變更場地的可比性研究-以注射用重組人生長激素為例(共37頁)

1、摘要(zhiyo)研究(ynji)背景：在研發(fā)過程中或正式(zhngsh)批準后生物制品的生產(chǎn)商經(jīng)常會發(fā)生一些變更。變更的原因為改進生產(chǎn)工藝、增大規(guī)模、擴建/新建車間、提高產(chǎn)品穩(wěn)定性和符合法規(guī)規(guī)定。當發(fā)生這些變更時，生產(chǎn)商通常需要評價產(chǎn)品的相關(guān)質(zhì)量指標，以證明變更沒有對藥品的安全和有效性產(chǎn)生不利的影響。研究目的：通過新建車間和老車間生產(chǎn)的注射用重組人生長激素比較研究，分析兩個車間注射用重組人生長激素產(chǎn)品質(zhì)量是否有差異，證明新車間產(chǎn)品是安全性和有效性。研究方法：1、工藝的研究：根據(jù)老車間的歷史數(shù)據(jù)，從被變更的工藝參數(shù)和關(guān)鍵質(zhì)量屬性的關(guān)系出發(fā)，在確定關(guān)鍵工藝參數(shù)和關(guān)鍵物料屬性的基礎(chǔ)上，研究是否由于

2、變更而導致終產(chǎn)品質(zhì)量的改變。2、所涉及廠房的評估：根據(jù)工藝研究結(jié)果對涉及到的變更進行風險評估，對變更的潛在影響進行分析。3、產(chǎn)品安全性和有效性研究：用產(chǎn)品放行標準為依據(jù)，通過比較兩個車間原液、半成品和成品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性，評價兩個產(chǎn)品的一致性。研究結(jié)果：用產(chǎn)品放行標準為依據(jù)，我們以新車間生產(chǎn)的20批原液和老車間原液歷史上數(shù)據(jù)為比較的基礎(chǔ)，進行了生物學活性、免疫化學性質(zhì)，原液純度、雜質(zhì)和污染情況比較，證明兩個車間的產(chǎn)品沒有顯著差異。強制降解試驗對比表明沒有發(fā)現(xiàn)兩個車間原液的降解產(chǎn)物的降解產(chǎn)物種類和降解速率有顯著差異。兩個車間3批原液的長期穩(wěn)定性沒有顯著差異。結(jié)構(gòu)確證研究表明兩個車間的一級和二級沒有

3、差異。大鼠體內(nèi)生物學活性符合要求，沒有顯著差異。加速和長期穩(wěn)定性研究表明，兩者從雜質(zhì)分布和降解速率上沒有顯著差異。產(chǎn)品質(zhì)量的相似性主要是由于新車間的在滿足產(chǎn)品的工藝要求的基礎(chǔ)上，并沒有關(guān)鍵工藝參數(shù)的變更。發(fā)酵和凍干規(guī)模的放大沒有對關(guān)鍵工藝參數(shù)的控制產(chǎn)生影響。這些證據(jù)表明新車間廠房和設(shè)備的驗證表明其達到了設(shè)計要求，并可以滿足注射用重組人生長激素的工藝要求。研究結(jié)論：由于市場對于產(chǎn)品需求增大經(jīng)常導致了廠房變更。用生產(chǎn)注射用重組人生長激素廠房變更為案例清楚表明：如果設(shè)計合理，在符合cGMP原則的理念的指導下，通過產(chǎn)品質(zhì)量放行標準進行嚴格的比較學研究證明了在中國廠房變更的可實現(xiàn)性。關(guān)鍵詞：重組(zhn

4、 z)人生長激素；可比性研究(ynji)；場地(chngd)變更，新建車間 Comparability Study of Injectable Recombinant Human Growth Hormone Produced from Original Facility and Newly Built FacilityAbstractBackground: Due to market increased demand of biological therapeutics, a new facility is required to meet the market need. A critic

5、al systemic evaluation using product quality specification for lot release is designed and implemented for the products produced from both of original facility and newly built facility. This has been demonstrated a very successful approach for the case study of recombinant therapeutic protein human

