3蛋白質濃度測定方法.

1、蛋白質濃度測定方法四種古老的經(jīng)典方法：定氮法雙縮尿法（Biuret法）Folin酚試劑法（Lowry法）紫外吸收法新的測定法：考馬斯亮藍法（Bradford法）更新的測定方法：BCA法分光光度計的使用 原理光線的本質是電磁波的一種，有不同的波長。肉眼可見的彩色光稱為可見光，波長范圍在400750nm：小于400nm的光線稱為紫外光；大于750nm的光線稱為紅外光。當光線通過透明溶液介質時，其輻射的波長有一部分被吸收，一部分透過、因此光線射出溶液之后，部分光波減少，這種光波的吸收和透過可用于某些物質的定性定量分析。 依據(jù)Lambert-Beer（朗伯比爾）定律，一束單色光通過溶液后，光波被吸收一

2、部分，其吸收多少與溶液中溶質的濃度和溶液厚度成正比。當入射光、吸收系數(shù)K和溶液的光徑長度L不變時，吸光度A與溶液的濃度C成正比。具體測量時，補充知識型可見分光光度計紫外分光光度計微量凱氏（Kjeldahl）定氮法原理樣品與濃硫酸共熱。含氮有機物即分解產(chǎn)生氨（消化），氨又與硫酸作用，變成硫酸氨。經(jīng)強堿堿化使之分解放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據(jù)此酸液被中和的程度可計算得樣品之氮含量。以甘氨酸為例，其反應式如下：NH2CH2COOH + 3H2SO4 = 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1) 2NH3 + H2SO4 =(NH4)2SO4 (2) (NH4)2SO4 + 2NaO

3、H =2H2O +Na2SO4 + 2NH3 (3)反應（1）、(2)在凱氏瓶內(nèi)完成，反應（3）在凱氏蒸餾裝置中進行。為了加速消化，可以加入CuSO4作催化劑，K2SO4以提高溶液的沸點。收集氨可用硼酸溶液，滴定則用強酸。器材1. 100ml凱氏燒瓶2. 改進型凱氏定氮儀3. 50ml容量瓶4. 分析天平（電子天平）5. 烘箱 6. 電爐 7. 酒精燈8. 小玻璃珠 9. 滴定管10. 洗瓶11. 錐形瓶12.鐵架臺試劑1. 消化液：30% H2O2濃H2SO4H2O=3212. 30% NaOH溶液 3. 2% H3BO3溶液4. 混合催化劑（粉末K2SO4- CuSO4混合物）K2SO4與

4、CuSO4以31比例充分研細混勻。5. 0.01mol/L標準鹽酸溶液6. 混合指示劑（田氏指氏劑）取0.1%甲烯藍-無水乙醇溶液50ml、0.1%甲基紅-無水乙醇溶液200ml，混合，貯于棕色瓶中備用。該指示劑酸性時為紫紅色，堿性時為綠色，變色范圍很窄（pH5.25.6）且很靈敏。7. 蒸餾水若測定的樣品含氮部分只是蛋白質，則樣品中蛋白質含量（%）=總氮量6.25 若樣品中除有蛋白質外，尚含有其他含氮物質，則需向樣品中加入三氯乙酸，然后測定未加三氯乙酸的樣品及加入三氯乙酸后樣品上清液中的含氮量，得出非蛋白氮及總氮量，從而計算出蛋白氮，再進一步算出蛋白質含量。 蛋白氮 = 總氮 - 非蛋白氮

5、蛋白質含量（g %）= 蛋白氮 6.25雙縮脲法N 端C 端雙縮脲 加熱NH322H1800雙縮脲22222雙縮脲反應:堿性環(huán)境 H2O O=C C=O HN NH R-CH CH-R O=C Cu C=O HN NH R-CH CH-R H2O 紫色絡合物原 理雙縮脲法是利用蛋白質的雙縮脲反應而測定蛋白質含量的方法。因蛋白質含有兩個以上的肽鍵，所以有雙縮脲反應。在堿性溶液中蛋白質與Cu2+形成紫紅色絡合物，其顏色的深淺與蛋白質的濃度成正比，而與蛋白質的分子量及氨基酸成分無關。在一定的實驗條件下，未知樣品溶液與標準蛋白質溶液同時反應，并于540560nm測定，即可以通過標準蛋白質的標準曲線求出

