量及類型不同。 人和動物只能從食物中獲得蛋白質及其分解產(chǎn)生用來構成自身的蛋白質。 蛋白質含量是評價食品營養(yǎng)價值的重要指標

2、。1、蛋白質的生理作用使組織保持一定的彈性和硬度 ；建造、更新和修復細胞 ；定期更換組織 ；組成體內(nèi)必需的化合物；增強抗病力 ；調節(jié)血液和體液的組成局部； 調節(jié)血液和體液的酸堿度 ；供給能量。一般說來，動物性食品的蛋白質含量高于植物性食品。例如牛肉中蛋白質含量為 20.0%左右。豬肉 9.5%， 兔肉 21%， 雞肉 20%， 牛乳 3.5%， 帶魚 18.0%， 大豆 40%，面粉 9.9%， 菠菜 2.4%， 黃瓜 1.0%，蘋果 1.4% 測定食品中的蛋白質的含量，對于評價食品的營養(yǎng)價值，合理開發(fā)利用食品資源、提高產(chǎn)品質量、優(yōu)化食品配方、指導經(jīng)濟核算及生產(chǎn)過程控制均具有極其重要的意義。2

3、、蛋白質測定根底 利用蛋白質的共性，即含氮量、 肽鍵和折射率等測定含量。測定方法 利用蛋白質中特定氨基酸殘基、 兩性酸、堿及芳香基團等 測定含量。 經(jīng)典凱氏定氮法。常量、半微量、 微量具體測定方法：凱氏定氮法最常用的，國內(nèi)外應用普遍。目前遭到致疑？雙縮脲反響、染料結合反響、酚試劑法國外： 紅外分析儀氨基酸總量酸堿滴定法測定。各種氨基酸的別離與定量色譜技術。有多種氨基酸分析儀。蛋白質含量測定方法比較：蛋白質含量測定法，是生物化學研究中最常用、最根本的分析方法之一。目前常用的有四種古老的經(jīng)典方法，即定氮法，雙縮尿法Biuret法、Folin酚試劑法Lowry法和紫外吸收法。另外還有一種近十年才普遍

4、使用起來的新的測定法，即考馬斯亮藍法Bradford法。其中Bradford法和Lowry法靈敏度最高，比紫外吸收法靈敏1020倍，比Biuret法靈敏100倍以上。定氮法雖然比較復雜，但較準確，往往以定氮法測定的蛋白質作為其他方法的標準蛋白質。 值得注意的是，這后四種方法并不能在任何條件下適用于任何形式的蛋白質，因為一種蛋白質溶液用這四種方法測定，有可能得出四種不同的結果。每種測定法都不是完美無缺的，都有其優(yōu)缺點。在選擇方法時應考慮：實驗對測定所要求的靈敏度和精確度；蛋白質的性質；溶液中存在的干擾物質；測定所要花費的時間。 考馬斯亮藍法Bradford法，由于其突出的優(yōu)點，正得到越來越廣泛的

5、應用。3、蛋白質的定性測定1蛋白質的一般顯色反響電泳或紙層析之后用一些染料與蛋白質結合并變色?？闪信e出 5 種染料。2復合蛋白質的顯色反響糖蛋白的顯色3種方法脂蛋白的顯色2種方法食品和其原料中蛋白質含量的測定，主要也是最常用的用凱氏定氮法測定總氮量，然后乘一個蛋白質換算系數(shù)。這里也包括非蛋白的氮，所以只能稱為粗蛋白的含量但馬鈴薯等非蛋白氮多的要單測。二、凱氏定氮法GB/T147712003 是測定樣品總有機氮的最準確、較簡便的方法之一。有機化合物組成：C、H、O、N、S等。糖類和脂類：C、H、O。蛋白質：N。 C、H、O、N 特征 16 1份氮相當于份蛋白質。 通過測定樣品中的總氮量再乘以相應

