色譜分析法--高效液相色譜法

1、高效液相色譜法高效液相色譜法高效液相色譜法的特點高效液相色譜儀簡介高效液相色譜分離原理高效液相色譜固定相和流動相毛細(xì)管電泳簡介高效液相色譜法的特點高效液相色譜與經(jīng)典液相色譜高效液相色譜與氣相色譜的比較 高效液相色譜理論 應(yīng)用范圍 色譜分離原理 色譜操作條件高效液相色譜與經(jīng)典液相色譜高效液相色譜法是繼氣相色譜之后發(fā)展起來的。并沿用了氣相色譜的理論。流動相改為高壓輸送（最高輸送壓力可達(dá)4.9107Pa）;色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜（每米塔板數(shù)可達(dá)幾萬或幾十萬）；同時柱后連有高靈敏度的檢測器，可對流出物進(jìn)行連續(xù)檢測。高效液相色譜具有分析速度快、分離效能

2、高、自動化等特點。所以人們稱它為高壓、高速、高效或現(xiàn)代液相色譜法。高效液相色譜法的產(chǎn)生高效液相色譜是在氣相色譜和經(jīng)典液相色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。經(jīng)典的液相色譜法，流動相在常壓下輸送，所用的固定相柱效低，分析周期長。現(xiàn)代（高效）液相色譜和經(jīng)典液相色譜沒有本質(zhì)的區(qū)別。不同點僅僅是現(xiàn)代（高效）液相色譜比經(jīng)典液相色譜有較高的效率 和實現(xiàn)了自動化 操作。高效液相色譜與氣相色譜理論液相色譜所用基本概念與氣相色譜一致：保留值、塔板數(shù)、塔板高度、分離度、選擇性等。液相色譜所用基本理論也與氣相色譜基本一致：塔板理論與速率方程。液相色譜中以液體代替氣相色譜中的氣體作為流動相，而液體和氣體的性質(zhì)不相同,由于液體的擴(kuò)

3、散性比氣體的小105倍，因此，溶質(zhì)在液相中的傳質(zhì)速率慢，流動相傳質(zhì)阻力就顯得特別重要，而縱向擴(kuò)散項對色譜峰的擴(kuò)展基本上可忽略；而在氣相色譜中，流動相傳質(zhì)阻力可以忽略不計，而縱向擴(kuò)散項的影響很明顯。從而形成不同的H-u曲線；影響峰擴(kuò)展的主要物理性質(zhì)GC和LC的H-u曲線高壓液相色譜可使用較快的流速，實現(xiàn)快速分析液相和氣相色譜應(yīng)用范圍比較氣相色譜僅能分析在操作溫度下能氣化而不分解的物質(zhì)。對高沸點化合物、非揮發(fā)性物質(zhì)、熱不穩(wěn)定化合物、離子型化合物及高聚物的分離、分析較為困難。致使其應(yīng)用受到一定程度的限制，據(jù)統(tǒng)計只有大約20%的有機(jī)物能用氣相色譜分析；液相色譜則不受樣品揮發(fā)度和熱穩(wěn)定性的限制，它非常適

4、合分子量較大、難氣化、不易揮發(fā)或?qū)崦舾械奈镔|(zhì)、離子型化合物及高聚物的分離分析，大約占有機(jī)物的70 80%。液相色譜中制備樣品簡單，回收樣品也比較容易，而且回收是定量的，適合于大量制備。但液相色譜尚缺乏通用的檢測器，儀器比較復(fù)雜，價格昂貴。在實際應(yīng)用中，這兩種色譜技術(shù)是互相補充的。液相色譜分離原理及分類和氣相色譜一樣，液相色譜分離系統(tǒng)也由兩相固定相和流動相組成。液相色譜的固定相可以是吸附劑、化學(xué)鍵合固定相（或在惰性載體表面涂上一層液膜）、離子交換樹脂或多孔性凝膠；流動相是各種溶劑。被分離混合物由流動相液體推動進(jìn)入色譜柱。根據(jù)各組分在固定相及流動相中的吸附能力、分配系數(shù)、離子交換作用或分子尺寸大

5、小的差異進(jìn)行分離。色譜分離的實質(zhì)是樣品分子（以下稱溶質(zhì)）與溶劑（即流動相或洗脫液）以及固定相分子間的作用，作用力的大小，決定色譜過程的保留行為。根據(jù)分離機(jī)制不同，液相色譜可分為：液固吸附色譜、液液分配色譜、化合鍵合色譜、離子交換色譜以及分子排阻色譜等類型。液相色譜能完成難度較高的分離氣相色譜的流動相載氣是色譜惰性的，不參與分配平衡過程，與樣品分子無親和作用，樣品分子只與固定相相互作用。而在液相色譜中流動相液體也與固定相爭奪樣品分子，為提高選擇性增加了一個因素。也可選用不同比例的兩種或兩種以上的液體作流動相，增大分離的選擇性。為減少傳質(zhì)阻力的影響，高效液相色譜對固定相均勻性和粒度的要求更高。廣泛

