真核基因組DNA提取方法、原理和結(jié)構(gòu)

1、真核基因組 DNA提取方法、原理和結(jié)構(gòu)2022/7/20教學(xué)內(nèi)容真核生物基因組的結(jié)構(gòu)及特點(diǎn)、人類基因組計(jì)劃真核基因組提取的實(shí)驗(yàn)原理、操作說(shuō)明、儀器使用及注意事項(xiàng)基因組提取后的應(yīng)用：基因組文庫(kù)、PCR及southern blotRNA提取方法簡(jiǎn)介核酸（DNA和RNA）定量及定性方法的介紹2022/7/20實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖煜ふ婧薉NA提取的方法和原理掌握真核生物基因組的結(jié)構(gòu)及特點(diǎn)分離純化核酸總的原則：應(yīng)保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性；排除其它分子的污染（蛋白質(zhì)、脂類、糖、有機(jī)溶劑、金屬離子、外源DNA、RNA等） 。核酸純化應(yīng)達(dá)到的要求：核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過(guò)高濃度的金屬離子；其它生物

2、大分子的污染應(yīng)降低到最低程度；排除其它核酸分子的污染。核酸制備的一般原則盡量簡(jiǎn)化操作步驟，縮短提取過(guò)程。減少化學(xué)因素對(duì)核酸的降解（如過(guò)量酸堿） 減少物理因素對(duì)核酸的降解：機(jī)械剪切力（強(qiáng)烈震蕩、滲透壓急劇改變、反復(fù)凍融）和高溫防止核酸的生物降解（核酸酶的預(yù)防） 。 核酸制備時(shí)應(yīng)注意的事項(xiàng):核酸制備的步驟：破碎細(xì)胞提取純化I.材料準(zhǔn)備II.破碎細(xì)胞或包膜內(nèi)容物釋放III.核酸分離、純化IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)V.核酸溶解在適量緩沖液或水中核酸酶的抑制和抑制劑降低溫度，改變pH及鹽的濃度，都利于對(duì)核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制劑更有利，當(dāng)然，幾個(gè)條件并用更好。對(duì)于RNA，因分子較小

3、，不易被機(jī)械剪切力拉斷，但抑制RNase活力較難，故在RNA提取中設(shè)法抑制RNase更重要。核酸制備的一般方法和原理核酸酶的抑制和抑制劑 DNase抑制加入少量金屬離子螯合劑，如0.01 mol/L EDTA或檸檬酸鈉，DNase基本可以全部失活。 去垢劑、蛋白變性劑及DNase抑制劑也可使DNase失活。核酸酶的抑制和抑制劑RNase抑制 操作要帶手套。 所有器皿要嚴(yán)格消毒， 試劑處理 低溫操作 在分離過(guò)程中要加入一定的RNase抑制劑。 核酸制備中常用的去垢劑用于核酸提取的去垢劑，一般都是陰離子去垢劑，去垢劑的作用：1溶解膜蛋白及脂肪，使細(xì)胞膜破裂；2溶解核糖體上面的蛋白質(zhì)，使其解聚，將核

4、酸釋放出來(lái)；3對(duì)RNase、DNase有一定的抑制作用。如：SDS、脫氧膽酸鈉、4-氨基水楊酸鈉、萘-1.5-二磺酸鈉、三異丙基萘磺酸鈉核酸制備中常用的蛋白質(zhì)變性劑 蛋白質(zhì)變性劑的作用：1.使蛋白質(zhì)變性、沉淀，從核酸提取液中分離除去，以防造成蛋白污染。2.使蛋白質(zhì)變性，故可使核糖體解聚釋放出核酸。3.某些蛋白質(zhì)變性劑也有抑制RNase活性和破裂細(xì)胞的作用。 如：苯酚、氯仿、鹽酸胍、DEPC1）破碎細(xì)胞（防止核酸酶的作用） 微生物：溶菌酶、SDS裂解。 高等植物：搗碎器破碎、液氮研磨。 酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶， 冰凍法：反復(fù)凍融或液氮凍后組織搗碎。 動(dòng)物：液氮處理后用勻漿器破碎。 細(xì)胞器DNA

5、：首先純化細(xì)胞器。 以上處理時(shí)均要同時(shí)加入核酸酶抑制劑核酸提取的一般過(guò)程2）破碎抽提核酸除去雜質(zhì) 1首先使脫氧核糖核蛋白、核糖體、病毒的核蛋白與其它成分分離 2使核酸與蛋白質(zhì)分離 3除去脂類 4多糖的除去核酸提取的一般過(guò)程3）核酸的純化 根據(jù)所需核酸的性質(zhì)和特點(diǎn)除去其它核酸污染,并除去提取過(guò)程中的系列試劑(鹽、有機(jī)溶劑等）雜質(zhì)，最后得到均一的核酸樣品。 核酸提取的一般過(guò)程4）核酸樣品的保存 核酸保存的主要條件是溫度和介質(zhì) 溫度： 4 最佳和最簡(jiǎn)單 -70是長(zhǎng)期保存的良好溫度，為一次性保存 -20保存 保存介質(zhì)： TE緩沖溶液(最常用)核酸提取的一般過(guò)程注意事項(xiàng)材料準(zhǔn)備最好使用新鮮材料，低溫保存