6、的蛋白質系數(shù)。 一些蛋白質的含氮量一般為 15% 17.6%，有的上下浮動可以測出總氮 N。凱氏定氮法： 由Kieldhl于1833年提出，現(xiàn)開展為常量、微量、自動定氮儀法，半微量法及改進凱氏法。= N6.25 = 蛋白質含量1、原理 樣品、濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機氮轉化為氨，并與硫酸結合成硫酸銨。然后加堿蒸餾，使氨逸出，用硼酸溶液吸收后，再以標準鹽酸溶液滴定。根據(jù)消耗的標準鹽酸液的體積可計算蛋白質的含量。 整個過程分三步：消化、蒸餾、吸收與滴定。1樣品消化2NH2CH22COOH13H2SO4 NH42SO46CO212SO

7、216H2O 濃硫酸既可使有機物脫水后被炭化為碳、氫、氮；又能將有機物炭化后的碳轉化為二氧化碳，而硫酸那么被復原成二氧化硫： 2H2SO4C CO2SO2H2O 二氧化硫使氮復原為氨，本身那么被氧化為三氧化硫，氨隨之與硫酸作用生成硫酸銨留在酸性溶液中： H2SO42NH3 NH42SO4加硫酸鉀：作為增溫劑，提高溶液沸點，純硫酸沸點是3400C，參加硫酸鉀后可以提高至4000C以上，也可參加硫酸鈉，氯化鉀等提高沸點，但效果不如硫酸鉀。加硫酸銅：作為催化劑。還可以作消化終點指示劑做蒸餾時堿性指示劑。還可以加氧化汞、汞均有毒，價格貴、硒粉、二氧化鈦。加氧化劑：如雙氧水、次氯酸鉀等加速有機 物氧化速

8、度。消化裝置：要防止爆沸。 要在通風廚中進行。2蒸餾 在消化完全的樣品溶液中參加氫氧化鈉溶液使呈堿性，加熱蒸餾，釋放出氨氣。 NH42SO42NaOH 2NH3Na2SO42H2O 蒸餾： 消化液 + 40%氫氧化鈉加熱蒸餾，放出氨氣?；瘜W分析法 a消化裝置 b蒸餾裝置圖4-7 凱氏定氮消化、蒸餾裝置1水力真空管； 2水龍頭； 3倒置的枯燥管； 4凱氏燒瓶； 5、7電爐； 6、9鐵支架； 8蒸餾燒瓶； 10進樣漏斗； 11冷凝管； 12吸收瓶 3吸收與滴定 加熱蒸餾所放出的氨，可用硼酸溶液吸收，待吸收完全后，再用鹽酸標準溶液滴定，因硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不影響指示變色，但它有吸收氨的作用。

9、2NH34H2BO3 NH42B4O75H2ONH42B4O75H2O2HCl 2NH4Cl4H3BO3 先用4%硼酸吸收，再用鹽酸標準溶液滴定，指示劑用混合指示劑甲基紅溴甲基酚綠混合指示劑國標用亞甲基蘭+甲基紅。 指示劑 紅色 綠色 紅色 酸 堿 酸 吸收滴定2、儀器和試劑儀器： 凱氏燒瓶；可調式電爐；蒸餾裝置。試劑： 硫酸銅；硫酸鉀；濃硫酸；40氫氧化鈉溶液；4硼酸溶液；鹽酸標準溶液；甲基紅次甲基藍混合指示劑。3、操作步驟1樣品消化5g樣品硫酸銅10g硫酸鉀20ml濃硫酸 凱氏燒瓶 小火 碳化 無泡沫 溶液呈透明藍綠色 大火 加熱1h 冷卻400C 水 消化液 冷卻室溫2蒸餾、吸收吸收瓶：

10、參加10ml4硼酸液12滴混合指示劑安裝蒸餾裝置：注意密封，吸收管插入吸收瓶加堿液：吸10ml消化液，緩慢參加10ml40%氫氧化鈉至溶液變?yōu)楹稚訜嵴麴s：15min滴定：用鹽酸標液標定4、結果計算 VV00.014C蛋白質F100 m10/100式中 V滴定試樣時消耗鹽酸標液的體積，ml； V0空白試驗消耗鹽酸標液的體積，ml； C鹽酸標液的深度，mol/l； 0.014氮的毫摩爾質量，g/mol； m試樣的質量，g； F氮換算為蛋白質的系數(shù)。 5、說明 所用試劑溶液應用無氨蒸餾水配制。 消化時不要用強火，應保持和緩沸騰，以免粘貼在凱氏瓶內(nèi)壁上的含氮化合物在無硫酸存在的情況下消化不完全而造成