6、使用薄殼型固定相和化學(xué)鍵合相固定相。液相色譜固定相類型多，如離子交換色譜和排阻色譜。等，作為分析時選擇余地大；而氣相色譜并不可能的。液相色譜通常在室溫下操作，較低的溫度，一般有利于色譜分離條件的選擇。高效液相色譜儀簡介高效液相色譜儀由 高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)、記錄系統(tǒng) 等五大部分組成。分析前，選擇適當(dāng)?shù)纳V柱和流動相，開泵，沖洗柱子，待柱子達(dá)到平衡而且基線平直后，用微量注射器把樣品注入進(jìn)樣口，流動相把試樣帶入色譜柱進(jìn)行分離，分離后的組分依次流入檢測器的流通池，最后和洗脫液一起排入流出物收集器。當(dāng)有樣品組分流過流通池時，檢測器把組分濃度轉(zhuǎn)變成電信號，經(jīng)過放大，用記錄器記錄下來

7、就得到色譜圖。色譜圖是定性、定量和評價柱效高低的依據(jù)。高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)示意圖高壓輸液系統(tǒng)高壓輸液系統(tǒng)由溶劑貯存器、高壓輸液泵、梯度洗脫裝置和壓力表等組成。溶劑貯存器 溶劑貯存器一般由玻璃、不銹鋼或氟塑料制成，容量為1到2 L，用來貯存足夠數(shù)量、符合要求的流動相。 高壓輸液泵高壓輸液泵是高效液相色譜儀中關(guān)鍵部件之一，其功能是將溶劑貯存器中的流動相以高壓形式連續(xù)不斷地送入液路系統(tǒng)，使樣品在色譜柱中完成分離過程。由于液相色譜儀所用色譜柱徑較細(xì)，所填固定相粒度很小，因此，對流動相的阻力較大，為了使流動相能較快地流過色譜柱，就需要高壓泵注入流動相。對泵的要求：輸出壓力高、流量范圍大、流量恒定、無脈動，

8、流量精度和重復(fù)性為0.5%左右。此外，還應(yīng)耐腐蝕，密封性好。按其性質(zhì)可分為恒壓泵和恒流泵兩大類。常用的泵有往復(fù)式柱塞泵和氣動放大泵恒流泵和恒壓泵恒流泵是能給出恒定流量的泵，其流量與流動相粘度和柱滲透無關(guān)。恒壓泵是保持輸出壓力恒定，而流量隨外界阻力變化而變化，如果系統(tǒng)阻力不發(fā)生變化，恒壓泵就能提供恒定的流量。往復(fù)式柱塞泵死體積小，適于梯度洗脫；流量調(diào)節(jié)方便；輸出有波動，不適用于差示折光檢測器氣動放大泵流量輸出穩(wěn)定，無脈沖；死體積大，不便于梯度洗脫；梯度洗脫裝置梯度洗脫就是在分離過程中使兩種或兩種以上不同極性的溶劑按一定程序連續(xù)改變它們之間的比例，從而使流動相的強(qiáng)度、極性、pH值或離子強(qiáng)度相應(yīng)地變

9、化，達(dá)到提高分離效果，縮短分析時間的目的。梯度洗脫裝置分為兩類：外梯度裝置和內(nèi)梯度裝置梯度洗脫的實質(zhì)是通過不斷地變化流動相的強(qiáng)度，來調(diào)整混合樣品中各組分的k值，使所有譜帶都以最佳平均k值通過色譜柱。它在液相色譜中所起的作用相當(dāng)于氣相色譜中的程序升溫，所不同的是，在梯度洗脫中溶質(zhì)k值的變化是通過溶質(zhì)的極性、pH值和離子強(qiáng)度來實現(xiàn)的，而不是借改變溫度（溫度程序）來達(dá)到。進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)包括進(jìn)樣口、注射器和進(jìn)樣閥等，它的作用是把分析試樣有效地送入色譜柱上進(jìn)行分離。其結(jié)構(gòu)和適用于氣相色譜類似分離系統(tǒng)分離系統(tǒng)包括色譜柱、恒溫器和連接管等部件。色譜柱一般用內(nèi)部拋光的不銹鋼制成。其內(nèi)徑為2 6mm，柱長為1

