基因的重組與轉(zhuǎn)移ppt課件

1、外源DNA載體DNA重組分子原核細(xì)胞真核細(xì)胞擴(kuò)增或表達(dá)表達(dá)銜接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)電穿孔或顯微注射受體細(xì)胞第六章 基因的重組與轉(zhuǎn)移 第一節(jié) 重組DNA分子的構(gòu)建一、基因重組概念利用限制性內(nèi)切酶和其他一些酶類，切割和修飾載體DNA和目的基因，將兩者銜接起來，再轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，以期這種外源性的目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)得到正確表達(dá)。二、基因重組的思索要素實(shí)驗(yàn)步驟簡(jiǎn)單易行，銜接效率較高，易于重組子挑選2. 可以回收插入的外源基因3. 外源基因必需在表達(dá)載體DNA的控制下，并置于正確的閱讀框架內(nèi)，以便目的基因的正確表達(dá)三、表達(dá)載體DNA理想的酶切位點(diǎn)應(yīng)該符合下面幾個(gè)條件1. 載體上特定的酶切位點(diǎn)盡能夠少最好是單一酶切位

2、點(diǎn)2. 酶切位點(diǎn)之前要有一個(gè)較強(qiáng)的啟動(dòng)子高效表達(dá)一粘性末端的銜接DNA銜接酶把相互接近的5端磷酸與3-OH連到一同四、 載體DNA與外源基因片段的銜接1. 兩段DNA的銜接依托粘性末端2. DNA片段與載體的銜接依托粘性末端ligasenick(二)平齊末端blunt end的銜接5端與3端并列接近的時(shí)間太短，不容易被銜接酶銜接。1. 直接銜接T4DNA銜接酶雖然能銜接平末端，但效率很低，只需粘性末端的1%。55553333-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-53-OH-PP-HO-531同聚加尾法 2. 人工加尾構(gòu)成 “粘性末端DNA末端轉(zhuǎn)移酶能在沒有模板的情況下給DNA的3-OH端加上

3、脫氧核苷酸。原理：分別給載體和插入片斷加上互補(bǔ)的核苷酸。加尾堿基互補(bǔ)缺陷：優(yōu)點(diǎn)：能把任何片段銜接起來不能把插入片段再切下來。非酶切位點(diǎn)用T4 DNA銜接酶連到平端DNA上，然后再用酶切，構(gòu)成一個(gè)人工粘性末端。2銜接子(linker)銜接 linker用化學(xué)合成法合成的一段8-12bp的特定限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)序列的平端雙鏈。GGAATTCCCCTTAAGGEcoRI linker： linker的作用 缺陷：1可以用內(nèi)切酶把插入片段切下來。假設(shè)插入片段內(nèi)部也有該酶位點(diǎn)，不能切下完好的插入片段2能給載體銜接上Polylinker:優(yōu)點(diǎn)：3DNA接頭 (adapter)銜接法1978年康內(nèi)爾大學(xué)的

4、吳瑞教授發(fā)明。5p-GATCCCGG-OH3 GGCC-p5BamHI adapter用T4DNA銜接酶連到DNA分子的兩端，直接成為人工粘性末端。 adapter一頭平末端、另一頭粘性末端某種酶切位點(diǎn)序列。 adapter的作用Blunt-ended DNA5p-GATCCCGG-OH3 HO-GGCC-p5BamHI adapterP-P5p-GATCCCGG- GGCC-CCGG-GGCCCTAG-P55p-GATCCCGG- GGCC-CCGGGGCCCTAG-P5CCGGGATCCCGG-OHGGCCCTAGGGCC-P5接頭自我銜接接頭與接頭會(huì)彼此以粘性末端接在一同，影響與DNA片

5、段的銜接。優(yōu)點(diǎn)：連上后就能用。缺陷：先用小牛腸堿性磷酸酶CIP處置接頭，水解掉其5端的磷酸，防止自我銜接。以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。防止自我銜接5p-GATCCCGG-OH HO-GGCC-P P-CCGG-OHHO-GGCCCTAG-P5 CCGGGATCCCGG-OHHO-GGCCCTAGGGCC5接頭之間不能構(gòu)成磷酸二酯鍵自我銜接！ 5GATCCCGG-OH HO-GGCC5 5CCGG-OHHO-GGCCCTAG5CIP處置-OHHO-Blunt-ended DNA5p-GATCCCGG-OH3 HO-GGCC-p5BamHI adapterP-P 5GATCCCGG- HO-

