第2節(jié)基因治療

1、第2節(jié)基因治療 1、直接療法：糾正突變基因 也就是在原位修復缺陷的基因，以達到治療目的。這種方法上較理想的基因治療策略，由于存在某些問題，目前正在努力之中。（未實現(xiàn)） 2、間接療法：以正?；蛱娲虏』?。 導入外源正?；?，代替有缺陷的基因。對靶細胞而言，沒有去除或修復有缺陷的基因。 二者均是用DNA重組技術設法修復患者細胞中有缺陷的基因，使細胞恢復正常功能而達到治療遺傳病的目的。 2 途 徑就基因轉移的受體細胞不同，基因治療有兩種途徑：1、生殖細胞基因治療 2、體細胞基因治療3 1、生殖細胞基因治療 理論上將正常細胞基因轉移到患者的生殖細胞（精細胞，卵細胞早期胚胎）使其發(fā)育成正常個體。這是

2、理想的治療方法，從根本上治療遺傳病，使其有害基因不能在人群中播散。 4但還存在某些問題：1）靶細胞的遺傳修飾至今尚無實質性進展；2）基因轉移效率不高，只能用顯微注射方法；3）只適用于排卵周期短而次數多的動物，很難適用于人類。（但目前輔助生殖技術的發(fā)展較為有效的解決了獲取卵細胞的辦法。一次可獲取少者3-5個，多者十幾個。）52體細胞基因治療（somatic cell gene therapy） 是指將正常基因轉移到體細胞，使之表達基因產物，以達到治療的目的。但有害基因能遺傳給后代。6 措 施：（1）正常基因轉移至體外培養(yǎng)的體細胞，有效表達后，再回輸到體內。（2）正常基因導入靶細胞，定位整合到染色

3、體上，準確的替換異?；?，是理想的措施。（3）隨機整合，非特定座位，只要有效的表達即可達到治療的目的。（4）體細胞基因理論不必矯正所有的體細胞。7存在的問題： （1）對特定座位基因轉移，目前還存在較大困難；（2）隨機插入可能引起后代的基因突變。8基因治療的方法（The methods of gene therapy） 實施基因治療的第一個關鍵性步驟是 基因轉移 一、Gene轉移方法 91、正常基因的分離與克隆基因治療首先獲得目的基因通常從基因組中分離 經克隆 定 位 表 達 評價表達情況102、外源基因的轉移通過不同方法，將目的基因轉移至受體細胞。11（1）化學法磷酸鈣沉淀法： 目的基因與磷酸

4、鈣等物質混合，形成沉淀的DNA微細顆粒，易通過細胞膜進入細胞內，并整合到受體細胞基因組中，在適當條件下得以表達。方法簡單，但轉化效率低。 Ca2(PO4)2+DNA 混合微細顆粒 （ Ca離子濃度 125 mmol， DNA 離子濃度 50ug/ml。 PH 7.0） 沉淀反應2030min 細胞在沉淀物中暴露 524h12(2)物理方法1、電穿孔法（electroporotion）將細胞至于高壓脈沖電場中，通過電壓使細胞產生可逆性的穿孔。周圍基質中的DNA可滲進細胞，進而表達。 瞬間細胞 細胞膜核摸通透性增加 高壓脈沖 DNA滲入細胞132、顯微注射法（microinjection ）利用顯

5、微操作把目的基因直接注入靶細胞或細胞核中。 14例：轉基因動物的制備 重組基因 DNA 微注射 （體外） 小鼠受精卵 回植 假妊娠 仔 鼠 動物模型：轉基因鼠 (每個鼠細胞中都含有外源基因，按孟德爾方式遺傳)1516clone sheep Dolly體細胞 提取 核 重組細胞 回植 Dolly卵細胞 去核 細胞 173、脂質體法（liposome）應用人工制備的類似細胞膜的膜性結構 脂質體，包裝外源基因，再與靶細胞融合，外源DNA導入靶細胞，使其表達。 DNA 胞融合 轉化細胞 PEG 仙苔病毒DNA脂膜184同源重組法 同源重組（homologus recombination）:外源基因和染