6、growth hormone in Shanghai, CHINA.Research Objective: By analysis and comparison of the CQA of the products produced from original facility and newly built facility, we would to convince our self and Chinese drug approval agencies that the facility change not only meet our market demand, but most im

7、portantly also meet the requirement of drug quality.Methods: The methods used were the risk analysis and control for all the possible changes in bio-process due to facility change, and the effects of differences between original facility and new facility on the quality of drug product. Finally, bioa

8、ssays and regular analytical assays were used to show the quality similarity of Drug Substances and Drug Product.Results: Our analytical data using 20 lots of drug substances from newly built facility to compare the data generated for the drug substances from the original facility for biological pot

9、ency, in-vivo activity, immunochemical properties, purity and impurity shows great similarity. Degradation of the products under stress conditions displayed similar profiles for degradation products and degradation rates. In addition, our structural analysis indicated the similarity of primary and s

10、econdary structures of the final products from the both facility. All the evidences determined the facility change has NO noticeable or very minimal concerns to manufacture our current product once the correct design and strategy were used.Conclusions: Our case study using injectable recombinant hum

11、an growth hormone clearly indicated that, in China, a successful facility change for biological therapeutics with similar drug quality profile in comparison with the original facility can be achieved if a logical design and cGMP concept is correctly implemented.Keywords: recombinant human growth hor

12、mone, comparable research, facility change, new facility目錄 TOC o 1-3 h z u HYPERLINK l _Toc354163997 第1章概述(i sh) 概述(i sh)重組(zhn z)人生長激素的發(fā)展(fzhn)歷史人生長激素（hGH）是由腦垂體前葉，含有嗜酸性顆粒的生長激素（GH）分泌細胞所分泌，為191個氨基酸構(gòu)成的肽類激素。正常情況下，生長激素hGH呈脈沖式分泌，生長激素（HGH）的分泌受 HYPERLINK /view/110042.htm t _blank 下丘腦產(chǎn)生的生長激素釋放素(GHRH)的調(diào)節(jié)，還受

13、HYPERLINK /view/26498.htm t _blank 性別、 HYPERLINK /view/418639.htm t _blank 年齡和 HYPERLINK /view/116121.htm t _blank 晝夜節(jié)律的影響， HYPERLINK /view/48319.htm t _blank 睡眠狀態(tài)下 HYPERLINK /view/825467.htm t _blank 分泌明顯增加。生長激素的主要生理功能是促進 HYPERLINK /view/66841.htm t _blank 神經(jīng)組織以外的所有其他組織生長；促進 HYPERLINK /view/1051481

14、.htm t _blank 機體合成代謝和蛋白質(zhì)合成；促進 HYPERLINK /view/16.htm t _blank 脂肪分解；對 HYPERLINK /view/1340.htm t _blank 胰島素有 HYPERLINK /view/462536.htm t _blank 拮抗作用；抑制 HYPERLINK /view/16023.htm t _blank 葡萄糖利用而使 HYPERLINK /view/42545.htm t _blank 血糖升高等作用。生長激素主要生理作用是對人體各種組織尤其是 HYPERLINK /view/15472.htm t _blank 蛋白質(zhì)有促

15、進合成作用，能刺激骨 HYPERLINK /view/205579.htm t _blank 關(guān)節(jié)軟骨和骨骺軟骨生長，因而能增高。人體一旦缺乏生長激素就導致生長停滯。1886年P(guān)ierre Marie 第一次在臨床上觀察到腦下垂體的功能，發(fā)現(xiàn)在肢端肥大病人中腦下垂體增大。20世紀約翰霍普金斯醫(yī)院的Harvey Cushing第一次試驗發(fā)現(xiàn)垂體前葉在人、小鼠和狗中具有促生長作用14。1921年，Evans和Long牛垂體前葉的提取物可以刺激正常大鼠的生長5，很快又發(fā)現(xiàn)此提取物可以使去垂體的大鼠保持生長6。促進生長的提取物發(fā)現(xiàn)可以刺激合成代謝效應(yīng)，降低尿中氮、鈣和磷的排泄 7,8。尿中這些元素的測

