DB33_T 2333-2021飼料中β-胡蘿卜素的測定 高效液相色譜法(可復(fù)制）

1、CCICS 65.020.01CCS B 20DB33浙江省地方標(biāo)準(zhǔn)DB33/T 23332021飼料中 -胡蘿卜素的測定高效液相色譜法Determination of -carotene in feeds High performance liquid chromatography2021-04-13 發(fā)布2021-05-13 實(shí)施浙江省市場監(jiān)督管理局 發(fā)布DB33/T 23332021DB33/T 23332021II1前言本標(biāo)準(zhǔn)按GB/T 1.1-2020標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的規(guī)定起草。請注意本標(biāo)準(zhǔn)的某些內(nèi)容可能涉及專利。本標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別這些專利

2、的責(zé)任。本標(biāo)準(zhǔn)由浙江省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出。本標(biāo)準(zhǔn)由浙江省畜牧獸醫(yī)和飼料標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會（ZJQS/TC33）歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：浙江省動物疫病預(yù)防控制中心（浙江省獸藥飼料監(jiān)察所）。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：施杏芬、呂偉軍、阮鑫、張志健、裘丞軍、吳望君、商小金。飼料中 -胡蘿卜素的測定高效液相色譜法范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了飼料中-胡蘿卜素的高效液相色譜測定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于配合飼料、濃縮飼料、精料補(bǔ)充料、添加劑預(yù)混合飼料中-胡蘿卜素的測定。本標(biāo)準(zhǔn)配合飼料、濃縮飼料、精料補(bǔ)充料的定量限為1 mg/kg，添加劑預(yù)混合飼料的定量限為2 mg/kg。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本標(biāo)準(zhǔn)必不可少的

3、條款。其中，注日期的引用文件， 僅該日期對應(yīng)的版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T 6682-2008 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T 20195 動物飼料 試樣的制備術(shù)語和定義本標(biāo)準(zhǔn)沒有需要界定的術(shù)語和定義。原理試樣中-胡蘿卜素經(jīng)堿溶液超聲皂化，生成全反式-胡蘿卜素，經(jīng)石油醚萃取，減壓濃縮后，用高效液相色譜法測定，外標(biāo)法定量。試劑或材料除非另有規(guī)定，僅使用分析純試劑。5.1 水：GB/T 6682-2008，一級。甲醇：色譜純。異丙醇：色譜純。二氯甲烷：色譜純。5.5 石油醚（沸程3060）。正己烷。無水硫酸鈉。乙二胺四乙酸二鈉（E

4、DTA）。2,6-二叔丁基對甲酚（BHT）。L-抗壞血酸乙醇溶液：稱取L-抗壞血酸0.5 g，加4 mL水加熱溶解，用無水乙醇稀釋至100 mL混勻（現(xiàn)配現(xiàn)用）。50%氫氧化鉀溶液：稱取氫氧化鉀50 g，加水100 mL溶解，混勻。DB33/T 23332021DB33/T 23332021 PAGE 6 PAGE 7飽和氯化鈉溶液：先將燒杯中的水煮沸，向沸水中邊攪拌邊加入氯化鈉，直到有固體顆粒析出， 將此溶液冷卻至室溫。標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（500 g/mL）：稱取全反式-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品（CAS：7235-40-7，純度不低于95%）50 mg（精確至0.01 mg）至100 mL棕色容量瓶中，加入

5、10 mL二氯甲烷（5.4）溶解，用二氯甲烷（5.4）稀釋并定容至刻度，混勻，每次臨用前按附錄A標(biāo)定。-20保存，有效期2個月。標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（100 g/mL）：精確移取-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（5.13）10.0 mL于50 mL棕色容量瓶中，加入二氯甲烷（5.4）稀釋并定容。于4保存，有效期為1周。標(biāo)準(zhǔn)系列溶液：精確移取適量-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（5.14）于100 mL棕色容量瓶中，用流動相稀釋定容配成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為0.0g/mL、0.50 g/mL、1.00 g/mL、2.50 g/mL、5.00 g/mL、10.00 g/mL。臨用現(xiàn)配。微孔濾膜：0.45 m，有機(jī)系。儀器設(shè)

6、備高效液相色譜儀：配有紫外檢測器/二極管陣列檢測器。分析天平：感量分別為0.001 g和0.01 mg。超聲波清洗器。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。旋渦儀。分光光度計。樣品按GB/T 20195制備試樣，至少200 g，粉碎使其全部通過0.42 mm孔徑的分析篩，充分混勻，裝入磨口瓶中，避光保存，備用。試驗(yàn)步驟警示應(yīng)避光操作！皂化平行做兩份試驗(yàn)。稱取試樣配合飼料、精料補(bǔ)充料、濃縮飼料2 g5 g或添加劑預(yù)混合飼料0.2 g 1 g，精確至0.001 g，置于250 mL具塞棕色三角瓶，加入 EDTA （5.8）1 g，邊搖邊加入L-抗壞血酸乙醇溶液（5.10）50 mL使試樣完全分散、浸濕，加入10 mL 50