10、0 50cm，柱形多為直形，內(nèi)部充滿微粒固定相。柱溫一般為室溫或接近室溫。填料粒度5-10m，理論塔板數(shù)大約為7000-10000檢測器檢測器是液相色譜儀的關(guān)鍵部件之一。對檢測器的要求是：靈敏度高，重復(fù)性好、線性范圍寬、死體積小以及對溫度和流量的變化不敏感等。有兩種類型的檢測器： 溶質(zhì)性檢測器，它僅對被分離組分的物理或物理化學(xué)特性有響應(yīng)。如紫外、熒光、電導(dǎo)，安培檢測器等； 總體檢測器：它對試樣和洗脫液總的物理和化學(xué)性質(zhì)響應(yīng)。如差示折光檢測器等。紫外光度檢測器相當(dāng)于一雙光束紫外光度計，但光路系統(tǒng)比較特殊，流通池也有不同的種類紫外光度檢測器光路系統(tǒng)流通池的類型熒光檢測器靈敏度和選擇性好差示折光檢測

11、器根據(jù)溶液折射率的變化進(jìn)行檢測通用型檢測器不適用于梯度洗脫差示折光檢測器光路電導(dǎo)檢測器主要用于離子色譜五電極電導(dǎo)檢測器薄層安培檢測器高效液相色譜主要類型液固色譜液液色譜離子色譜排阻色譜分離方法的選擇液固色譜分離原理液固色譜的固定相是固體吸附劑。因此，液固色譜法是根據(jù)各組分在固定相上的吸附能力的差異進(jìn)行分離，故也稱為液固吸附色譜。液固色譜適用于分離相對分子質(zhì)量中等的油溶性試樣,對具有不同官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高的選擇性。液液色譜分離原理液液色譜的固定相和流動相是互不相溶的液體，試樣組分依據(jù)在固定相和流動相之間的相對溶解度存在差異在兩相間進(jìn)行分配。與氣液色譜不同，液液色譜的流動相對分配系數(shù)有很

12、大影響。根據(jù)出峰順序與組分極性的關(guān)系可以將液液色譜分為正相色譜和反相色譜兩類。正相色譜中流動相的極性小于固定液的極性，非極性組分先出峰。反相色譜正好相反。普通液液色譜大都為正相色譜，而隨著化學(xué)鍵合固定相的廣泛使用，反相色譜用得越來越多。離子色譜分離原理用于分離離子的高效液相色譜法有離子交換色譜法，離子對色譜法和離子色譜法三類。離子交換色譜法離子交換色譜法是利用不同待測離子對固定相親和力的差別來實現(xiàn)分離的。其固定相采用離子交換樹脂，樹脂上分布有固定的帶電荷基團(tuán)和可游離的平衡離子。待分析物質(zhì)可與樹脂上的平衡離子進(jìn)行可逆交換。一般說來，待分析物質(zhì)離子的電荷越大，水合離子半徑越小，該離子越難洗脫。離子

13、色譜法離子色譜法是由離子交換色譜法派生出來的一種分離方法。主要為克服離子交換色譜法在無機(jī)離子分析方面的不足而產(chǎn)生。離子交換色譜法采用電導(dǎo)檢測器可檢測所有的離子。為克服流動相的高背景電導(dǎo)信號產(chǎn)生的干擾，通常采用化學(xué)抑制柱技術(shù)。化學(xué)抑制型離子色譜法離子對色譜法離子對色譜法是將一種或多種與溶質(zhì)分子電荷相反的離子(稱為對離子和反離子)加到流動相或固定相中，使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水性離子對化合物從而控制溶質(zhì)離子的保留行為。離子對色譜法中組分在有機(jī)固定相的分配系數(shù)與對離子的濃度和離子對化合物的穩(wěn)定常數(shù)有關(guān)。排阻色譜分離原理排阻色譜法也稱空間排阻色譜或凝膠滲透色譜法，是一種根據(jù)試樣分子的尺寸進(jìn)行分離的色譜

14、技術(shù)。尺寸排阻色譜被廣泛應(yīng)用于大分子的分級，即用來分析大分子物質(zhì)相對分子質(zhì)量的分布。排阻色譜法排阻色譜的色譜柱的填料是凝膠，它是一種表面惰性，含有許多不同尺寸的孔穴或立體網(wǎng)狀物質(zhì)。凝膠的孔穴僅允許直徑小于孔開度的組分分子進(jìn)入，這些孔對于流動相分子來說是相當(dāng)大的，以致流動相分子可以自由地擴(kuò)散出入。對不同大小的組分分子，可分別滲入到凝膠孔內(nèi)的不同深度，大的組分分子可以滲入到凝膠的大孔內(nèi)，但進(jìn)不了小孔甚至于完全被排斥。小的組分分子，大孔小孔都可以滲入，甚至進(jìn)入很深，一時不易洗脫出來。因此，大的組分分子在色譜柱中停留時間較短，很快被洗脫出來，它的洗脫體積很小，小的組分分子在色譜柱中停留時間較長，洗脫體