16、定提供了一個簡便的生物活性檢測方法，并用于在垂體提取物中分離活性組分。1944年Li和Evans第一次從牛垂體中分離現(xiàn)在已知為生長激素的多肽激素9。 由于牛生長激素沒有成功的促進人的長高10，因此人們開始從尸體或去除垂體的乳腺按患者的垂體中提取人生長激素11-13。在臨床試驗中，人和猴子的生長激素產(chǎn)生了合成代謝，并刺激了長高14-15。猿和非猿的生長激素的的生物化學差異被鑒別出來，同時解釋了生理效應(yīng)的物種特異性14。在1957和1985年之間，從尸體垂體提取的人生長激素被用于很多生長激素缺乏兒童的激素替代治療中16。在此期間，生長激素治療發(fā)現(xiàn)是有效并沒有什么副反應(yīng)。然而，人垂體生長激素是稀缺和

17、昂貴的。其他治療的應(yīng)用開發(fā)，或人生長激素的細胞作用機理的研究時不可能的?？茖W的進步改變了人生長激素領(lǐng)域的發(fā)展。人生長激素的DNA被克隆到了細菌質(zhì)粒上17，從此開辟了基因工程人生長激素商業(yè)化的道路。1985年被報道18發(fā)現(xiàn)兒童期使用人生長激素的兒童，成年后發(fā)現(xiàn)罹患致命的神經(jīng)退行性疾病-克雅病，因此美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）在上世紀80年代命令停止一切提取自死人腦垂體的hGH，并不準應(yīng)用于人體上。這一事件促發(fā)了重組人生長激素在臨床上商業(yè)化使用。隨著在細菌中大規(guī)模生產(chǎn)人生長激素，人生長激素的供應(yīng)不再成為人體或?qū)嶒炇疫M行各種治療研究的限制。20世紀80年代，基因工程興起。1981年Genente

18、ch公司利用大腸桿菌（E. Coli）包涵體技術(shù)研制出含192氨基酸的基因重組人生長激素Met-rhGH。與天然hGH相比，在N-末端多了一個蛋氨酸殘基，又稱為somatrem (Protropin)。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，1986年通過基因重組技術(shù)合成出含天然序列的重組人生長激素。上世紀(shj)90年代人們(rn men)純化了人生長激素受體蛋白，并克隆了基因19,20。通過(tnggu)X射線晶體衍射解析了人生長激素受體蛋白和人生長激素的相互作用的三維結(jié)構(gòu)21。生長激素受體結(jié)構(gòu)的知識對生長激素信號傳導機理的研究提供了新的視野和方向。直接單位點突變技術(shù)被用于對生長激素配體-受體相互作用的

19、研究22，分子方法也被用于生長激素受體激動劑的設(shè)計。人生長激素基因簇大約有66,500個堿基，位于第17染色體的長臂上23。由GH-N（正常生長激素基因），CS-L（類絨毛膜生長激素），CS-A（絨毛膜生長激素A），GH-V（生長激素變體基因，也是胎盤生長激素）和CS-B（絨毛膜生長激素B）5個基因家族組成。GH-N和GH-V有時也稱為GH-1和GH-2。絨毛膜生長激素也是胎盤催乳素基因。這5個基因的DNA序列高度同源。因此猜測生長激素基因家族通過基因復制而產(chǎn)生的。只有GH-N是正常健康必須的。切除或突變GH-N基因引起IA型生長激素缺乏，這是最嚴重的生長激素缺乏。具有這個缺陷的個體不能產(chǎn)生內(nèi)