6、的樣品材料不要反復(fù)凍融提取血液基因組DNA時(shí)，要選擇有核細(xì)胞組培細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)造成DNA降解含病毒的液體材料DNA含量較少，提取前先富集材料應(yīng)適量，過(guò)多會(huì)影響裂解，導(dǎo)致DNA量少，純度低針對(duì)不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式： 植物材料液氮研磨 動(dòng)物組織勻漿或液氮研磨 組培細(xì)胞蛋白酶K 細(xì)菌溶菌酶破壁 酵母破壁酶或玻璃珠高溫溫浴時(shí)，定時(shí)輕柔振蕩注意事項(xiàng)細(xì)胞裂解采用吸附材料吸附的方式分離DNA時(shí)，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系采用有機(jī)（酚/氯仿）抽提時(shí)應(yīng)充分混勻，但動(dòng)作要輕柔離心分離兩相時(shí)，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間注意事項(xiàng)核酸分離純化當(dāng)沉淀時(shí)間有限時(shí)，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會(huì)更充分沉淀

7、后應(yīng)用70的乙醇洗滌，以除去鹽離子等晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)若長(zhǎng)期儲(chǔ)存建議使用TE緩沖液溶解 TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase pH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解 注意事項(xiàng)核酸沉淀、溶解DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng)DNA中殘留有金屬離子重新純化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)重新沉淀DNA，讓酒精充分揮發(fā)增加70乙醇洗滌的次數(shù)（2-3次）DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題問(wèn)題一：DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCR反應(yīng)。原因?qū)Σ逜260/2801.8材料不新鮮或反復(fù)凍融未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性提取過(guò)程操作過(guò)于劇烈，DNA

8、被機(jī)械打斷外源核酸酶污染反復(fù)凍融盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復(fù)凍融液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的DNA時(shí)，可增加裂解液中螯合劑的含量細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔所有試劑用無(wú)菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌將DNA分裝保存于緩沖液中，避免反復(fù)凍融問(wèn)題二：DNA降解對(duì)策原因DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題實(shí)驗(yàn)材料不佳或量少破壁或裂解不充分沉淀不完全洗滌時(shí)DNA丟失盡量選用新鮮（幼嫩）的材料動(dòng)植物要?jiǎng)驖{研磨充分；G菌、酵母裂解前先用生物酶或機(jī)械方式破壁高溫裂解時(shí)，時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)（對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌可增加PK的用量）低溫沉淀，延長(zhǎng)沉淀時(shí)間加輔助物，促進(jìn)沉淀洗滌時(shí)，最好用

9、槍頭將洗滌液吸出，勿傾倒問(wèn)題三：DNA提取量少對(duì)策 原因DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題實(shí)驗(yàn)原理 想要制備基因組DNA，必須破碎細(xì)胞膜，去除蛋白質(zhì)、脂類和糖類等生物大分子且避免被細(xì)胞內(nèi)核酸酶降解即保證DNA的完整性。 在EDTA（螯合二價(jià)陽(yáng)離子以抑制DNase）存在的情況下，將分散好的真核生物組織、細(xì)胞用蛋白酶K消化真核細(xì)胞或組織并分解蛋白質(zhì)，用SDS溶解細(xì)胞質(zhì)并使蛋白質(zhì)變性從而與DNA分子分離，使DNA分子以可溶形式存在于溶液中。DNA在高鹽低pH的條件下，與硅基質(zhì)膜特異性結(jié)合，在低鹽高pH值條件下，吸附的DNA被洗脫下來(lái)。實(shí)驗(yàn)步驟處死小鼠，取肝臟20-50mg，剪碎，加入離心管內(nèi)加入600 L Lysi

10、s Buffer A，振蕩混勻加入10 L 蛋白酶 K ， 60 水浴1h，其間顛倒混勻數(shù)次1. 裂解組織細(xì)胞，變性蛋白，沉淀生物大分子組織塊盡量剪碎，否則影響裂解及消化主要含有SDS（溶解細(xì)胞質(zhì)并使蛋白質(zhì)變性）EDTA（螯合二價(jià)陽(yáng)離子以抑制DNase）和Tris-HCl （緩沖體）消化降解蛋白質(zhì)2022/7/20離心5 min，將上清轉(zhuǎn)入離心柱中，靜置2 min加入10 L RNase A，混勻，室溫放置10 min加入400 L Lysis Buffer B，劇烈震蕩30 s核酸內(nèi)切酶、去除DNA制品中的污染RNA沉淀作用，內(nèi)含有醋酸，提供低pH環(huán)境上清可能出現(xiàn)少量白色漂浮物，此為未消化完