6、GGCC CCGG-OH-GGCCCTAG55GATCCCGG-OH3 HO-GGCC5缺口缺口HO-OHCIP處置T4 ligase雖然有缺口，但依然能與DNA片斷銜接。(三)PCR產(chǎn)物的銜接1. 在引物的5端設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)符合載體的多克隆位點(diǎn)；1設(shè)計(jì)原那么2帶酶切位點(diǎn)的引物的構(gòu)造3端1520bp與模板互補(bǔ)；5端610bp是某個(gè)內(nèi)切酶的識(shí)別序列。5端多余的35bp屬維護(hù)堿基防止與所擴(kuò)增的DNA片斷內(nèi)部酶切位點(diǎn)反復(fù)。引物1GCAGAATTC互補(bǔ)序列模板EcoRI位點(diǎn)5-3GCAGAATTC互補(bǔ)序列5-33模板GCAGAATTC互補(bǔ)序列 PCR產(chǎn)物5-33復(fù)性延伸模板模板33GCTAGCCGG互補(bǔ)

7、序列模板BamH I 位點(diǎn)-53-5復(fù)性延伸模板模板33GCTAGCCGG互補(bǔ)序列-53-模板5GCTAGCCGGPCR產(chǎn)物 互補(bǔ)序列-53-引物2帶酶切位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物GCAGAATTCPCR產(chǎn)物5-3GCTAGCCGGPCR產(chǎn)物-53-CGTCTTAAGCGATCGGCCEcoRI位點(diǎn)BamHI位點(diǎn)AATTCPCR產(chǎn)物5-3GCTAGPCR產(chǎn)物-53-GCEcoRIBamHI兩頭各有一個(gè)粘性末端！2. 與T載體直接銜接1PCR產(chǎn)物兩個(gè)3端普通都有一個(gè)ATaq DNA聚合酶的特性：在DNA雙鏈的3端再加上一個(gè)多余的核苷酸優(yōu)先加A。2T載體的兩個(gè)3端人為地各加一個(gè)T利用Taq DNA聚合酶，當(dāng)

8、原料中只需dTTP時(shí)，被迫在平端載體上添加T！AAdNTPTTdTTPTaq DNA聚合酶載體PCR產(chǎn)物TATA(四)DNA體外銜接應(yīng)留意的事項(xiàng)插入片斷與載體的酶切位點(diǎn)互補(bǔ)一樣的粘性末端才干有效地銜接。盡量防止平端銜接。決不能進(jìn)展非粘性末端銜接。EcoRIEcoRIEcoRI1用一樣的酶切2用同尾酶切BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII都產(chǎn)生GATC4個(gè)堿基的粘性末端。2. DNA插入的方向正確1用雙酶切由于產(chǎn)生的粘性末端不同，只能以固定方向銜接。EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI3. 插入基因的開放閱讀框ORF正確1DNA定向插入2起始密碼尤其

9、當(dāng)載體上有ATG起始密碼的時(shí)候，更要留意。ATGGAATTC載體ATGCGGAATTCT插入片斷EcoRIEcoRIATGGAATTC T重組但移碼突變！4. 防止載體本身環(huán)化銜接1提高插入片斷的用量銜接反響體系中，插入片斷比載體多10倍以上。2用堿性磷酸酶處置載體載體切口的5磷酸被除去，不能自我銜接。但可以與插入片斷以單鏈銜接。53載體插入片斷4運(yùn)用同尾酶產(chǎn)生的粘性末端銜接方法酶切反響后不用將核酸內(nèi)切酶失活再進(jìn)展銜接反響3采用同聚物加尾銜接技術(shù)線狀DNA分子的兩個(gè)3-OH末端具有同樣的堿基構(gòu)造1. 載體本身環(huán)化銜接能存活2. 載體之間相互銜接能存活3. 插入片段相互銜接不能存活4. 一個(gè)載體

10、與幾個(gè)插入片段重組能存活(五)載體和外源DNA插入片段的銜接結(jié)果5. 幾個(gè)載體與一個(gè)插入片段重組能存活171. 目的添加受體菌細(xì)胞膜的通透性。第二節(jié) 重組體導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞一、感受態(tài)大腸桿菌的制備什么是感受態(tài)？就是細(xì)菌吸收轉(zhuǎn)化因子的生理形狀。運(yùn)用喪失了限制體系的大腸桿菌；具有與重組體互補(bǔ)的遺傳性狀；重組整合缺陷型。2. 菌種用低滲CaCl2溶液在低溫時(shí)處置快速生長(zhǎng)的細(xì)菌，此時(shí)細(xì)菌膨脹成球形，外源DNA分子在此條件下易構(gòu)成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附在細(xì)菌外表，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)DNA的吸收。 3. 制備原理4. 制備過程培育大腸桿菌OD600至0.3-0.4On ice 30 min4離心搜集菌用冰