6、色體上的基因在同源序列間發(fā)生重組而插入染色體。 是將外源基因定位導入細胞的染色體上。 單交換 雙交換 19通過同源重組定點插入珠蛋白基因Xha IBstXIXha IneoXhaIBstXIneo正?；蜃粠в兄榈鞍谆虻馁|粒重組質粒 C重組后，插入外源基因外源基因片段帶有neo基因（新霉素抗性基因），重組后的細胞在含有neo 的培養(yǎng)基中生長，沒有插入新基因的細胞死亡，將有重組的細胞篩選出來。205.病毒介導基因內轉移（Viral mediated transfer）是通過病毒為載體（vector），將外源基因通過重組技術與病毒重組，然后去感染受體細胞。圖：感染細胞重組病毒21 逆轉錄病毒(

7、RNA) 常用的病毒載體 DNA病毒 1)逆轉錄病毒（retrovirus） 目前應用最多的最成功的是逆轉錄病毒，病毒感染細胞后，其基因組RNA 經逆轉錄產生雙鏈DNA拷貝，插入宿主染色體形成前病毒（provirus），前病毒轉錄產生的正鏈既是病毒RNA，再與前病毒編碼的外殼蛋白包裝成新的病毒顆粒。 完整的病毒顆粒具有插入宿主染色體必需的全套酶系統(tǒng)，適用于介導基因轉移。2223例如：小鼠白血病病毒（Mo-MLV）基因組結構： LTR LTR gag pol envU5 R U3 U5 R U3 U3=增強子，R=啟動子，U5=轉錄起始位點。 =病毒包裝信號，gag =核心抗原，pol=逆轉錄酶

8、， env=外殼蛋白。 24逆轉錄病毒載體優(yōu)點：高效感染宿主細胞，轉染率可達100%；病毒基因和所載的外源基因都可能表達；宿主范圍廣，可同時感染大量細胞并長期存留25缺 點 病毒基因容量有限，一般只能插入7kb左右片段； 病毒隨機插入靶細胞基因組中，因病毒具有強大的啟動子和增強子，能使插入點附近的基因過度表達或失活，插入的 外源基因可能不適當的表達； 逆轉錄病毒有致病作用，可能使受體細胞癌變。 根據逆轉錄病毒的缺點，人們有目的地將其改造，保留其優(yōu)點，除去癌基因和病毒基因，保留LTR和包裝信號。26二、靶細胞的選擇 是指接受外源Gene的體細胞，選擇靶細胞的原則是：1）必須較堅固，便于體外培養(yǎng)和

9、進行遺傳技術操作；2）易于由人體分離又便于輸回體內， 具有增殖優(yōu)勢，生命周期長，能存活幾月至幾年，或整個生命周期；3）易于受外源遺傳物質轉化。27某些代表性細胞外周血T淋巴細胞、皮膚成纖維細胞較符合上述要求。此外，造血干細胞地中海貧血、嚴重復合免疫缺陷病等基因治療。肝C家族性高膽固醇血癥、低密度脂蛋白病的 基因治療。28基因治療存在的問題與論理學基因 治療的研究與實踐中存在若干重要問題，所以更多的是處于研究階段，臨床應用還有待深入。29一、導入基因的持續(xù)性和高效表達如何提高基因的持續(xù)高效表達，從下列幾方面考慮： 1、選擇高效的基因轉移方法； 2、選擇適當的受體細胞（生命周期長的細胞） 3、選擇