20、源性生長激素。在出生或出生36個月引起有明顯的重度低血糖和生長延緩24。這些患者初始對生長激素替代有響應(yīng)，但治療1年內(nèi)由于生長激素抗體產(chǎn)生而抑制了生長。GH-N基因在垂體前葉表達，是在兒童和成年人中循環(huán)的主要形式25。生長激素是分泌蛋白，它的合成是一個含26個氨基酸的激素前體。當生長激素跨過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜轉(zhuǎn)運到貯藏粒中時信號肽被切除。GH-N表達的生長激素是一個22kDa，191個氨基酸的單鏈多肽。生長激素生物活性構(gòu)象含有兩個二硫鍵橋。22kDa GH-N基因產(chǎn)物在人的肝臟和受體結(jié)合，并刺激IGF-1的產(chǎn)生和長高。所有的人生長激素都是采用注射的方式給藥。皮下和肌內(nèi)注射時等價的26。因為有較小的疼痛感

21、，皮下注射更好。腹部的皮下注射比大腿的皮下注射有更高的生長激素血清濃度，然而刺激IGF-1的水平相當27。在循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)生長激素和高親和的生長激素結(jié)合蛋白（GHBP）結(jié)合，和這個蛋白結(jié)合延長了生長激素在循環(huán)系統(tǒng)的半衰期。給藥的時間不影響血清中生長激素的水平，晚上給藥模擬了生理的生長激素峰值28。生長激素的清除半衰期大約在2到3小時之間。通過在肝臟和腎臟的代謝而清除的，成年人比兒童清除速率更快29。人生長激素是非糖基化的，因此目前國際上已經(jīng)批準上市的重組人生長激素主要是由細菌（E. Coli）生產(chǎn)的，如Genentech的Nutropin，Eli Lilly的Humatrope，Novo Nord

22、isk的Norditrope等。也有用哺乳動物細胞生產(chǎn)的，如Serono的Saizen；以及由酵母生產(chǎn)的，如LG的Valtropin。 REF _Ref354145858 h 表 1列出了目前主要重組人生長激素的生產(chǎn)商和在美國和中國批準上市的時間。我國內(nèi)已上市產(chǎn)品均是由大腸桿菌（E. Coli）生產(chǎn)的。表 SEQ 表 * ARABIC 1 主要重組人生長激素的生產(chǎn)商生產(chǎn)商商品名美國批準日期中國批準日期美國禮來制藥Humatrope1987年3月2009年6月美國基因技術(shù)公司 HYPERLINK /scripts/cder/drugsatfda/index.cfm?fuseaction=Sear

23、ch.Set_Current_Drug&ApplNo=019676&DrugName=NUTROPIN&ActiveIngred=SOMATROPIN%20%5BrDNA%20origin%5D&SponsorApplicant=GENENTECH&ProductMktStatus=1 Nutropin1993年11月/輝瑞制藥Genotropin1995年8月2009年7月默克雪蘭諾Saizen1996年10月2008年4月 HYPERLINK / t _blank 諾和諾德制藥有限公司 HYPERLINK /scripts/cder/drugsatfda/index.cfm?fuseact

24、ion=Search.Overview&DrugName=NORDITROPIN Norditropin Flexpro2000年6月2008年6月 HYPERLINK /WS01/CL0860/56293.html t _blank 山德士制藥有限公司 HYPERLINK /scripts/cder/drugsatfda/index.cfm?fuseaction=Search.Overview&DrugName=OMNITROPE Omnitrope2006年5月/上海聯(lián)合賽生物工程有限公司珍怡/1999年7月 HYPERLINK /list/co,c,2046275,000000,10,1

25、.html t _blank 長春金賽藥業(yè)有限責任公司賽增/1998年 HYPERLINK / t _blank 安徽安科生物工程股份有限公司安蘇萌/1999年*met-hGH已下市重組人生長激素(shn chn j s)在大腸桿菌中的表達有兩種形式，第一種形式是甲硫氨酸生長激素m-hGH，他和天然生長激素有一個(y )氨基酸的差異，在N端多了一個甲硫氨酸，美國基因技術(shù)(jsh)公司和諾和諾德最初的產(chǎn)品就是m-hGH，目前這種形式的重組人生長激素已經(jīng)下市。第二種形式是真實的人生長激素。一些研究表明甲硫氨酸生長激素比真實的人生長激素產(chǎn)生較高的抗體30，美國禮來公司的Humatrope是第一個批準

