微生物檢驗技術(shù)介紹和其應(yīng)用

1、微生物檢驗技術(shù)介紹和其應(yīng)用簡 介微生物鑒定分型技術(shù)在檢驗中的應(yīng)用 微生物檢驗技術(shù)介紹一二微生物主要來源土壤：微生物的百花園水：污染源 途徑空氣：干燥 過路客人和動物加工環(huán)節(jié)一、微生物檢驗技術(shù)介紹食品安全的主要因素 關(guān)注歐洲104：4型腸出血性大腸桿菌疫情西班牙阿爾梅里亞省和馬拉加省的兩家出口商受其感染后，患者會出現(xiàn)腹部絞痛和腹瀉，尿毒癥死亡德國疾病控制機(jī)構(gòu)疫情的源頭精確至芽苗類蔬菜中的豆芽。由于發(fā)豆芽作坊衛(wèi)生條件不佳，豆芽受污染，加上一些人喜好在蔬菜沙拉中拌入生豆芽，致使病菌直接進(jìn)入人體消化道。食品安全和微生物專家同一天說，其實，錯不在豆芽，而在人們不健康的飲食習(xí)慣。盡管一些蔬菜外表光鮮，實際

2、卻暗藏殺機(jī)。對多數(shù)蔬菜而言，煮食才健康。 公報說，德國104：4型大腸桿菌疫情暴發(fā)目前已可得到解釋，其原因很可能是從埃及進(jìn)口的胡蘆巴種子被大腸桿菌污染，消費(fèi)者食用德國企業(yè)用這些種子培育的芽苗菜后導(dǎo)致感染。此外還有人際接觸造成的感染病例。德國健康部門稱，目前還不能排除其他種子由于產(chǎn)地不衛(wèi)生的生產(chǎn)環(huán)境而被污染的可能性。同時中間商在清洗、混合和包裝不同種子時也可能造成病菌污染其他種子。因此，健康部門要求消費(fèi)者不要生食各種市場上供應(yīng)的或自培的芽苗菜。消費(fèi)者還被告誡應(yīng)將尚存的芽苗菜種子清入垃圾箱。目前，分管食品安全的聯(lián)邦風(fēng)險評估研究所還在評估芽苗菜之外其他由胡蘆巴種子加工的產(chǎn)品中是否帶菌，原因是胡蘆巴種

3、子還經(jīng)常被用作佐料或入藥。新華網(wǎng)開羅7月6日電（記者李來房馮康）埃及農(nóng)業(yè)檢疫部門6日發(fā)表聲明，否認(rèn)埃及出口的葫蘆巴種子是歐洲腸出血性大腸桿菌疫情的源頭。埃及農(nóng)業(yè)部網(wǎng)站當(dāng)天刊登聲明說，埃及當(dāng)局對相關(guān)出口商庫存的葫蘆巴種子進(jìn)行了抽樣檢測，所有結(jié)果均為腸出血性大腸桿菌陰性。聲明稱，埃及2009年出口到歐洲的葫蘆巴種子都通過了各國衛(wèi)生檢疫機(jī)構(gòu)的檢查，當(dāng)時并未檢測出這一污染，而且2009年11月出口的葫蘆巴種子是干種子，這種細(xì)菌在干燥表面上不可能存活到今年6月。聲明認(rèn)為，若懷疑葫蘆巴種子遭到腸出血性大腸桿菌污染，這可能與再包裝或用來泡芽的水等處理環(huán)節(jié)有關(guān)。聲明稱，埃及國內(nèi)沒有腸出血性大腸桿菌病例的報告，

4、埃及的種子是安全的，向歐洲出口蔬菜種子的絕大多數(shù)埃及出口商都非常重視整個供應(yīng)鏈的衛(wèi)生要求。歐洲食品安全署5日發(fā)布報告稱，在德國和法國暴發(fā)的腸出血性大腸桿菌疫情的源頭很有可能是從埃及進(jìn)口的葫蘆巴種子。歐盟委員會負(fù)責(zé)衛(wèi)生與消費(fèi)者事務(wù)的委員約翰達(dá)利表示：“報告發(fā)布后我們便著手從市場上回收從埃及進(jìn)口的種子并暫時禁止從埃及進(jìn)口相關(guān)品種?！备鶕?jù)德國主管傳染病防控的羅伯特科赫研究所5日公布的疫情通報，德國自兩個月前暴發(fā)腸出血性大腸桿菌疫情至今，已累計出現(xiàn)4086例感染病例，共有48人死亡。本月2日法國也宣布出現(xiàn)首例感染腸出血性大腸桿菌死亡病例。 一、微生物檢驗技術(shù)介紹檢測技術(shù)的重要性革蘭氏染色鏡鑒按照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)