6、未知樣品的蛋白質濃度。試劑一 試劑1標準酪蛋白溶液（5mg/ml）用0.05mol/L NaOH溶液配制：5g酪蛋白加0.05mol/L NaOH溶液至1 000ml。2雙縮脲試劑溶解1.5g硫酸銅（CuSO4 5H2O）和6.0 g酒石酸鉀鈉（NaKC4H4O6 4H2O）于500ml蒸餾水中。在攪拌下加入10% NaOH溶液300ml，用蒸餾水稀釋到1升，貯存在內(nèi)壁涂有石蠟的瓶中，可長期保存。3未知蛋白質溶液球蛋白溶液。Folin酚試劑法（Lowry法）蛋白質在堿性溶液中其肽鍵與Cu2+螯合，形成蛋白質一銅復合物，此復合物使酚試劑的磷鉬酸還原，產(chǎn)生藍色化合物，在一定條件下，利用藍色深淺與蛋

7、白質濃度的線性關系作標準曲線并測定樣品中蛋白質的濃度。該化合物在750nm有最大吸收峰。試劑：一：1，4%碳酸鈉；2，0.2N氫氧化鈉；3，1%硫酸銅；4,2%酒石酸鉀鈉。1和2等體積混合，3和4等體積混合，然后將兩液以50：1混合(甲)。當天使用。二：1NFolin-酚試劑(乙)。 方法：標準曲線；試管中加0、0.2、0.40、0.60、1.00毫升酪蛋白溶液（500微克/毫升），加水補足1毫升，平行做兩份。按序各加5毫升試劑（甲），搖勻，室溫置放10分鐘，再依次加入1N（0.5毫升）Folin-酚試劑（乙），搖勻，30攝氏度保溫30分鐘。然后在分光光度機上比色測定（A750）?？捡R斯亮藍染

8、色法測定蛋白質濃度 考馬斯亮藍在一定蛋白質濃度范圍內(nèi)，蛋白質和染料結合符合比爾定律 ，因此可以通過測定染料在595nm處光吸收的增加量得到與其結合的蛋白質量。該法簡單、迅速、干擾物質少、靈敏度高（比Lowry法靈敏4倍）。 Coomassie Dye-Based 蛋白質定量PROTEIN+Amax = 595nmBLUEAcidCoomassie G-250Protein - DyeComplexOCH2CH3NHCCH3CH3NCH2SO3-CH3CH2NCH2CH2CH3SO3Na+總蛋白定量分析BCA（Bicinchoninic acid，二辛可寧酸、二羧基二喹啉）準確靈敏：BCA試劑的

9、蛋白質測定范圍是202000g/ml；Micro BCA試劑測定范圍是0.5-20g/ml快速：45分鐘內(nèi)完成測定，比經(jīng)典的Lowry法快4倍而且更加方便經(jīng)濟實用：除試管外，測定可在微孔板中進行，大大節(jié)約樣品和試劑用量不受樣品中離子型和非離子型去污劑影響檢測不同蛋白質分子的變異系數(shù)小于考馬斯亮藍基本原理：堿性條件下，蛋白將Cu2+還原為Cu+， Cu+與BCA試劑形成紫顏色的絡合物，測定其在562nm處的吸收值，并與標準曲線對比，即可計算待測蛋白的濃度。蛋白質分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質具有吸收紫外光的性質。吸收高峰在280nm處，其吸光度（即光密度值）與蛋

10、白質含量成正比。此外，蛋白質溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長下，蛋白質溶液的光吸收值與蛋白質濃度的正比關系，可以進行蛋白質含量的測定。 紫外吸收法測蛋白質含量 三、操作步驟1.取15支試管，按下表編號、加試劑管號0123456樣品牛血清白蛋白(mg)00.61.22.43.64.86.02mg/mL牛血清白蛋白體積(mL)00.30.61.21.82.43.0待測液體積(mL)3.0*蒸餾水(mL)3.02.72.41.81.20.600OD5402.各管混勻后，加入雙縮脲試劑3.0mL,37oC反應30min。3.以0號管調(diào)零，測定各管540nm光吸收值。四、結果處理1.繪制標準曲線以牛血清白蛋白含量為橫坐標，OD540為縱坐標，繪制標準曲線。2.樣品的計算根據(jù)樣品的OD540從標準曲線上查得樣品的蛋白質含量（mg），再根據(jù)樣品的體積計算出樣品的濃度。五