11、氮損失。 消化時應注意不時轉動凱氏燒瓶，以便利用冷凝酸液將附在瓶壁上的固體殘渣洗下，并促進其消化完全。 樣品中假設含脂肪較多時，消化過程中易產(chǎn)生大量泡沫，為防止泡沫溢出瓶外，在開始消化時應用小火加熱，并時時搖動；或者參加少量辛醇或液體石蠟或硅油消泡劑，并同時注意控制熱源強度。 當樣品消化液不易澄清透明時，可將凱氏燒瓶冷卻，參加30過氧化氫 23 m1 后再繼續(xù)加熱消化。 假設取樣量較大，如干試樣超過5 g 可按每克試樣5 m1的比例增加硫酸用量。 般消化至呈透明后，繼續(xù)消化30分鐘即可，但對于含有特別難以氨化的氮化合物的樣品如含賴氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等時，需適當延長消化時間。有

12、機物如分解完全，消化液呈藍色或淺綠色，但含鐵量多時，呈較深綠色。 蒸餾裝置不能漏氣。 蒸餾前假設加堿量缺乏，消化液呈藍色不生成氫氧化銅沉淀，此時需再增加氫氧化鈉用量。氫氧化銅在7090時發(fā)黑。 蒸餾完畢后，應先將冷凝管下端提離液面清洗管口，再蒸1分鐘后關掉熱源否那么可能造成吸收液倒吸。 三、微量凱氏定氮法1、原理及適用范圍同前2、與常量法不同點：參加硼酸量有50 ml 10 ml，滴定用鹽酸濃度由0.1 mol/L 0.01 mol/L ，可用微量滴定管。3、蒸餾裝置見 下頁圖 。10-210-2化學分析法 注意：每蒸餾完一樣品后都要對儀器進行清洗，微量凱氏定氮瓶的洗滌方法： 將吸收瓶移開后關

13、閉蒸汽將3用夾子夾住，蒸汽直接排空，使汽水別離器的蒸汽冷卻，壓力降低，蒸汽瓶中的液體倒流至汽水別離器中。接著用約50mL水置于冷凝管下端，由于反響管內(nèi)壓力降低，水被壓入反響管并流入汽水別離器中。再從漏斗加水約50mL，加熱通入蒸汽洗滌反響管，此時將汽水別離器中的廢水放出注意不要放空，留少量水于管中，以免漏氣。按上法同樣操作，使洗液倒流入汽水別離器中，重復洗滌兩次。 化學分析法 半微量定氮法以啤酒中蛋白質的區(qū)分為實例1原理根據(jù)蛋白質降解物的性質，可有多種區(qū)分蛋白質的方法。這里介紹隆丁蛋白質區(qū)分法。它是以單寧和磷鉬酸兩種沉淀劑將蛋白質降解物分成三個區(qū)分。A區(qū)：溶解在麥芽汁或啤酒中的高分子蛋白質，在

14、酸性溶液中，易為單寧所沉淀。它包括全部熱凝固性氮和較高分子量的降解產(chǎn)物蛋白。B區(qū)：磷鉬酸可同時沉淀高、中分子含氮物質。B區(qū)是用磷鉬酸沉淀的含氮物與用單寧沉淀的含氮物之差，即為中分子含氮物質。它包括蛋白胨和多肽。 C區(qū)：是用單寧和磷鉬酸均不能沉淀的含氮化合物，包括短肽鏈、氨基酸和其他含氮化合物?；瘜W分析法 2 試劑16%單寧溶液16g單寧溶解于100mL水中。50%鉬酸鈉溶液溶解50g鉬酸鈉于100mL水中。53%硫酸溶液100g硫酸參加92g水中?？偟獪y定用試劑。濃硫酸。 混合催化劑稱取100g硫酸鉀、10g硫酸銅，1g曬粉，混合均勻后研磨，過80目篩。每毫升濃硫酸用。20%硼酸溶液30%氫氧