5、行傳統(tǒng)的生化反應(yīng)鑒定API試劑條菌鑒定國際金標(biāo)準(zhǔn) 半自動細(xì)菌鑒定儀（ATB Expression） 全自動細(xì)菌鑒定儀（VITEK 2）微生物鑒定 Mini VIDAS篩選系統(tǒng)免疫凝集/免疫沉淀實驗微生物檢測 實時熒光定量PCR色譜、光譜分析技術(shù)分子生物學(xué)技術(shù)一、微生物檢驗技術(shù)介紹 傳統(tǒng)篩選系統(tǒng)一、微生物技術(shù)介紹微生物的鑒定及其分型技術(shù)1.2 微生物的檢測技術(shù)1.1微生物的檢測技術(shù)c) 酶聯(lián)免疫熒光技術(shù)d) 實時熒光定量PCRe) 免疫磁珠技術(shù)b) 乳膠凝集反應(yīng)a) 常規(guī)培養(yǎng)鑒定法顯色培養(yǎng)基法顯色培養(yǎng)基顯色培養(yǎng)基檢測基本原理：利用不同種屬細(xì)菌代謝所產(chǎn)生的酶的特異性，在培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的特異性酶底

6、物和抑制劑，當(dāng)具有某特異酶的細(xì)菌與酶底物作用時，使顯色基團(tuán)游離出來附著于菌落上，形成顏色獨(dú)特的菌落。根據(jù)菌落的顏色直接對菌屬（種）作出鑒定。GB4789-2008、2010中新技術(shù)的應(yīng)用-顯色培養(yǎng)基沙門氏菌志賀菌副溶血性弧菌O157：H7大腸埃希菌單增李斯特菌阪崎腸桿菌大腸桿菌計數(shù)顯色培養(yǎng)基的優(yōu)勢快速、簡便、節(jié)省時間-大多數(shù)顯色培養(yǎng)基只需在樣品增菌后，分離培養(yǎng)1824h，即可根據(jù)菌落的顏色作出初步的鑒定。（陰性-棄去；陽性-進(jìn)一步鑒定）。結(jié)果直觀，一目了然（根據(jù)顏色判定結(jié)果）。靈敏度高、特異性強(qiáng)，大大減少了后續(xù)的鑒定步驟（確證試驗）。顯色培養(yǎng)的缺陷假陽性： 97%的大腸埃希菌含有-葡萄糖苷酶，

7、約10%的沙門氏菌屬中也含有此酶。假陰性： O157：H7大腸埃希菌沒有-葡萄糖苷酶，在MUG-LST上呈陰性反應(yīng)。 不是所有具有特征性酶的微生物均在含底物的培養(yǎng)基中呈陽性反應(yīng)。提示：這是任何選擇性培養(yǎng)基都無法避免的問題。與普通選擇性培養(yǎng)基比較，顯色培養(yǎng)基的假陽性、假陰性的機(jī)率相對要低得多。乳膠凝集反應(yīng)原理：乳膠凝劑試驗是以乳膠微粒為載體的間接凝集試驗。用人工方法將抗體包被于與免疫無關(guān)的大分子聚苯乙烯或羧化聚苯乙烯乳膠顆粒上。利用抗原抗體特異性結(jié)合的特性，當(dāng)敏感的乳膠顆粒與待檢細(xì)菌菌懸液混合后，迅速形成肉眼可見的凝集團(tuán)塊，用于篩選可疑菌。乳膠凝集試驗的優(yōu)勢特異、敏感；操作簡便、快速；結(jié)果易判讀

8、；陰性預(yù)測值高。常用Microgen乳膠凝集試驗盒李斯特菌（listeria）沙門氏菌（salmonella）彎曲桿菌（camylobacter）大腸桿菌O157（E.coli O157）軍團(tuán)菌（legionella）葡萄球菌（staph）觀察凝集結(jié)果全自動熒光免疫分析儀(VIDAS-mini或30) 檢測項目：食品及環(huán)境中常見致病性細(xì)菌（李斯特菌屬、單核增生李斯特菌、彎曲菌屬、大腸埃希菌O157、沙門氏菌屬、葡萄球菌腸毒素檢測）的快速篩檢全自動熒光免疫分析儀(VIDAS) 原理：以免疫技術(shù)捕獲目標(biāo)微生物，應(yīng)用酶聯(lián)免疫法，最后測藍(lán)色熒光（ELFA）。包被針上有抗體包被，所測得的熒光與標(biāo)本中抗原

9、的含量成正比。特點(diǎn)：結(jié)果準(zhǔn)確：對每個標(biāo)本做兩次免疫反應(yīng)，保證結(jié)果的可靠。靈敏度比可見光方法高出1000倍。已獲得美國FDA、日本厚生省、AOAC、USDA、中國進(jìn)出口商品檢驗局等政府及權(quán)威機(jī)構(gòu)認(rèn)可。可同時進(jìn)行12個相同或不同的測試。每天進(jìn)行約6080項測試特異性強(qiáng)：標(biāo)本不需分離出目標(biāo)微生物即可上機(jī)檢測。避免交叉污染：沒有采樣針，避免標(biāo)本之間交叉污染；樣品不與儀器接觸，儀器內(nèi)沒有抽吸樣品的管路，杜絕了標(biāo)本對環(huán)境的污染熒光定量PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR）是分子生物學(xué)技術(shù)最具有代表性的技術(shù)。它是一種能在體外將微量生物DNA分子進(jìn)行數(shù)百萬倍放大的新型檢測技術(shù)。熒光定量PCR技術(shù)在普通PCR技術(shù)基