11、全的細(xì)胞和蛋白質(zhì)2. DNA吸附在硅基質(zhì)膜上，清洗去除鹽等雜質(zhì)12,000 rpm離心1 min，棄廢液加入700 L Wash buffer A，12,000 rpm離心 1min，棄廢液加入700 L Wash buffer B， 12,000 rpm離心1min，棄廢液加入500 L Wash buffer B，12,000 rpm離心1 min，棄廢液再次12,000 rpm離心2 min，將離心柱置于新的離心管中，并打開(kāi)離心柱蓋，于室溫或37 恒溫箱放置510min，直至無(wú)明顯乙醇味Wash buffer A（含60%的乙醇）Wash buffer B（含80%的乙醇）主要去除鹽等雜

12、質(zhì)3. 洗脫DNA在硅基質(zhì)膜中央加入50 L Elution Buffer（EB）(事先預(yù)熱5565 )置于室溫2 min12,000 rpm離心2 min所得液體即為基因組DNA溶液。Elution Buffer（EB）：主要是TE buffer,提供高pH值環(huán)境，使吸附的DNA被洗脫下來(lái)注意事項(xiàng)材料應(yīng)適量，過(guò)多會(huì)影響裂解，導(dǎo)致DNA量少，純度低。由于真核生物基因組較大，操作時(shí)應(yīng)注意輕柔，最大限度地減少機(jī)械和化學(xué)作用對(duì)DNA的剪切，從而獲得相對(duì)完整的DNA。實(shí)驗(yàn)結(jié)果核酸（DNA及RNA）的鑒定及定量紫外分光光度法瓊脂糖凝膠電泳法 紫外分光光度法 測(cè)定DNA的純度和濃度原理： DNA或RNA鏈

13、上堿基的苯環(huán)結(jié)構(gòu)在紫外光區(qū)具有較強(qiáng)的吸收,其吸收峰在260 nm處。當(dāng)DNA樣品中含有蛋白質(zhì)、酚或其他小分子污染時(shí)，會(huì)影響DNA吸收光的準(zhǔn)確測(cè)定。蛋白質(zhì)在280 nm處有最大的吸收峰，鹽和小分子則集中在230 nm處。因此，一般情況下同時(shí)檢測(cè)同一樣品的OD260、OD280 和OD230計(jì)算其比值來(lái)衡量樣品的純度。即OD2601時(shí)： dsDNA(雙鏈DNA)濃度約為50 g/mL ssDNA(單鏈DNA)濃度約為37g/ml RNA濃度約為40g/ml 寡核苷酸濃度約為30g/ml濃度的計(jì)算dsDNA 濃度（g/L）=OD260稀釋倍數(shù)50 /1000 RNA 濃度（g/L）=OD260稀釋倍

14、數(shù)40 /1000純度的檢測(cè)DNA純品的OD260/OD280 約為。 OD260/OD280說(shuō)明含有RNA污染； OD260/OD2801.6 說(shuō)明有殘余的蛋白質(zhì)、酚等存在。OD230/OD260的比值應(yīng)在之間，若比值較高說(shuō)明有殘余的鹽存在。有些分光光度計(jì)則顯示OD260/OD230，其比值應(yīng)在之間，偏小則說(shuō)明有殘余鹽剩余。瓊脂糖凝膠電泳法 分離鑒定核酸的常規(guī)方法用瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法。瓊脂糖（Agarose，AG）是瓊脂中不帶電荷的中性組成成份（幾乎不含硫酸根，主要成分為多糖），其水溶液可以制成凝膠，具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。結(jié)果觀察： 制備凝膠時(shí)先加入少量熒光染料，其分子可插入DNA的

15、堿基之間，可在紫外燈下直接觀察到DNA片段在凝膠上的位置（熒光條帶），也可在經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)中直接拍照。瓊脂糖凝膠制備及電泳凝膠制備倒膠點(diǎn)樣電泳紫外燈下觀察1、凝膠準(zhǔn)備（0.8%）:用1TAE配制1瓊脂糖凝膠。 稱0.8 g瓊脂糖置三角瓶中，加100 mL 1TAE 微波爐加熱大約1分鐘，熔化瓊脂糖 熔化的瓊脂糖自然冷卻到6070，加入熒光染料 2L，并輕輕混勻。2、倒膠： 將冷卻60的凝膠緩慢倒入制膠模具中，在膠一端插上梳子。 室溫下靜置20 min，凝膠凝固。撥出梳子，將帶凝膠的膠床置于電泳槽中，并使樣品孔位于電場(chǎng)負(fù)極。3、點(diǎn)樣： 向電泳槽中加入1TAE電泳緩沖液，讓液面高于膠面1mm。 樣