11、冷的0.01MCaCl2重懸4離心搜集菌分裝、-70 凍存On ice 20 min用冰冷的0.01MCaCl2重懸二、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌1轉(zhuǎn)化transformation)大腸桿菌捕獲質(zhì)粒DNA的過程。2轉(zhuǎn)染transfection)大腸桿菌捕獲噬菌體DNA的過程。1. 外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌的幾種方法3轉(zhuǎn)導(dǎo)transduction)借助噬菌體把外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌的過程。2. 轉(zhuǎn)化率每gDNA轉(zhuǎn)化勝利的細(xì)菌克隆數(shù)。3. DNA分子的轉(zhuǎn)化過程 吸附:完好的雙鏈DNA吸附在受體菌外表 轉(zhuǎn)入:雙鏈DNA分子解鏈 單鏈DNA進(jìn)入受體菌,另一鏈降解 自穩(wěn):單鏈DNA在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制成雙鏈環(huán)狀 表達(dá):外源基

12、因同復(fù)制子同時(shí)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯4. 轉(zhuǎn)化方法 簡(jiǎn)單，但轉(zhuǎn)化效率不高106-108/gDNA。1熱休克法heat shock轉(zhuǎn)化效率高高于109/gDNA。2電轉(zhuǎn)化法50ng載體DNA100L感受態(tài)菌On ice混合，靜置30分鐘42C 90秒?yún)⑴c800 L LB培育基37搖45min10-100L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板吸附DNA攝入DNA1熱休克法LB培育受體菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分鐘，2 離心集菌冰冷的水重懸菌體2 離心集菌冰冷的水重懸菌體2 離心搜集菌體少量冰冷的水重懸分裝成50-300L電轉(zhuǎn)儀調(diào)為2.5kV,25F脈沖控制器200-4000.5g質(zhì)粒DNAOn ice混合

13、參與1mLSOC培育液37 中速震蕩60分鐘10-100L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板轉(zhuǎn)化2電轉(zhuǎn)化法5. 平板培育基培育細(xì)菌10-100L轉(zhuǎn)化液涂于含抗菌素的平板37過夜環(huán)形重組質(zhì)粒質(zhì)粒自我銜接線性載體或DNA片段進(jìn)入細(xì)菌會(huì)被降解。環(huán)形質(zhì)粒數(shù)1重組質(zhì)粒 6. 影響轉(zhuǎn)化率的要素生長(zhǎng)形狀制備感受態(tài)菌必需運(yùn)用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌。必需在冰冷的條件下制備。要充分，使細(xì)菌細(xì)胞膜失去一些蛋白。儲(chǔ)存感受態(tài)菌要在-70以下CaCl2處置運(yùn)用感受態(tài)菌時(shí)必需迅速融化融化后普通不能再次凍存運(yùn)用。2感受態(tài)細(xì)胞 competent cells) 把重組的噬菌體DNA或Cosmid質(zhì)粒DNA包裝成具有感染才干的噬菌體顆粒。7. 體外

14、包裝的噬菌體的轉(zhuǎn)導(dǎo)1體外包裝in vitro packaging 2轉(zhuǎn)導(dǎo)transduction經(jīng)過受體菌細(xì)胞外表的DNA接受器位點(diǎn)receptor site)，使帶有外源基因的重組體DNA注入受體大腸桿菌進(jìn)展擴(kuò)增。cI857基因是個(gè)溫度敏感性阻遏蛋白基因，感染細(xì)菌后，在32下培育細(xì)菌時(shí)可以堅(jiān)持溶源性。但當(dāng)溫度升高到4445時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致cI基因編碼的阻遏蛋白失活，DNA復(fù)制、外殼蛋白合成。便于提取外殼蛋白。3cI857基因突變的噬菌體 但由于該噬菌體的S基因上有一個(gè)突變，所以細(xì)菌還不裂解。cI857其它基因溶源形狀DNA不轉(zhuǎn)錄、不翻譯DNA阻遏蛋白阻遏蛋白4445DNA轉(zhuǎn)錄、翻譯合成外殼蛋白32噬菌體1外殼蛋白基因E發(fā)生了無義突變，不能合成頭部蛋白，但能合成其它外殼蛋白尾部蛋白。在cI857基因突變的噬菌體的根底上，選擇兩種外殼蛋白的突變型噬菌體。4 互補(bǔ)型噬菌體 外殼蛋白基因D發(fā)生了無義突變，不能合成頭部的包裝識(shí)別蛋白，但能合成其它外殼蛋白頭部、尾部蛋白。噬菌體2(5) 體外包裝過程 體外包裝好的重組噬菌體感染受體菌，使受體菌發(fā)生溶菌，構(gòu)成噬