10、礎(chǔ)上，通過熒光染料的結(jié)合，將檢測信號進(jìn)一步放大，其靈敏度是普通PCR的幾百倍，擴(kuò)增和檢測過程由儀器自動完成，檢測同量高，速度快除去樣品前增菌時間，2-4小時內(nèi)可得到檢測結(jié)果微生物檢測限可能達(dá)到1 copy，抗雜菌干擾能力強(qiáng) 免疫磁珠技術(shù)由于受到抽樣數(shù)量、檢驗方法和試驗取樣量的限制，無法將全部樣品進(jìn)行檢查。磁珠分離技術(shù)，能簡單快速地捕捉特異的蛋白、遺傳物質(zhì)和其他生物分子。通過免疫磁珠富集手段，將微量的目標(biāo)物質(zhì)通過磁珠富集到可檢測的水平。這一技術(shù)不僅可應(yīng)用于致病微生物的檢測，還可用于食品中致敏原蛋白質(zhì)、核酸以及各類細(xì)菌毒素的富集，應(yīng)用范圍廣闊，適宜高通量、全自動操作。Principle: Immu

11、nomagnetic Microparticle Separation/Concentration of Bacterial CellsNBioLumixTM微生物實時快速檢測系統(tǒng)是最新推出的用于食品、保健品、乳制品、肉制品、飲料、化妝品、洗化產(chǎn)品和制藥等工業(yè)領(lǐng)域和監(jiān)管部門等使用的微生物快速檢測系統(tǒng)?？梢钥焖俅_定樣本中細(xì)菌總數(shù)、大腸菌群/大腸桿菌、致病菌、霉菌等的存在與數(shù)量。BioLumixTM實時快檢系統(tǒng)-簡便、快速并可降低微生物試驗的操作成本。-裝有增菌培養(yǎng)基和指示劑的檢測管。-數(shù)小時內(nèi)得到檢測結(jié)果（而非數(shù)天）-結(jié)果易解釋并自動傳輸?shù)叫枰焖侔l(fā)運(yùn)安全產(chǎn)品的地方。-非微生物專業(yè)技術(shù)人員也能夠

12、操作?？蓹z測的項目:大腸菌群 大腸桿菌 腸桿菌科 革蘭氏陰性菌 乳酸菌 酵母菌和霉菌 假單胞菌 蠟樣芽胞桿菌 葡萄球菌沙門氏菌衛(wèi)生監(jiān)控 保質(zhì)期預(yù)測腐敗菌檢測 無菌檢驗 挑戰(zhàn)實驗微生物限定檢測 嗜熱菌計數(shù) 嗜冷菌計數(shù)抗生素殘留檢測生物體可以在BioLumix儀器中進(jìn)行孵育，孵育溫度可以在15C到60C的范圍內(nèi)預(yù)先設(shè)定，以使各種菌株都能獲得最佳的生長條件。 檢測原理BioLumixTM專利的完整檢測的基礎(chǔ)是：使用新開發(fā)的染色技術(shù)檢測生物體的代謝過程。這一技術(shù)通過將染色、新的光源和光傳感器相結(jié)合，能夠用同一個檢測器同步檢測顏色和熒光的變化。當(dāng)代謝過程發(fā)生時，試劑的光譜模式會發(fā)生改變。光傳感器可檢測到

13、這些改變，并以預(yù)先設(shè)定的時間間隔進(jìn)行監(jiān)控。BioLumixTM的靈敏度和檢測范圍 靈敏度為每個樣本管內(nèi)一個細(xì)菌或真菌的活細(xì)胞。 一個細(xì)菌通?？稍?-14個小時內(nèi)檢出 一個酵母菌可在20-24個小時內(nèi)檢出；菌數(shù)越多，檢測時間越短盡管系統(tǒng)可以檢出少至每管一個細(xì)胞，但是生物體必須首先要增長到超過預(yù)先確定的明確的檢測閾值。 -細(xì)菌的檢測閾值為每毫升100,000個細(xì)胞（105/ml）； -酵母菌/霉菌的檢測閾值為每毫升10,000的細(xì)胞（104/ml） 檢測時間取決于樣品中微生物的初始濃度。污染程度越高的樣本檢測得越快，并可迅速發(fā)出污染警告。 如果樣品中細(xì)菌總數(shù)初始濃度為每毫升100,000個細(xì)胞 （