15、化鈉溶液。 鹽酸標準溶液。 化學分析法 3儀器125mL凱氏燒瓶。半微量凱氏定氮裝置以下圖。4測定步驟A 測總氮消化吸取除氣啤酒于125mL干潔的凱氏燒瓶中，先以文火濃縮成粘稠狀約濃縮至12，冷卻后加混合催化劑，小心勿黏附于瓶壁，再參加5mL濃硫酸，搖勻，同微量定氮法小心將試樣消化呈透明的淡綠色，放冷。將消化液全部轉移入100mL容量瓶中，加水定容至刻度。化學分析法 圖4-9 半微量凱氏定氮裝置1電爐； 2水蒸汽發(fā)生； 3蒸汽進口； 4進料漏斗位置； 5反響室； 6蒸餾液出口； 7冷凝管； 8接受瓶； 9廢液出口； 10冷水進口； 11冷水出口 化學分析法 蒸餾吸取稀釋消化液，注入蒸餾瓶內(nèi)層，

16、另用一個100mL錐形瓶裝20mL2%的硼酸吸收液，加甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑3滴。將冷凝器尖端插入吸收瓶液面以下。向蒸餾器內(nèi)緩緩參加15mL30%氫氧化鈉溶液，至呈藍色。堿液流盡前，于漏斗內(nèi)加少量水作水封。通入水蒸氣，蒸餾15min后，讓硼酸液離開冷凝器尖端，再蒸1min，用水沖洗冷凝器尖端，洗入吸收瓶內(nèi)。移走吸收瓶，關熄電爐。滴定用HCl標準溶液滴定吸收液由綠色變灰紅色為終點。記錄消耗體積V0mL。另不加樣品，同法做試劑空白實驗，記錄空白消耗溶液的體積VmL?；瘜W分析法 計算 式中：C鹽酸標準液的摩爾濃度，mol/L；標準溶液的體積，mL；V滴定時消耗HCl標 V0空白實驗時消耗HCl準

17、溶液的體積，mL；14.01氮的摩爾質量，g/mol；100/255100換算為100mL啤酒試樣中氮的含量。其中25為吸收蒸餾用稀釋消化液的毫升數(shù)，100為稀釋消化液的總體積，5為消化用樣品的毫升數(shù)，100為換算成100mL啤酒。 化學分析法 B用單寧沉淀吸收除氣啤酒置于200mL容量瓶中，加水至約180185mL，加4mL53%硫酸溶液，加塞，搖勻。容量瓶于20水浴中，保溫1520min，加10mL16%單寧溶液，用水定溶至刻度，搖勻，立即用濾紙過濾，并重過濾至清。吸收濾液，按測總氮的方法，用半微量定氮法測濾液中含氮量Nbc。 化學分析法 C用磷鉬酸沉淀吸取除氣啤酒于200mL容量瓶中，加

18、水至約175mL，加10mL50%的鉬酸鈉溶液，加塞，搖勻。容量瓶于20水浴中，保溫15-20min，加10mL53%硫酸溶液，加水至刻度，搖勻，過濾。吸取濾液，用半微量定氮法測定微液中的含氮量N 化學分析法 5計算三個區(qū)分中氮含量分別為：A區(qū)氮含量mg/100mL=N總-NbcB區(qū)氮含量mg/100mL=Nbc-NcC區(qū)氮含量氮mg/100mL=Nc高、中、低含氮化合物在總氮中占的百分比分別為： A BN 化學分析法 6注意溫度對蛋白質沉淀影響很大。沉淀、定容、過濾均應在20條件下進行。溫度低于20，那么高分子局部比例偏高，低分子局部比例偏底，影響測定結果。在測定濾液含氮量前應充分搖勻。硫酸

19、和鉬酸鈉Na2MoO42H2O作用生成鉬酸，再和試樣本身存在的磷酸鹽作用生成磷鉬酸，這樣生成的磷鉬酸作沉淀劑比市售的磷鉬酸還好，因此操作中一般不直接參加磷鉬酸，而用硫酸和鉬酸鈉代替。蛋白質膠體沉淀過濾較慢，可用折疊濾紙過濾。本法也適用于麥芽、麥芽汁中蛋白質區(qū)分。 四、自動凱氏定氮法1、原理及適用范圍同前 2、特點1消化裝置用優(yōu)質玻璃制成的凱氏消化瓶，紅外線加熱的消化爐。2快速：一次可同時消化8個樣品，30分鐘可消化完畢。3自動：自動加堿蒸餾，自動吸收和滴定，自動數(shù)字顯示裝置?？捎嬎憧偟俜趾坎⒂涗?，12分鐘完成1個樣。北京福德泰和科技有限公司 產(chǎn)品名稱： 凱氏定氮儀 五、雙縮脲法 傳統(tǒng)的凱氏