15、積較大，直到所有孔內(nèi)的最小分子到達(dá)柱出口，完成按分子大小而分離的洗脫過程。 排阻色譜法分離示意圖凝膠的孔徑與分離范圍色譜分離方法的選擇選擇色譜分離方法的主要根據(jù) 是樣品的相對分子質(zhì)量的大小，在水中和有機(jī)溶劑中的溶解度，極性和穩(wěn)定程度以及化學(xué)結(jié)構(gòu)等物理、化學(xué)性質(zhì)。要正確地選擇色譜分離方法，首先必須盡可能多的 了解樣品的有關(guān)性質(zhì)，其次必須熟悉各種色譜方法的主要特點及其應(yīng)用范圍。相對分子質(zhì)量對于相對分子質(zhì)量較低（一般在200以下），揮發(fā)性比較好，加熱又不易分解的樣品，可以選擇氣相色譜法進(jìn)行分析。相對分子質(zhì)量在200 2000的化合物，可用液固吸附、液-液分配和離子交換色譜法。相對分子質(zhì)量高于2000

16、，則可用空間排阻色譜法。溶解度和化學(xué)結(jié)構(gòu)水溶性樣品最好用離子交換色譜法和液液分配色譜法；微溶于水，但在酸或堿存在下能很好電離的化合物，也可用離子交換色譜法；油溶性樣品或相對非極性的混合物，可用液-固色譜法。若樣品中包含離子型或可離子化的化合物，或者能與離子型化合物相互作用的化合物（例如配位體及有機(jī)螯合劑），可首先考慮用離子交換色譜，但空間排阻和液液分配色譜也都能順利地應(yīng)用于離子化合物；異構(gòu)體的分離可用液固色譜法；具有不同官能團(tuán)的化合物、同系物可用液液分配色譜法；對于高分子聚合物，可用空間排阻色譜法。色譜分析方法的選擇高效液相色譜的固定相和流動相液固色譜液液色譜離子色譜排阻色譜液固色譜的固定相和

17、流動相液固色譜法采用的固體吸附劑按其性質(zhì)可分為極性和非極性兩種類型。極性吸附劑包括硅膠、氧化鋁、氧化鎂、硅酸鎂、分子篩及聚酰胺等。非極性吸附劑最常見的是活性炭。在液-固色譜中，選擇流動相的基本原則是 極性大的試樣用極性較強(qiáng)的流動相，極性小的則用低極性流動相。為了獲得合適的溶劑極性，常采用兩種、三種或更多種不同極性的溶劑混合起來使用，如果樣品組分的分配比k值范圍很廣則使用梯度洗脫。液液色譜的固定相和流動相與氣液色譜類似，固定相由擔(dān)體和固定液組成。廣泛使用的擔(dān)體有全多孔型和表層多孔性兩類。液液色譜廣泛使用化學(xué)鍵合固定相，它主要有如下一些特點：表面沒有液坑，比一般液體固定相傳質(zhì)快得多；無固定液流失，

18、增加了色譜柱的穩(wěn)定性和壽命；可通過改變鍵合基團(tuán)方便地改變色譜柱的選擇性；有利于梯度洗提和配用靈敏的檢測器。全多孔型和表層多孔性擔(dān)體化學(xué)鍵合固定相的優(yōu)點表面沒有液坑，比一般液體固定相傳質(zhì)快得多無固定液流失，增加了色譜柱的穩(wěn)定性和壽命可以鍵合不同官能團(tuán)，能靈活地改變選擇性有利于梯度洗提，也有利于配用靈敏的檢測器河流分的收集離子交換色譜的固定相和流動相離子交換色譜和離子色譜法的固定相為離子交換樹脂。通常使用薄殼型離子交換樹脂或鍵合型離子交換固定相。常用的離子交換樹脂有磺酸型陽離子交換樹脂和季銨型陰離子交換樹脂。流動相為水溶液，組分的保留值可通過調(diào)整溶液的離子強(qiáng)度和pH來控制。通常增加離子強(qiáng)度使組分保留值降低。空間排阻色譜的固定相和流動相排阻色譜的固定相一般可分為 軟性、半剛性和剛性凝膠 三類。軟性凝膠 如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠都具有較小的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，其微孔能吸入大量的溶劑，并能溶漲到它干體的許多倍。它們適用于水溶性作流動相，一般用于小分子質(zhì)量物質(zhì)的分析，不適宜在高效液相色譜中。半剛性凝膠 如高交聯(lián)度的聚苯乙烯。常以有機(jī)溶劑作流動相。剛性凝膠 如多孔硅膠、多孔玻璃等，它們既可用水溶性溶劑，又可用有機(jī)溶劑作