14、105/ml）， 則檢測僅需4個小時左右！ 一、微生物技術(shù)介紹微生物的鑒定及其分型技術(shù)1.2 微生物的檢測技術(shù)1.1細(xì)菌分型的定義不同種屬細(xì)菌間的差異細(xì)菌分型是指通過一定的實驗方法對屬于同一種或亞種的細(xì)菌分離株進(jìn)行遺傳特征分析，并結(jié)合分離株的流行病學(xué)資料，闡明被分析株間的遺產(chǎn)關(guān)系傳統(tǒng)的微生物鑒別c) 生化測試d) 基于多糖的分子分型技術(shù)b) 血清分型a) 顯微鏡觀察革蘭氏染色e) 基于蛋白的分子分型技術(shù)f) 基于DNA的分子分型技術(shù)微生物的鑒定及其分型技術(shù)現(xiàn)代的 微生物 鑒別 血清學(xué)鑒定原理：細(xì)菌的抗原與抗體在一定條件下可產(chǎn)生凝集反應(yīng)，形成肉眼可見的顆?；虺恋?。多用于細(xì)菌菌屬或?qū)賰?nèi)種的鑒定。培

15、養(yǎng)基：一般使用1.5%的瓊脂斜面作純培養(yǎng)，取培養(yǎng)基（抗原）作玻片凝集試驗。GB4789中的血清學(xué)鑒定沙門菌（A-F多價血清）；志賀菌（志賀菌多價血清）；致瀉性大腸埃希菌（EPEC、EIEC 、 ETEC多價血清）大腸埃希菌O157：H7/NM（O157、H7血清）副溶血性弧菌（O、K血清）；小腸結(jié)腸炎耶爾森菌。生化鑒定API試劑條菌鑒定國際金標(biāo)準(zhǔn)無需專用儀器，標(biāo)準(zhǔn)化手工方法完成細(xì)菌的生化鑒定，為低成本替代傳統(tǒng)手工細(xì)菌生化鑒定的最佳產(chǎn)品。特點(diǎn)：完整的鑒定譜：15種試條，可鑒定的細(xì)菌多于550種簡單方便：標(biāo)準(zhǔn)化方法，成本低廉，判讀結(jié)果簡單快速結(jié)果：4-24小時。生化鑒定半自動細(xì)菌鑒定儀（ATB E

16、xpression）檢測項目：可鑒定由環(huán)境、原料及制成品分離出的菌種和藥敏試驗（包括：腸桿菌、非發(fā)酵G（-）桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、酵母菌、厭氧菌）。可鑒定770種細(xì)菌和分析近80種抗生素藥敏實驗。原理：鑒定試條包含風(fēng)干底物的反應(yīng)孔，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)濁度的菌液活化，于指定溫度培養(yǎng)4小時/24小時后即可。計算機(jī)根據(jù)閱讀器檢測到的結(jié)果自動調(diào)用相應(yīng)試劑條數(shù)據(jù)庫，得出生化/同化結(jié)果和藥敏試驗結(jié)果。系統(tǒng)將所得編碼跟數(shù)據(jù)庫的典型菌株生化譜比較，以客觀的2個參數(shù)（鑒定百分率及T-值）計算鑒定結(jié)果特點(diǎn)：速度快捷ATB Expression提供自動化接種，閱讀及分析試條結(jié)果。準(zhǔn)確可靠的結(jié)果ID 32及快速ID 32 試條

17、由金牌標(biāo)準(zhǔn)API試條改良而成，配合自動化概念，結(jié)合成完整的細(xì)菌鑒定系統(tǒng)生化鑒定半自動細(xì)菌鑒定儀（ATB Expression）生化鑒定全自動細(xì)菌鑒定儀（VITEK 2）檢測項目：根據(jù)需要鑒定的微生物的種類的不同，設(shè)計了不同的鑒定卡片，比如革蘭氏陰性菌卡，革蘭氏陽性菌卡，酵母菌卡等?？设b定405種細(xì)菌，70多種藥物約50多種藥物組合的藥敏卡。生化鑒定全自動細(xì)菌鑒定儀（VITEK 2）原理：儀器的原理其實就是我們進(jìn)行細(xì)菌鑒定中使用的生化反應(yīng)。儀器把30個對細(xì)菌鑒定必需的生化反應(yīng)培養(yǎng)基固定到卡片上，然后通過培養(yǎng)后儀器對顯色反應(yīng)進(jìn)行判斷，利用數(shù)值法進(jìn)行判定。特點(diǎn)：快速：鑒定結(jié)果平均只需4-6小時。對與

18、快速生長細(xì)菌(大腸埃希氏、糞腸球菌、變形桿菌、克雷伯氏菌等)鑒定可提前到2小時。操作簡便：全部操作自動化，簡單而方便資料處理：bioLIAISON軟件集中管理實驗室資料獲得AOAC 國際認(rèn)證：保證提供的微生物鑒定結(jié)果是公認(rèn)的a) 近紅外傅立葉光譜分析b) 色譜分析物質(zhì)成分分析基于蛋白質(zhì)、多糖的分子分型技術(shù)近紅外傅立葉光譜分析FT-IR技術(shù)以未損傷細(xì)胞的FT-IR光譜的特殊指紋區(qū)為基礎(chǔ)，光譜反映的是整個細(xì)胞組成分子的振動特征，也就是蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)的特征由于這些細(xì)胞組分與基因表達(dá)有關(guān)，反應(yīng)了全細(xì)胞組分的綜合信息所得圖譜有效地反映了細(xì)胞表型和基因型信息，從而區(qū)分生化信息上的差別德國Bruker公