20、定氮法應用范圍廣，靈敏度高、準確，不要大儀器，但費時間，有環(huán)境污染。 新開發(fā)的：雙縮脲法、 紫外分光光度法、 染料結合法、 水楊酸比色法等。1.原理脲尿素NH2CONH2 加熱至150160時，兩分子縮和成雙縮脲。 雙縮脲能和硫酸銅的堿性溶液生成紫色絡和物，這種反響叫雙縮脲反響?？s二脲反響蛋白質分子中含有肽鍵 CONH 與雙縮脲結構相似。在同樣條件下也有呈色反響，在一定條件下，其顏色深淺與蛋白質含量成正比，可用分光光度計來測其吸光度，確定含量。560nmNH2CONHCONH2 + NH3NH2CONH2 + NH2CONH2注：測蛋白質時叫雙縮脲法，并不另加雙縮脲。樣品不用消化。 2.方法特

21、點及應用范圍 本法靈敏度較低，但操作簡單快速，故在生物化學領域中測定蛋白質含量時常用此法。本法亦適用于豆類、油料、米谷等作物種子及肉類等樣品測定。 3.主要儀器 分光光度計，離心機4000 r/min。 4. 試劑 (1) 堿性硫酸銅溶液 (2) 四氯化碳 5操作方法 采用凱氏法測出的蛋白質樣品為標準樣繪標準曲線。？六、紫外吸收法 1原理：利用蛋白質的特有基團R（ NHCHCO） 對紫外光有吸收作用在280 nm下，吸光度與蛋白質濃度成直線關系，求含量。2適用范圍：常用于生物化學工作，因為干擾因素多，故在食品分析領域應用不廣泛。3主要儀器 紫外分光光度計 離心機30005000 r/min4操

22、作：用凱氏法測定作標樣做標準曲線六、考馬斯亮蘭法Bradford法 1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法Bradford法，是根據(jù)蛋白質與染料相結合的原理設計的。這種蛋白質測定法具有超過其他幾種方法的突出優(yōu)點，因而正在得到廣泛的應用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質測定法?？捡R斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質結合，使染料的最大吸收峰的位置lmax，由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。經(jīng)研究認為，染料主要是與蛋白質中的堿性氨基酸特別是精氨酸和芳香族氨基酸殘基相結合。在595nm下測定的吸光度值A595，與蛋白質濃度成正比。Bradford法的突出優(yōu)點是：

23、1靈敏度高，據(jù)估計比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質檢測量可達1mg。這是因為蛋白質與染料結合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質染料復合物有更高的消光系數(shù)。2測定快速、簡便，只需加一種試劑。由于染料與蛋白質結合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。因而完全不用像Lowry法那樣費時和嚴格地控制時間。3干擾物質少。如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測定法。 缺點是：1由于各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質測定時

24、有較大的偏差，在制作 標準曲線時通常選用 g球蛋白為標準蛋白質，以減少這方面的偏差。2仍有一些物質干擾此法的測定，主要的干擾物質有：去污劑、 Triton X-100、十二烷基硫酸鈉SDS和的NaOH。如同的酸干擾Lowary法一樣。3標準曲線也有輕微的非線性，因而不能用Beer定律進行計算，而只能用標準曲線來測定未知蛋白質的濃度。八、氨基酸態(tài)氮的測定利用各種顯色反響進行定性檢測。一雙指示劑甲醛滴定法特點：適用于發(fā)酵工業(yè)，如發(fā)酵液中含氮量，其發(fā)酵過程中氮量減少情況等。適于食品中游離氨基酸的測定1、原理 氨基酸含有氨基及羧基兩性基因，他們相互作用而形成中性的內(nèi)鹽，參加甲醛與氨基起反響而使羧基游離

