3蛋白質(zhì)濃度測(cè)定方法.

1、蛋白質(zhì)濃度測(cè)定方法四種古老的經(jīng)典方法：定氮法雙縮尿法（Biuret法）Folin酚試劑法（Lowry法）紫外吸收法新的測(cè)定法：考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）更新的測(cè)定方法：BCA法分光光度計(jì)的使用 原理光線的本質(zhì)是電磁波的一種，有不同的波長(zhǎng)。肉眼可見的彩色光稱為可見光，波長(zhǎng)范圍在400750nm：小于400nm的光線稱為紫外光；大于750nm的光線稱為紅外光。當(dāng)光線通過(guò)透明溶液介質(zhì)時(shí)，其輻射的波長(zhǎng)有一部分被吸收，一部分透過(guò)、因此光線射出溶液之后，部分光波減少，這種光波的吸收和透過(guò)可用于某些物質(zhì)的定性定量分析。 依據(jù)Lambert-Beer（朗伯比爾）定律，一束單色光通過(guò)溶液后，光波被吸收一

2、部分，其吸收多少與溶液中溶質(zhì)的濃度和溶液厚度成正比。當(dāng)入射光、吸收系數(shù)K和溶液的光徑長(zhǎng)度L不變時(shí)，吸光度A與溶液的濃度C成正比。具體測(cè)量時(shí)，補(bǔ)充知識(shí)型可見分光光度計(jì)紫外分光光度計(jì)微量凱氏（Kjeldahl）定氮法原理樣品與濃硫酸共熱。含氮有機(jī)物即分解產(chǎn)生氨（消化），氨又與硫酸作用，變成硫酸氨。經(jīng)強(qiáng)堿堿化使之分解放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據(jù)此酸液被中和的程度可計(jì)算得樣品之氮含量。以甘氨酸為例，其反應(yīng)式如下：NH2CH2COOH + 3H2SO4 = 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1) 2NH3 + H2SO4 =(NH4)2SO4 (2) (NH4)2SO4 + 2NaO

3、H =2H2O +Na2SO4 + 2NH3 (3)反應(yīng)（1）、(2)在凱氏瓶?jī)?nèi)完成，反應(yīng)（3）在凱氏蒸餾裝置中進(jìn)行。為了加速消化，可以加入CuSO4作催化劑，K2SO4以提高溶液的沸點(diǎn)。收集氨可用硼酸溶液，滴定則用強(qiáng)酸。器材1. 100ml凱氏燒瓶2. 改進(jìn)型凱氏定氮儀3. 50ml容量瓶4. 分析天平（電子天平）5. 烘箱 6. 電爐 7. 酒精燈8. 小玻璃珠 9. 滴定管10. 洗瓶11. 錐形瓶12.鐵架臺(tái)試劑1. 消化液：30% H2O2濃H2SO4H2O=3212. 30% NaOH溶液 3. 2% H3BO3溶液4. 混合催化劑（粉末K2SO4- CuSO4混合物）K2SO4與

4、CuSO4以31比例充分研細(xì)混勻。5. 0.01mol/L標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液6. 混合指示劑（田氏指氏劑）取0.1%甲烯藍(lán)-無(wú)水乙醇溶液50ml、0.1%甲基紅-無(wú)水乙醇溶液200ml，混合，貯于棕色瓶中備用。該指示劑酸性時(shí)為紫紅色，堿性時(shí)為綠色，變色范圍很窄（pH5.25.6）且很靈敏。7. 蒸餾水若測(cè)定的樣品含氮部分只是蛋白質(zhì)，則樣品中蛋白質(zhì)含量（%）=總氮量6.25 若樣品中除有蛋白質(zhì)外，尚含有其他含氮物質(zhì)，則需向樣品中加入三氯乙酸，然后測(cè)定未加三氯乙酸的樣品及加入三氯乙酸后樣品上清液中的含氮量，得出非蛋白氮及總氮量，從而計(jì)算出蛋白氮，再進(jìn)一步算出蛋白質(zhì)含量。 蛋白氮 = 總氮 - 非蛋白氮

5、蛋白質(zhì)含量（g %）= 蛋白氮 6.25雙縮脲法N 端C 端雙縮脲 加熱NH322H1800雙縮脲22222雙縮脲反應(yīng):堿性環(huán)境 H2O O=C C=O HN NH R-CH CH-R O=C Cu C=O HN NH R-CH CH-R H2O 紫色絡(luò)合物原 理雙縮脲法是利用蛋白質(zhì)的雙縮脲反應(yīng)而測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法。因蛋白質(zhì)含有兩個(gè)以上的肽鍵，所以有雙縮脲反應(yīng)。在堿性溶液中蛋白質(zhì)與Cu2+形成紫紅色絡(luò)合物，其顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比，而與蛋白質(zhì)的分子量及氨基酸成分無(wú)關(guān)。在一定的實(shí)驗(yàn)條件下，未知樣品溶液與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液同時(shí)反應(yīng)，并于540560nm測(cè)定，即可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出