26、的和天然序列一致的重組人生長激素31。甲硫氨酸殘基和細菌蛋白結(jié)合的痕量的人生長激素比單純的甲硫氨酸人生長激素產(chǎn)生更高的免疫原性，這個問題可以通過純化而緩解?？贵w的產(chǎn)生很少干擾人生長激素的生物活性，因為抗體的親和性和濃度均較低31。生長激素抗體水平使得市場不再追隨甲硫氨酸人生長激素。哺乳動物細胞的人生長激素有非常低的免疫原性32。目前主要的重組人生長激素的生產(chǎn)商均提供的是和天然人生長激素一致的重組人生長激素。大多數(shù)生產(chǎn)商采用的是大腸桿菌系統(tǒng)，因為目前批準上市的產(chǎn)品證明大腸桿菌系統(tǒng)表達的人生長激素的免疫原性并未對產(chǎn)品的有效性和安全性產(chǎn)生不利的影響采用大腸桿菌系統(tǒng)是最經(jīng)濟的，而且大腸桿菌系統(tǒng)已經(jīng)是比

27、較成熟的基因工程技術(shù)，上游構(gòu)建和下游純化均有比較成熟的技術(shù)，工藝控制比較穩(wěn)定。重組人生長激素是一個單鏈多肽激素，通常以生物活性的單體存在，但正像大家所知的他易聚集為二聚體，并在熱和機械應(yīng)力下（如制備過程中的搖動等）轉(zhuǎn)化為多聚體而失去活性。生長激素的藥物配方趨向于不穩(wěn)定，尤其在溶液中，生長激素容易生成降解產(chǎn)物，如脫氨和氧化產(chǎn)物。主要的降解反應(yīng)是1）直接水解脫氨或通過環(huán)狀琥珀酰亞胺中間體而形成L-asp-hGH，L-iso-asp-hGH， D-asp-hGH以及D-iso-asp-hGH；2）在14和125位上甲硫氨酸殘基的氧化；3）聚集；4）肽骨架的截斷。凍干狀態(tài)以及溶液狀態(tài)的生長激素的主要降

28、解產(chǎn)物是脫氨組分。脫氨發(fā)生在149的Asn天冬酰胺上，在152的天冬酰胺殘基上也會產(chǎn)生少量的脫氨。在溶液中人生長激素在14和125位上的甲硫氨酸極易氧化。溶液中hGH氧化形成亞砜主要原因是配方中的溶解氧。蒸餾水中氧氣的溶解度大約是200uM，而對于4IU/ml的生長激素來說，其濃度相當于60nM。在正常的儲存條件下，溶解氧的量超過了3000倍生長激素的化學計量，所以是不能通過塞蓋或包裝前對緩沖溶液除氣來解決溶解氧的問題。很多降解反應(yīng)多可以通過凍干從蛋白質(zhì)中移走水分而顯著降低，所以現(xiàn)在生長激素通常都是凍干的，在4以凍干形式儲存的凍干劑型，使用前再重新溶解，大部分的商品重組人生長激素是凍干形式的。

29、除了常見的凍干形式制劑外，考慮到使用方便和患者的依從性，人生長激素的溶液制劑和緩釋制劑的研究也很多。目前國際上諾和諾德和美國基因技術(shù)公司均有溶液劑型的生長激素上市，但由于人生長激素在溶液中很不穩(wěn)定，因此貨架期要比凍干劑型短很多，而且對運輸?shù)囊笠脖容^高，溶液劑型對溫度的敏感性比凍干劑型高很多。從二十世紀八九十年代至今，普遍認為在冷凍干燥(gnzo)過程中冷凍和干燥都會引起蛋白質(zhì)的變性。Dean33認為在冷凍過程中缺少保護劑的情況下，蛋白質(zhì)將失去(shq)活性；而脫水過程本身能使蛋白質(zhì)損傷，從而復水后蛋白失去活性。保護劑的作用一般認為是通過與蛋白的氫鍵作用而保護了蛋白由于失去水分而裸露的基團。保