19、司微生物FT-IR分析用戶手冊主要采用1200-900cm-1，3000-2800cm-1，1500-1400cm-1譜段組合進(jìn)行微生物判別分析，這3個譜段分別主要代表了微生物細(xì)胞壁多聚糖、細(xì)胞膜脂肪酸以及細(xì)胞質(zhì)膜蛋白質(zhì)和類脂成分的信息。色譜分析微生物中含有的一些稱為生物標(biāo)志物的化學(xué)物質(zhì)，其含量或結(jié)構(gòu)具有種屬特征或與其分類位置密切相關(guān)通過分析微生物的化學(xué)組成鑒定微生物，開辟了一個微生物檢測和鑒定的新途徑高效液相色譜(High - performance liquid chromatography，HPLC)氣相色譜(Gas chromatography，GC)氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(Gas chro

20、matography - mass spectrometry，GC-MS)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)建立各種生物標(biāo)志物在微生物中分布情況的數(shù)據(jù)庫及相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)分析程序，仍然是色譜分析微生物的主要方向基于蛋白質(zhì)反而分型方法MALDI-TOF MS原理是離子在電場作用下加速通過飛行管道，記錄離子到達(dá)檢測器的飛行時間測定離子化生物分子的質(zhì)荷比可以得到相關(guān)分子的質(zhì)量飛行時間質(zhì)量分析器MALDI-TOF MS 工作流程基于DNA的分子分型技術(shù)a) 16S rDNA分型b) 核糖體分型（RiboPrinter）d) 多位點(diǎn)序列分析 (MLST)c) 脈沖場電泳技術(shù)（PFGE）e) 多位點(diǎn)重復(fù)序列

21、分析 (MLVA)DNA測序技術(shù)DNA測序技術(shù)可以將生物的遺傳信息完整的破譯出來，通過直接比較不同類群個體同源核酸的核苷酸排列順序，獲得生物進(jìn)化、變異的詳細(xì)信息如細(xì)菌的16S r DNA和真菌的ITS序列，已經(jīng)被廣泛測定應(yīng)用于菌種鑒定研究之中國際通用數(shù)據(jù)庫NCBI-GenBank16S rDNA分型已有擴(kuò)增16S rDNA基因序列的通用引物可直接用于實驗室間比對數(shù)據(jù)獲得容易可同時進(jìn)行鑒定和分型菌種鑒定水平高分型能力較差葡萄球菌之間16S rDNA同源性分型指紋圖譜技術(shù)分子雜交技術(shù)首先用限制性內(nèi)切酶對細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行酶消化，通過特異性探針與目標(biāo)DNA序列的雜交結(jié)合，經(jīng)過轉(zhuǎn)膜技術(shù)和顯色技術(shù)形成

22、該細(xì)菌特有的雜交圖譜?，F(xiàn)有成熟的基于核糖體的分子雜技圖譜庫涵蓋了200個屬的1200多種6950株微生物，為各研究和實驗機(jī)構(gòu)提供了一個統(tǒng)一的微生物分型標(biāo)準(zhǔn)。核糖體分型（RiboPrinter）葡萄球菌RiboPrinter分型分析全自動系統(tǒng)操作簡單結(jié)果重現(xiàn)性好鑒定分型結(jié)果一次給出依賴數(shù)據(jù)庫儀器試劑昂貴分型能力一般脈沖場電泳技術(shù)（PFGE）PFGE 目前被公認(rèn)為沙門菌的標(biāo)準(zhǔn)分型方法中國、歐洲和美國已把該方法作為食源性病原菌的標(biāo)準(zhǔn)分型方法美國CDC具有龐大的病原菌數(shù)據(jù)庫追蹤傳染源處理應(yīng)急流行病學(xué)分析發(fā)展控制和教育活動脈沖場電泳技術(shù)（PFGE）雞肉中分離的450株沙門菌PFGE分型脈沖場電泳技術(shù)（P

23、FGE）良好的重復(fù)性可用于實驗室間結(jié)果比對通常用于對已有準(zhǔn)確生化鑒定結(jié)果的細(xì)菌分型操作繁瑣，通量小相關(guān)的分析處理軟件昂貴分辨力高：同一PFGE型不一定是同一株菌多位點(diǎn)序列分析 (MLST)通過直接測定多個管家基因的核苷酸序列發(fā)現(xiàn)細(xì)菌變異的分型方法一般測定6-10個管家基因片段，每個位點(diǎn)的序列根據(jù)其發(fā)現(xiàn)的時間順序給予一個等位基因編號，每個菌株的等位基因編號按指定順序排列就是等位基因譜，即ST（ sequence type）管家基因管家基因又稱持家基因（house-keeping genes），是指所有細(xì)胞中均要表達(dá)的一類基因，其產(chǎn)物是對維持細(xì)胞基本生命活動所必需的。如微管蛋白基因、糖酵解酶系基因