10、適當的載體（廣泛表達或特異性表達的載體，以使Gnen高效表達）30二、Gene治療與社會倫理道德體細胞Gene治療符合倫理道德，沒有爭議。生殖細胞Gene治療可能改變正常人的遺傳特征，存在某些爭議。然而生殖細胞的基因治療又是一個不容回避的課題，因為它比體細胞基因治療更為徹底。所以，隨著分子生物學技術的發(fā)展，Gen治療技術的成熟，將回答倫理道德方面的問題，相信生殖細胞的基因治療將會被人們接受。31三、Gene治療的現(xiàn)狀與前景體細胞Gene治療臨床實驗已經開始，生殖細胞Gene治療正在完善。進行基因治療必須具備下列條件：32具備下列條件選擇適當的疾病，清楚疾病的發(fā)病機理，Gene的結構和功能。被糾

11、正的基因已克隆，并清楚Gene表達與調控機制與條件。選擇適當的受體細胞并在體外有效表達。安全有效的基因轉移方法，以及供利用的動物模型。33基因治療實例1、復合免疫缺陷綜合征的基因治療（人類Gene治療成功例子）。ADA缺乏癥-致死性疾病，患者由于腺苷酸脫氨酶（ADA）缺乏。 34ADA-Gene + vector （逆轉錄病毒） 重組分子 患者T Ly C IL-2刺激C分裂 導入 細胞生長分裂 10天 Gene表達 回輸患兒體內 12月治療一次10個月患兒體內ADA水平達正常人的25% 352、乙型血友病XR ，患者凝血因子缺乏，因子基因定位在Xq26.3q27.2。臨床表現(xiàn)，易出血，凝血時

12、間長，輕傷、小手術后常出血不止。發(fā)病率為1/30000。例如：我國學者薛京倫實施的F的基因治療。36逆轉錄病毒載體 +FcDNA 重組體 5 LTR F neo SV PSO LTR 3導入倉鼠細胞（CHO ）F表達；導入乙型血友病患者皮膚成纖維細胞（體外培養(yǎng)）F表達；91年，導入乙型血友病患者皮膚成纖維細胞（體外培養(yǎng)）回植病人皮下F基因表達，F(xiàn)基表達水平達正常人的5%。 是我國基因治療成功的例子。373、黑色素瘤的基因治療腫瘤Gene治療是人們十分關注的問題，進行了廣泛的探索。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤浸潤淋巴細胞TIL，它積聚腫瘤部位，并在該處持續(xù)存在而無副作用，利用此特點協(xié)助治療腫瘤。38例：細胞因

13、子基因治療和腫瘤壞死因子基因治療IL-2 Gene TNF-Gene （白介2） （腫瘤壞死因子） 逆轉錄病毒載體 導入 TIL（體外培養(yǎng)的自體細胞） 回植患者體內 TIL進入自體腫瘤部位，提高細胞因子殺傷腫瘤細胞 的作用。394、自殺基因的基因治療 原理：即用（逆轉錄）病毒載體將編碼某種酶的基因（自殺基因）轉染到腫瘤細胞中，此酶可將一種無害的藥物前體轉變?yōu)榧毎緩秃衔?，進而殺傷腫瘤細胞（腫瘤細胞不能復制而死亡）。這種基因載體只能在特定的組織或腫瘤中表達，而正常細胞中不表達。40如：自殺基因 + 病毒載體 轉染 重組載體 藥物前體 無毒Gene酶 藥物復合物 有毒 細胞死亡41例如： 單純皰疹病毒 哺乳動物細胞 HSV Gene-TK （在腫瘤細胞中表達，正常細胞中不表達） GeneTK GCV（胸苷類似物） TdR P p GCV-p 抑制DNA合成 脫氧胸苷酸 腫瘤細胞死亡 鄰近細胞死亡/凋亡（旁觀者效應）425、反義核酸基因治療反義技術：是指利用人工合成的反義RNA或DNA導入靶細胞，阻斷Gene的轉錄或復制，控制細胞的中間階段使編碼蛋白的Gene不能轉錄為mRNA 或阻斷翻譯相應蛋白. 43反義基因治療 DNA DNA RNA RNA 反義RNA 阻斷表達 44目前采用的技術：反義RNA表達載體Vector Cell 轉錄RNA 阻斷