30、護劑的濃度和凍干速率相關(guān)，由于對于藥物制劑來說保護劑的濃度不能過高，所以要有較大的凍干速率。人生長激素(shn chn j s)制劑的穩(wěn)定性是和水分以及氧有密切的關(guān)系，在低的水分含量以及最小氧的存在下制劑的穩(wěn)定性最好34。但是在不加保護劑的情況下，如果單純降低水分含量可能適得其反，因為蛋白如果失去最后一層水分的保護，將因為基團的暴露而聚集變性。有報道35人生長激素在含水量4.6%時完全變性，而在含水量7.6%時沒有變性。所以凍干過程應(yīng)該加入合適的保護劑以及其他輔料，并且含水量不是越低越好。較少氧對蛋白的氧化，可以通過充氮氣來保護36。冷凍干燥過程中的降溫速率的選擇與保護劑的濃度有關(guān)，如果保護劑

31、濃度很高，以不太大的降溫速率就能使溶液以玻璃態(tài)固化。很多人認為快速冷凍有益于生物活性，因為快速冷凍可以減少緩沖液結(jié)晶引起的pH變化，減低蛋白質(zhì)局部高離子強度的接觸時間，減少變性可能發(fā)生的時間。但是很多證據(jù)表明凍融和冷凍干燥后，快速冷凍對蛋白的活性回收不利，并對貯藏期凍干產(chǎn)品的穩(wěn)定性也有影響37。用磷酸緩沖液和甘露醇作為賦形劑體系，在pH7.47.8時，冷凍速率對人生長激素的可溶性聚合物形成的影響檢測不到，可是對不溶性聚合物形成的影響是顯著的，冷凍速率越高聚合物越多。不溶性聚合物的形成被冷凍前的低pH加速。凍干溶液的pH很重要，對脫氨的影響較大。選用不同的緩沖溶液對pH的要求也不一樣。當選用磷酸

32、鹽作為緩沖液時，在較低的pH（6.0）下，有較少的脫氨組分，但在此pH下較易產(chǎn)生聚集38。人生長激素溶液劑型就是選用較低的pH，添加非離子表面活性劑防止聚集。人生長激素最常用的凍干保護劑是甘氨酸和甘露醇。兩種配方比很重要，根據(jù)劑量的不同兩種物質(zhì)加入的比例是不同一樣的。甘露醇作為保護劑和甘氨酸一起起到穩(wěn)定凍干制劑的作用。為了保證重新溶解后人生長激素的穩(wěn)定，也有在溶解水中加入非離子表面活性劑來增加溶液的物理穩(wěn)定性，如諾和諾德的NorditropinSimpleXx，在溶解水中加入泊洛沙姆188以增加物理穩(wěn)定性。表2列出了價格典型的商品化重組人生長激素的配方。表 SEQ 表 * ARABIC 2常見

33、商品化重組人生長激素的凍干配方*商品名劑型規(guī)格賦形劑緩沖鹽rhGH甘氨酸甘露醇蔗糖NaH2PO4Na2HPO4pHGenotropin凍干劑型4.5IU1.527.60/0.300.306.717.45.82.21.8/0.320.326.7Humatrope155525/01.137.5186618/01.367.5Nutropin1551.745/0.451.37.4Saizen155/34.26.5-8.5*來源于FDA網(wǎng)站相關(guān)產(chǎn)品的說明書 REF _Ref354161124 h 表 2中可以(ky)看到大多數(shù)上市產(chǎn)品采用的甘氨酸和甘露醇配方系統(tǒng)。本文討論的產(chǎn)品就是采用冷凍干燥技術(shù)制備的