24、與核糖體蛋白基因等。具有相同遺傳信息的同一個體細(xì)胞間其所利用的基因并不相同，管家基因活動是維持細(xì)胞基本代謝所必須的，這正是細(xì)胞分化、生物發(fā)育的基礎(chǔ)。多位點(diǎn)序列分析 (MLST)染色體不同保守位點(diǎn)之間的序列分析具有國際統(tǒng)一的序列和分析方法分型能力強(qiáng)僅針對有研究的數(shù)個細(xì)菌種屬多位點(diǎn)重復(fù)序列分析 (MLVA)基于染色體上的重復(fù)序列需要基因組數(shù)據(jù)通過PCR方法擴(kuò)增重復(fù)序列，確定重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)重復(fù)序列MLVA技術(shù)MLVA技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)PCR方法分辨力強(qiáng)成本低缺點(diǎn)需要基因組測序數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)庫有限只能對同一種屬細(xì)菌進(jìn)行分析簡 介微生物鑒定分型技術(shù)在檢驗中的應(yīng)用 微生物檢驗技術(shù)介紹一二潔凈環(huán)境微生物監(jiān)控2.1

25、2.2.1實驗室潔凈環(huán)境微生物監(jiān)控2.2.2 企業(yè)環(huán)境微生物菌株信息庫的建立二、微生物檢驗技術(shù)在檢驗中的應(yīng)用 實驗室潔凈環(huán)境監(jiān)控，構(gòu)建環(huán)境微生物分布圖，提高檢測結(jié)果公信力無菌檢查法是對藥品微生物控制質(zhì)量中的最嚴(yán)格要求但對污染的來源問題上，無菌檢查法本身具有無法彌補(bǔ)的缺陷對檢測機(jī)構(gòu)而言，自身檢測環(huán)境的控制要比樣品檢測更加重要只有排除檢測過程中的微生物污染，才能有足夠的理由相信，樣品污染來自藥品本身 2008年“刺五加事件”及2009年“雙黃連注射液”事件中相關(guān)產(chǎn)品微生物污染的確定經(jīng)過有關(guān)單位多次反復(fù)試驗才得以確認(rèn)潔凈環(huán)境微生物監(jiān)控頭狀葡萄球菌（Staphylococcuscapitis）溶血葡萄

26、球菌（Staphylococcushaemolyticus）緩癥鏈球菌（Streptococcusmitis）科氏葡萄球菌（Staphylococcuscohnii）藤黃微球菌（Micrococcusluteus）同一株菌反復(fù)污染潔凈環(huán)境要引起檢驗人員高度重視僅靠潔凈室內(nèi)部消毒措施很可能起不到排除污染的作用要對潔凈室送風(fēng)系統(tǒng)和檢驗人員攜帶污染進(jìn)行全面調(diào)查建立環(huán)境微生物污染趨勢分析圖，預(yù)測微生物污染方向，從被動的排查污染措施上升到主動的預(yù)防、預(yù)警。將污染信息并與歷史污染物比對，回顧調(diào)查，幫助質(zhì)量體系的改進(jìn)。常見潔凈環(huán)境微生物污染中國現(xiàn)行藥品生產(chǎn)企業(yè)執(zhí)行的GMP中微生物監(jiān)控部分僅要求企業(yè)對潔凈生產(chǎn)

27、區(qū)的浮游菌、沉降菌和表面微生物的數(shù)量進(jìn)行控制。只要企業(yè)在發(fā)現(xiàn)污染后對整個生產(chǎn)區(qū)域進(jìn)行消毒，達(dá)到微生物數(shù)量控制標(biāo)準(zhǔn)即可潔凈環(huán)境微生物監(jiān)控潛在危險是很難查清污染的真正來源，容易造成同一地點(diǎn)、同一類型的反復(fù)污染，對產(chǎn)品安全是一個極大的隱患。2006年發(fā)生的“齊二藥亮菌甲素”事件和“欣弗事件”暴露了我國監(jiān)管部門在GMP體系監(jiān)管中的漏洞美國FDA在要求藥廠將微生物鑒定到“種”一級，并建議在微生物形態(tài)和生化反應(yīng)鑒定之外采用基因分型技術(shù)進(jìn)行分析，以便對生產(chǎn)環(huán)境的微生物污染進(jìn)行監(jiān)控微生物實驗室應(yīng)首先確保實驗室的設(shè)施和環(huán)境不會對檢驗過程帶來微生物污染，杜絕實驗結(jié)果假陽性和假陰性的發(fā)生通過直接比較不同類群個體同源