16、品準(zhǔn)備：吸取5 L已提取的基因組DNA點(diǎn)在點(diǎn)樣紙上，加入1 L 6上樣緩沖液，用移液器輕輕混勻。上樣：用移液器吸取樣品，輕輕的加入到凝膠的樣品孔中。上樣緩沖液（loading buffer）作用：指示劑；沉降作用（含甘油），防止漂樣。4、電泳： 蓋上電泳槽，接通電源，開(kāi)始電泳 。電泳條件：電壓80v（恒壓）；時(shí)間30 min左右（根據(jù)指示劑遷移位置，判斷是否終止電泳） 電泳結(jié)束后，切斷電源，取出凝膠。5、紫外燈下觀察并分析結(jié)果：紫外檢測(cè)儀直接觀察電源條帶 攝影記錄 小鼠肝臟DNA 1 2 3實(shí)驗(yàn)討論提取后的基因組DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，條帶彌散，分析其可能原因。思考題1. 簡(jiǎn)述真核基因組結(jié)構(gòu)

17、特點(diǎn)。2. 如何從動(dòng)物組織中提取基因組DNA，簡(jiǎn)述其原理。43提取真核基因組DNA的應(yīng)用基因組包含了某物種生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖等各項(xiàng)生理活動(dòng)的幾乎全部信息量，因而對(duì)真核細(xì)胞基因組的結(jié)構(gòu)組成，以及表達(dá)調(diào)控的研究至關(guān)重要。高純度、相對(duì)完整的基因組DNA是進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)和功能研究的重要起始步驟。應(yīng)用于構(gòu)建基因組文庫(kù)southern雜交PCR技術(shù)441.構(gòu)建基因組文庫(kù)基因組DNA文庫(kù)（genomic DNA library） 從生物組織細(xì)胞提取出基因組DNA，用物理方法（超聲波、攪拌剪力等）或酶法（限制性核酸內(nèi)切酶的不完全酶解）將DNA降解成預(yù)期大小的片段，然后將這些片段與適當(dāng)?shù)妮d體（常用噬菌體、粘粒或YA

18、C載體）連接，轉(zhuǎn)入受體細(xì)菌或細(xì)胞，這樣每一個(gè)細(xì)胞接受了含有一個(gè)基因組DNA片段與載體連接的重組DNA分子，而且可以繁殖擴(kuò)增，許多細(xì)胞一起組成一個(gè)含有基因組各DNA片段克隆的集合體。構(gòu)建基因組文庫(kù)的目的： 以穩(wěn)定的重組體形式保存某種生物的全部遺傳信息和分離克隆有用的目的基因； 染色體DNA非常復(fù)雜，單個(gè)基因所占比例十分微小，若想從龐大的基因組中將其分離出來(lái)，一般需要先進(jìn)行擴(kuò)增，所以需要構(gòu)建基因組文庫(kù)。 基因組文庫(kù)構(gòu)建 構(gòu)建基因組文庫(kù)用載體噬菌體置換型載體或黏粒載體質(zhì)粒載體：小，只能用于構(gòu)建葉綠體基因組文庫(kù)。基本程序 （1）基因的克隆 （2）克隆基因的分離 （3）分離基因的檢測(cè)與分析分離到的基因用

19、于： 基因治療（例如正常的人的腺苷脫氫酶 （ADA）基因成功植入ADA缺乏癥患者的淋巴結(jié)構(gòu)）、DNA疫苗（HIV-9P160核酸疫苗）、蛋白質(zhì)產(chǎn)品（胰島素、干擾素、生長(zhǎng)因子等）2. Southern blot指將電泳分離的待測(cè)DNA片段結(jié)合到一定的固相支持物上，然后與存在于液相中的標(biāo)記核酸探針進(jìn)行雜交的過(guò)程，是目前最常用的核酸分子雜交方法。由于Southern 印跡雜交的高靈敏度和高特異性，它廣泛被應(yīng)用在遺傳病檢測(cè)、DNA指紋分析和PCR產(chǎn)物判斷等研究中。核酸雜交: Southern blot：用于DNA分析Northern blot：用于RNA分析3. PCRPCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可以從復(fù)雜的材料中擴(kuò)增 特殊DNA序列的強(qiáng)有力的技術(shù)。用采用特意引物的PCR直接從基因組DNA中分離基因。缺點(diǎn)：由于PCR酶的持續(xù)合成能力的不足和校正能力的缺陷，僅對(duì)較短產(chǎn)物的擴(kuò)增有