34、凍干粉針劑型，也采用和上市產(chǎn)品同樣(tngyng)的甘氨酸和甘露醇體系，配方(pi fng)均得到批準，長期穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)，凍干劑型和溶液劑型相比較在貨架期要穩(wěn)定的很多，這也是目前市場上還是主要以凍干劑型為主的原因。場地變更的原因注射用重組人生長激素是上海聯(lián)合賽生物工程有限公司已上市十多年的老產(chǎn)品，隨著市場的擴大，原生產(chǎn)車間已不能滿足市場需求，為此在原址上新建了注射用重組人生長激素生產(chǎn)車間，用于注射用重組人生長激素的生產(chǎn)。由于在原址上新建，原質(zhì)量檢測、原輔材料采購和儲存，以及質(zhì)量保證系統(tǒng)均采用原來的系統(tǒng)，檢測、原輔材料和質(zhì)量保證系統(tǒng)的風險較低。本次是在原廠址增建了一個注射用重組人生長激素的生產(chǎn)

35、線，包括了原液生產(chǎn)車間和制劑生產(chǎn)車間，對于本次新建車間經(jīng)歷了下面幾個階段。表SEQ 表 * ARABIC3新增車間經(jīng)歷的階段流程階段要求設(shè)計前根據(jù)歷史研究和生產(chǎn)數(shù)據(jù)分析和評估原液和制劑的關(guān)鍵工藝參數(shù)，并分析其對終產(chǎn)品質(zhì)量屬性的影響。廠房設(shè)計根據(jù)關(guān)鍵工藝參數(shù)的分析結(jié)果，提出對廠房和設(shè)備的工藝設(shè)計要求。廠房和設(shè)備應(yīng)可以滿足有效控制關(guān)鍵工藝參數(shù)的要求。安裝確認完成廠房和設(shè)備3Q試制在新建車間進行試制，考察車間、設(shè)備、人員等是否可以按照預定的工藝參數(shù)進行生產(chǎn)，并得到合格的產(chǎn)品。工藝驗證根據(jù)是試制的結(jié)果完善工藝規(guī)程和批記錄等，然后進行工藝驗證。比較研究新車間和老車間的原液和成品進行全面的藥學比較研究。持

36、續(xù)改進新老車間進行持續(xù)的考察和比較，對更多批次的原液和成品進行回顧性的驗證，進一步確認工藝的穩(wěn)定性。在新車間的設(shè)計前根據(jù)實際需要，放大了發(fā)酵規(guī)模和凍干規(guī)模，保持其他操作單元規(guī)模不變。對于生物制品，其生產(chǎn)工藝是關(guān)鍵的，因此在整個新車間發(fā)展階段，以不改變關(guān)鍵工藝參數(shù)和關(guān)鍵質(zhì)量屬性為前提進行設(shè)計、實施和驗證。注射用重組人生長激素工藝流程注射用重組人生長激素是凍干粉針劑型，其原液通過基因工程技術(shù)將目的基因插入載體質(zhì)粒中，然后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌而得到可以表達重組人生長激素的大腸桿菌工程菌，再通過大腸桿菌的培養(yǎng)使之生產(chǎn)目的蛋白重組人生長激素。由于重組人生長激素是通過大腸桿菌來生產(chǎn)的，因此需要將目的產(chǎn)物和

37、大腸桿菌其他組分如宿主蛋白等進行分離。培養(yǎng)后的大腸桿菌需要通過一系列的工藝步驟進行分離純化后才能得到純凈的重組人生長激素原液。得到的原液經(jīng)過配制、除菌過濾、凍干和包裝等制劑過程，得到終產(chǎn)品注射用重組人生長激素凍干粉針。對于藥品的生產(chǎn)，圖1形象的給出了關(guān)鍵物料屬性和關(guān)鍵工藝參數(shù)對關(guān)鍵質(zhì)量屬性的影響。根據(jù)這一定義，工藝狀態(tài)取決于該工藝的關(guān)鍵工藝參數(shù)和輸出物料的關(guān)鍵物料屬性39。藥品生產(chǎn)單元操作CMAs輸入物料CQAs產(chǎn)出物CPPs關(guān)鍵工藝參數(shù)圖 SEQ 圖 * ARABIC 1關(guān)鍵(gunjin)物料屬性（CMAs）和關(guān)鍵工藝(gngy)參數(shù)（CPPs）對關(guān)鍵質(zhì)量(zhling)屬性（CQAs）的