6、未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。試劑一 試劑1標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白溶液（5mg/ml）用0.05mol/L NaOH溶液配制：5g酪蛋白加0.05mol/L NaOH溶液至1 000ml。2雙縮脲試劑溶解1.5g硫酸銅（CuSO4 5H2O）和6.0 g酒石酸鉀鈉（NaKC4H4O6 4H2O）于500ml蒸餾水中。在攪拌下加入10% NaOH溶液300ml，用蒸餾水稀釋到1升，貯存在內(nèi)壁涂有石蠟的瓶中，可長(zhǎng)期保存。3未知蛋白質(zhì)溶液球蛋白溶液。Folin酚試劑法（Lowry法）蛋白質(zhì)在堿性溶液中其肽鍵與Cu2+螯合，形成蛋白質(zhì)一銅復(fù)合物，此復(fù)合物使酚試劑的磷鉬酸還原，產(chǎn)生藍(lán)色化合物，在一定條件下，利用藍(lán)色深淺與蛋

7、白質(zhì)濃度的線性關(guān)系作標(biāo)準(zhǔn)曲線并測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)的濃度。該化合物在750nm有最大吸收峰。試劑：一：1，4%碳酸鈉；2，0.2N氫氧化鈉；3，1%硫酸銅；4,2%酒石酸鉀鈉。1和2等體積混合，3和4等體積混合，然后將兩液以50：1混合(甲)。當(dāng)天使用。二：1NFolin-酚試劑(乙)。 方法：標(biāo)準(zhǔn)曲線；試管中加0、0.2、0.40、0.60、1.00毫升酪蛋白溶液（500微克/毫升），加水補(bǔ)足1毫升，平行做兩份。按序各加5毫升試劑（甲），搖勻，室溫置放10分鐘，再依次加入1N（0.5毫升）Folin-酚試劑（乙），搖勻，30攝氏度保溫30分鐘。然后在分光光度機(jī)上比色測(cè)定（A750）?？捡R斯亮藍(lán)染

8、色法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度 考馬斯亮藍(lán)在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)和染料結(jié)合符合比爾定律 ，因此可以通過(guò)測(cè)定染料在595nm處光吸收的增加量得到與其結(jié)合的蛋白質(zhì)量。該法簡(jiǎn)單、迅速、干擾物質(zhì)少、靈敏度高（比Lowry法靈敏4倍）。 Coomassie Dye-Based 蛋白質(zhì)定量PROTEIN+Amax = 595nmBLUEAcidCoomassie G-250Protein - DyeComplexOCH2CH3NHCCH3CH3NCH2SO3-CH3CH2NCH2CH2CH3SO3Na+總蛋白定量分析BCA（Bicinchoninic acid，二辛可寧酸、二羧基二喹啉）準(zhǔn)確靈敏：BCA試劑的

9、蛋白質(zhì)測(cè)定范圍是202000g/ml；Micro BCA試劑測(cè)定范圍是0.5-20g/ml快速：45分鐘內(nèi)完成測(cè)定，比經(jīng)典的Lowry法快4倍而且更加方便經(jīng)濟(jì)實(shí)用：除試管外，測(cè)定可在微孔板中進(jìn)行，大大節(jié)約樣品和試劑用量不受樣品中離子型和非離子型去污劑影響檢測(cè)不同蛋白質(zhì)分子的變異系數(shù)小于考馬斯亮藍(lán)基本原理：堿性條件下，蛋白將Cu2+還原為Cu+， Cu+與BCA試劑形成紫顏色的絡(luò)合物，測(cè)定其在562nm處的吸收值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，即可計(jì)算待測(cè)蛋白的濃度。蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)。吸收高峰在280nm處，其吸光度（即光密度值）與蛋

10、白質(zhì)含量成正比。此外，蛋白質(zhì)溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長(zhǎng)下，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系，可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。 紫外吸收法測(cè)蛋白質(zhì)含量 三、操作步驟1.取15支試管，按下表編號(hào)、加試劑管號(hào)0123456樣品牛血清白蛋白(mg)00.61.22.43.64.86.02mg/mL牛血清白蛋白體積(mL)00.30.61.21.82.43.0待測(cè)液體積(mL)3.0*蒸餾水(mL)3.02.72.41.81.20.600OD5402.各管混勻后，加入雙縮脲試劑3.0mL,37oC反應(yīng)30min。3.以0號(hào)管調(diào)零，測(cè)定各管540nm光吸收值。四、結(jié)果處理1.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線以牛血清白蛋白含量為橫坐標(biāo)，OD540為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.樣品的計(jì)算根據(jù)樣品的OD540從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品的蛋白質(zhì)含量（mg），再根據(jù)樣品的體積計(jì)算出樣品的濃度。五