25、出來，顯示出酸性，再用氫氧化鈉標準溶液滴定羧基，間接求出氨基酸態(tài)氮的量。RCC=O RCHCOOH酸性 H2NO NH2堿性RCHCOOH+HCHO=RCHCOOH酸 NH2 NHCH2OHRCHCOOHNaOH=RCHCOONa NHCH2OH NHCH2OH 2、試劑20中性甲醛溶液；氫氧化鈉標準溶液；百里酚酞95乙醇溶液；中性紅50%乙醇溶液。3、測定方法樣品液 錐形瓶 琥珀色V1 50ml水 滴定中性紅 氫氧化鈉標液樣品液 錐形瓶 靜置1min 淡藍色V2 百里酚酞 滴定中性甲醛10ml 氫氧化鈉標液4、結果計算 CV2V1氨基酸態(tài)氮100 M式中：C氫氧化鈉標準溶液的濃度； V1用中

26、性紅作指示劑滴定耗氫氧化鈉標準溶液的量ml； V2用百里酚酞作指示劑滴定耗氫氧化鈉標準溶液的量ml 0.014氮的摩爾質量； M測定用樣品溶液相當于樣品的質量g。 5、說明1此法適用于測定食品中的游離氨基酸。2固體試樣經(jīng)準確稱量后需進行粉碎，用水萃取，取萃取液測定。萃取可在500C水浴中。3假設樣品顏色較深，可加適量活性炭脫色后再進行測定，或利用電位滴定。二電位滴定法1、原理 利用氨基酸的兩性作用，參加甲醛以固定氨基的堿性，使羧基顯示出酸性，將酸度計的甘汞電極及玻璃電極插入被測液中構成電池，用氫氧化鈉標準溶液滴定，根據(jù)酸度度指示pH值控制終點。2、試劑20中性甲醇溶液；氫氧化鈉標準溶液。3、儀

27、器酸度計；磁力攪拌器；10ml微量滴定管。4、測定方法1吸取含氨基酸約20mg醬油的樣品溶液，于100ml溶量瓶中，加水至刻度，混勻后吸取置于200ml燒杯中，加60ml水，開動磁力攪拌器，用氫氧化鈉標準溶液滴定至酸度計指示，記錄消耗氫氧化鈉標準溶液毫升數(shù)，可計算總酸含量。2參加甲醛溶液，混勻。再用氫氧化鈉溶液滴定至，記錄消耗氫氧化鈉標準溶液毫升數(shù)。3取80ml水先用氫氧化鈉溶液調至，再參加甲醛溶液，用氫氧化鈉標準溶液滴定至，做試劑空白試驗。自動電位滴定計的使用：1、安裝。 2、手動，滴定管調零。3、調至pH位，測緩沖液溫度，查對應pH值，調至pH值。4、校正，250C 用緩沖液 定位。 用緩

28、沖液 斜率。5、設置終點 為終點電位 調預控點范圍設置為。6、測定：按功能鍵 自動 滴定開始。7、加甲醛，再設置第二個終點和預控點為定位。5、結果計算 CV2V1氨基酸態(tài)氮100 20 M- 100式中：C氫氧化鈉標準溶液的濃度； V1測定樣品稀釋液參加甲醛后消耗氫氧化鈉標準溶液的體積ml； V2測定空白參加甲醛后耗氫氧化鈉標準溶液的體積ml 0.014氮的摩爾質量； M測定用樣品溶液相當于樣品的質量g。 氨基酸的別離與測定 一薄層色譜法薄層層析法TLC 法Thin Layer Chromatography簡介： 近年來開展起來的一種微量而快速的層析方法，它把吸附劑或支持劑均勻的鋪在玻璃板上成一薄層，把樣品點在薄層上，然后用適宜的溶劑展開，從而到達別離、鑒定和定量的目的。因為層析在薄層上進行，所以稱為薄層層析。它的應用范圍比紙上層析更廣泛，常用來分析氨基酸、農(nóng)藥殘留量、黃曲霉毒素等。一原理 取一定量經(jīng)水解的樣品溶液，滴在制好的薄層板上，在溶劑系統(tǒng)中進行雙向上行法展開，樣品各組分在薄層板上經(jīng)過屢次的被吸附、解吸、交換等作用，同一物質具有相同的Rf值，不同成分那么有不同的Rf值，因而各種混合物可到達彼此被別離的目的。然后用茚三酮顯色，與標準氨基酸進行比照，鑒別各種氨基酸種類，從