28、核酸的核苷酸排列順序，獲得生物進(jìn)化、變異的詳細(xì)信息在日常環(huán)境監(jiān)控過程中收集、鑒定環(huán)境微生物建立環(huán)境監(jiān)控數(shù)據(jù)庫，與樣品中分離得到的微生物做比較，分析微生物污染來源，出具客觀的檢測報告。潔凈環(huán)境微生物監(jiān)控2.1.1 實驗室潔凈環(huán)境微生物監(jiān)控建立實驗室潔凈區(qū)采樣方案醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法（GB/T 16292162941996）藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（2010修訂版）以一個月為周期，連續(xù)監(jiān)測實驗室環(huán)境不定期對本所無菌室潔凈環(huán)境進(jìn)行抽樣調(diào)查，積累潔凈環(huán)境微生物種群和分布數(shù)據(jù)檢查內(nèi)容包括沉降菌檢測、浮游菌檢測、表面微生物檢測和操作人員衛(wèi)生檢測等 建立和健全日常監(jiān)督檢查方法生

29、產(chǎn)過程中覆蓋從原材料到終產(chǎn)品的全過程監(jiān)控對空氣采樣共設(shè)置16個采樣點(diǎn) ，同時增設(shè)表面微生物采樣點(diǎn)表面細(xì)菌的測定采用平板接觸法，包括房間的門把手、操作人員操作服胸口和前臂處、手套、口罩、拖鞋底等微生物隨著操作人員更容易進(jìn)潔凈環(huán)境，最可能成為污染的主要來源微生物污染涉及藥品生產(chǎn)、流通和消費(fèi)三大領(lǐng)域生化鑒定方法與分子生物學(xué)鑒定方法的結(jié)果匹配率比較 分類統(tǒng)計菌株：103株方法API /VITEK /分子生物學(xué)屬三種方法比較都一致API/VITEK一致API/分子一致VITEK/分子一致都不一致菌株數(shù)9597971012匹配率92.23%94.17%94.17%98.06%1.94%種三種方法比較都一致

30、API/VITEK一致API/分子一致VITEK/分子一致都不一致菌株數(shù)283230564匹配率27.18%31.07%29.13%54.37%3.88%同時采用多種鑒定手段，能促進(jìn)方法學(xué)的改進(jìn)，統(tǒng)一檢驗標(biāo)準(zhǔn)，保證結(jié)果的重復(fù)性、一致性、可信性和國際認(rèn)可性，為政府執(zhí)法、仲裁提供科學(xué)的依據(jù)生化反應(yīng)系統(tǒng)在“屬”一級的鑒定結(jié)果與分子生物學(xué)方法一致性較高生化鑒定的結(jié)果無法進(jìn)一步細(xì)分到“種”由于對生化反應(yīng)終點(diǎn)的判定和操作影響等原因，同為生化反應(yīng)原理的API系統(tǒng)與VITEK系統(tǒng)鑒定結(jié)果也不一致 微生物種屬鑒定方法2.1.1 實驗室潔凈環(huán)境微生物監(jiān)控在實驗環(huán)境中以葡萄球菌屬（Staphylococcus）分離

31、數(shù)目最多為34%微球菌屬（Micrococcus）和芽孢桿菌屬（Bacillus）次之，分別為19.15%和17.04%假單胞菌屬（Micrococcus）、莫拉菌群（Moraxella）、短波單胞菌屬（Brevundimonas）占4.26%短桿菌屬（Brevibacterium）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、泛菌屬（Pantoea）等所占比例歸于其他項中收集的環(huán)境微生物中酵母菌占8.51%，主要為近平滑假絲酵母（Candida parapsilosis）和粘紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）霉菌等絲狀真菌占4

32、.26%，主要為青霉菌屬2.1.1 實驗室潔凈環(huán)境微生物監(jiān)控2.1.2 環(huán)境微生物菌株信息庫的建立我們連續(xù)三個月對實驗室潔凈環(huán)境中部分環(huán)境微生物進(jìn)行追蹤，并進(jìn)行同源性分析以葡萄球菌屬為例，本實驗室共收集到16株葡萄球球菌屬細(xì)菌。7、8月分別收集到的細(xì)菌239與250和232與246之間同源性較高，歸在一個子類中，屬于同源污染。說明7月和8月之間的消毒滅菌過程不徹底，存在消毒漏洞。經(jīng)過消毒，在9月份監(jiān)測過程中收集到的葡萄球菌中未發(fā)現(xiàn)有和前兩月同源的菌株，說明前期的污染已經(jīng)消除，9月份收集到的部分葡萄球菌為新進(jìn)入環(huán)境的微生物。2.1.2 環(huán)境微生物菌株信息庫的建立潔凈環(huán)境微生物監(jiān)控2.12.2.1

33、實驗室潔凈環(huán)境微生物監(jiān)控2.2.2 企業(yè)環(huán)境微生物菌株信息庫的建立二、微生物檢驗技術(shù)在檢驗中的應(yīng)用 本所抗生素室對某藥業(yè)上海制藥工廠生產(chǎn)車間進(jìn)行了沉降菌檢查，在洗瓶間和生產(chǎn)車間布置了15個監(jiān)測點(diǎn)。將TSA平板靜態(tài)暴露于車間環(huán)境4h后，在33下培養(yǎng)48小時，經(jīng)平板計數(shù)共收集沉降菌106株。通過形態(tài)學(xué)和革蘭氏染色結(jié)果將所得菌株初步分為37類，經(jīng)過菌株鑒定，共得到16個屬22個種的微生物分布圖。雖然，在本次浮游菌檢測任務(wù)中在15個采樣點(diǎn)內(nèi)未監(jiān)測到大腸桿菌菌株，說明在監(jiān)測時生產(chǎn)車間產(chǎn)品受到大腸桿菌污染威脅不大。但是，由于監(jiān)控的空間跨度和時間跨度有限，不能排除該企業(yè)潛在的大腸桿菌污染危害。上海某藥業(yè)產(chǎn)品