7、%氫氧化鉀溶液（5.11），混勻，50水浴加熱超聲皂化20 min，不時振蕩防止試樣粘附在瓶底和瓶壁上，皂化結(jié)束后取出迅速冷卻至室溫。提取將皂化液轉(zhuǎn)移至盛有 80 mL 石油醚（5.5）的 500 mL 分液漏斗中，用 30 mL50 mL 水分 2 次3 次沖洗棕色三角瓶并入分液漏斗，旋緊瓶塞，輕輕振蕩，放氣，靜置分層。轉(zhuǎn)移水相至另一分液漏斗中， 加入 60 mL 石油醚（5.5）重復(fù)提取兩次，棄去水相，合并三次石油醚相。用 100 mL 飽和氯化鈉溶液（5.12）洗滌石油醚提取液一次，輕輕旋搖防止乳化，棄去水相；再用水洗滌石油醚提取液至中性。石油醚提取液過無水硫酸鈉（5.7）過濾脫水，轉(zhuǎn)移

8、至放有幾粒 BHT（5.9）的 250 mL 棕色容量瓶中，用石油醚（5.5） 定容，搖勻。濃縮從石油醚提取液（8.2）中（V）分取一定體積（V1）于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器燒瓶中，置于 402減壓濃縮至近干，殘渣用流動相 5.00mL（V2）復(fù)溶解，使每毫升含-胡蘿卜素 10 g 以下，旋渦混勻，用 0.45 m 濾膜（5.16）過濾備用。測定色譜條件色譜柱：SB-C18柱，柱長250 mm，內(nèi)徑4.6 mm，粒徑5.0 m，或性能相當(dāng)者。流動相：甲醇+異丙醇+二氯甲烷=80+17+3。流速：1.5 mL/min。8.4.1.4 柱溫：30。進(jìn)樣量：20 L。檢測波長：450 nm。標(biāo)準(zhǔn)系列溶液和試樣溶液

9、測定在儀器的最佳條件下，分別取標(biāo)準(zhǔn)系列溶液（5.15）和試樣溶液（8.3）上機(jī)測定。-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)溶液的液相色譜圖見附錄。定性以保留時間定性，試樣溶液中-胡蘿卜素保留時間應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中-胡蘿卜素的保留時間一致，其相對偏差在2.5之內(nèi)。定量以-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中的濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)應(yīng)不低于0.999。試樣溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液中-胡蘿卜素的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測的線性范圍內(nèi)，如超出線性范圍，應(yīng)將試樣提取液用流動相稀釋（稀釋倍數(shù)n）至線性范圍內(nèi)，重新測定。單點(diǎn)校準(zhǔn)定量時，試樣溶液中-胡蘿卜素的濃度與標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度相差不超過30%。試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理計算試樣中

10、-胡蘿卜素的含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計。多點(diǎn)校準(zhǔn)按公式（1）計算，單點(diǎn)校準(zhǔn)按公式（2）計算：W C V V2 1000 n（1）V1 m 1000式中:W試樣中-胡蘿卜素的含量，單位為毫克每千克（mg/kg）；C 從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的試樣溶液中-胡蘿卜素的濃度，單位為微克每毫升（g/mL）；V 試樣提取溶液的總體積，單位為毫升（mL）；V1 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時所用試樣提取液的體積，單位為毫升（mL）；V2 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后復(fù)溶液的體積，單位為毫升（mL）；m 試樣質(zhì)量，單位為克（g）；n 超出線性范圍后，需要進(jìn)一步稀釋的倍數(shù)。式中：W A Cs V V2 1000 n As V1 m 1000（2）W試樣中-胡蘿卜素的含

11、量，單位為毫克每千克（mg/kg）；A 試樣溶液中-胡蘿卜素的峰面積；AS標(biāo)準(zhǔn)溶液中-胡蘿卜素的峰面積；CS標(biāo)準(zhǔn)溶液中-胡蘿卜素的濃度，單位為微克每毫升（g/mL）； V 試樣提取溶液的總體積，單位為毫升（mL）；V1 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時所用試樣提取液的體積，單位為毫升（mL）；V2 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后復(fù)溶液的體積，單位為毫升（mL）；m 試樣質(zhì)量，單位為克（g）；n 超出線性范圍后，需要進(jìn)一步稀釋的倍數(shù)。結(jié)果的表示測定結(jié)果用平行測定的算術(shù)平均值表示，計算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。精密度在重復(fù)性條件下，兩次獨(dú)立測定結(jié)果與其算術(shù)平均值的絕對差值不大于該算術(shù)平均值的10%。附 錄 A（規(guī)范性）標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液濃度標(biāo)定方法取-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液(濃度約為500 g/mL)10 L,注入含3.0 mL正己烷（5.6）的比色皿中, 混勻。比色皿厚度為1 cm,以正己烷（5.6）為空白,用分光光度計進(jìn)行測定，入射光波長為450 nm,測定其吸光度值,平行測定3次，取均值。溶液濃度按式(A.1)計算:X A 3.01（A.1）式中:E0.01X-胡蘿