34、受微生物潛在污染風(fēng)險經(jīng)分析，發(fā)現(xiàn)如下問題，提請該藥品生產(chǎn)企業(yè)注意在高潔凈度等級的層流罩和生產(chǎn)車間內(nèi)采集到沉降細(xì)菌和霉菌菌落，企業(yè)產(chǎn)品的質(zhì)量安全存在潛在的安全隱患。建議企業(yè)采取滅菌消毒等有效措施，全面清潔生產(chǎn)環(huán)境，加強(qiáng)對梅雨季節(jié)容易產(chǎn)生的霉菌污染的控制配間11采樣點(diǎn)的微球菌和洗瓶間2采樣點(diǎn)檢測到的微球菌屬于同源菌株，配間采樣點(diǎn)9和洗瓶間8檢測到的葡萄球菌也為同源菌株，顯示配間和洗瓶間存在交叉污染情況在全部采樣點(diǎn)中葡萄球菌和微球菌均為人體易攜帶污染的微生物種類，且這兩類微生物在多個采樣點(diǎn)均有發(fā)現(xiàn)，提示該車間操作人員在操作和移動過程中的污染較為嚴(yán)重在該檢測環(huán)境中發(fā)現(xiàn)了較難消毒滅菌的芽孢桿菌屬細(xì)菌，企

35、業(yè)在常規(guī)消毒過程中要注意加強(qiáng)消毒劑劑量和延長消毒時間上海某藥業(yè)產(chǎn)品受微生物潛在污染風(fēng)險某制藥廠沉降菌同源性分析檢測實驗室微生物信息庫企業(yè)微生物信息庫同源性分析比對污染源是否2009年國家藥品抽驗任務(wù)無菌檢驗過程中發(fā)現(xiàn)有一個廠家2個批次（抽200911162和抽200910927）的藥品無菌檢測不合格，無菌集菌器中培養(yǎng)基變渾濁，有未知絲狀真菌生長，按照國家標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)判定該產(chǎn)品不合格。為保證檢驗結(jié)果的可靠性，在分子生物學(xué)技術(shù)平臺的基礎(chǔ)上鑒定，這兩株微生物與青霉菌（Penicillium sp.）相似度較高樣品抽200911162和抽200910927在系統(tǒng)發(fā)育樹中處于同一個分支，親緣關(guān)系較為相近，屬于

36、同源污染物相反的，樣品ITS序列與本實驗室的歷史環(huán)境菌株ITS序列差異較大，親緣關(guān)系遠(yuǎn)，屬于非同源菌株2.2.1 在真菌污染檢查中的應(yīng)用可以證實，樣品中青霉菌的污染源自于生產(chǎn)廠家的生產(chǎn)加工過程，與檢驗環(huán)境和檢驗過程無關(guān)。最終給出該廠兩批次產(chǎn)品不合格的鑒定結(jié)論，鑒定周期僅為7天真菌的鑒定流程圖分離純化得到真菌樣品的單菌落真菌菌落形態(tài)觀察真菌DNA的提取構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分子生物學(xué)評價通用引物擴(kuò)增真菌ITS 序列ITS序列在GenBank中進(jìn)行Blast分析鑒定結(jié)論菌株414-Asperallus sp.做為已知的外群微生物，407-Penicillium sp.和413-Penicillium sp

37、.為實驗室歷史監(jiān)測中收集的青霉菌株基于真菌ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（NJ法）2.2.2 在細(xì)菌污染檢查中的應(yīng)用在國家藥品抽驗任務(wù)中，常規(guī)檢驗方法檢出三批無菌樣品（抽200911213-1，抽200911213-2和200911214）的培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，被判為不合格。以樣品抽200911214為例，根據(jù)菌落形態(tài)、生化反應(yīng)API和分子生物學(xué)的鑒定結(jié)果可知此菌可能為放線菌。但是，生化鑒定儀器VITEK的鑒定范圍不包含放線菌科。由于微生物在不同生長時期，不同生長條件下的形態(tài)特征及代謝情況有所不同，采用生化反應(yīng)為鑒別基礎(chǔ)的技術(shù)時常失效，而分子生物學(xué)鑒定時建立在生物遺傳信息基礎(chǔ)之上，結(jié)果更為穩(wěn)定可靠，重復(fù)性強(qiáng)。最終的鑒定結(jié)論是經(jīng)全面整合菌種的菌落形態(tài)、革蘭氏染色鏡檢形態(tài)、生化鑒定結(jié)果和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果的綜合性結(jié)論分離純化得到單菌落菌落形態(tài)檢驗DNA