38、影響生物制品由于分子量大，結(jié)構(gòu)復雜，對于分析方法和儀器設(shè)備要求頗高；盡管如此，現(xiàn)代分析技術(shù)難以按照個體分子的2級及3級結(jié)構(gòu)進行完整表征化測定，因此主要通過控制其生產(chǎn)工藝來說明批次生產(chǎn)的相似性；而生產(chǎn)工藝是通過多個生產(chǎn)單元操作來實現(xiàn)的。注射用重組人生長激素的生產(chǎn)工藝也被分為多個單元操作， REF _Ref353921443 h 圖 2給出了注射用重組人生長激素生產(chǎn)工藝流程圖。流程圖中根據(jù) REF _Ref353921457 h 圖1的方法，給出了每個單元操作的輸入物料和產(chǎn)出物。從圖中可以看出，上一步驟的產(chǎn)出物是下一步驟的輸入物料，這里將工藝的產(chǎn)出物除原液、半成品和成品外的工藝產(chǎn)出物均定義為中間品

39、。根據(jù)多年的生產(chǎn)經(jīng)驗對每一個單元操作的物料屬性和工藝參數(shù)進行分析，并評估其對關(guān)鍵質(zhì)量屬性的影響。當輸入物料的某個質(zhì)量屬性（如水分、純度）的變化能顯著影響產(chǎn)出物的屬性時，則定義其為關(guān)鍵物料屬性。當工藝參數(shù)運行參數(shù)（如流速、轉(zhuǎn)速）或工藝狀態(tài)變量（如溫度、壓力、pH）的實際變化能顯著影響產(chǎn)出物料的屬性時，則定義該工藝參數(shù)是關(guān)鍵的40。新建車間輸入物料和產(chǎn)出物的關(guān)鍵屬性CMAs和CQA應(yīng)和老車間保持一致。細胞庫（MCB和WCB） 培養(yǎng)基、工藝空氣、純化水 發(fā)酵培養(yǎng)中間品1離心捕獲菌體中間品1 中間品2初純中間品2 各種鹽、純化水 中間品3精純重組人生長激素原液中間品3 層析介質(zhì)、過濾膜、注射用水 配制

40、中間品4重組人生長激素原液 輔料、注射用水 除菌過濾半成品中間品4 過濾膜、工藝空氣、注射用水 灌裝中間品5半成品 膠塞、西林瓶、注射用水 凍干中間品6中間品5 氮氣 釓蓋成品凍干品 鋁蓋 包裝包裝成品成品 瓶貼、說明書、外包裝 輸入物料產(chǎn)出物生產(chǎn)操作單元圖 SEQ 圖 * ARABIC 2 注射用重組人生長激素(shn chn j s)工藝流程圖（下劃線表示(biosh)單元操作的產(chǎn)出物）從總體(zngt)的工藝流程上看原液是成品關(guān)鍵物料，新車間原液的關(guān)鍵質(zhì)量屬性和老車間不應(yīng)有顯著差異，原液后面工藝的變更不對原液的質(zhì)量屬性產(chǎn)生不利的影響。研究(ynji)目的與意義根據(jù)(gnj)關(guān)于貫徹實施的

41、通知（國食藥監(jiān)安2011101號）和關(guān)于進一步明確眼用制劑等產(chǎn)品實施新修訂藥品GMP期限的通知（國食藥監(jiān)安2012106號）要求，涉及無菌檢查項目制劑和原料藥均應(yīng)在2013年12月31日前達到新修訂的藥品GMP要求。其他應(yīng)在2015年12月31日前達到新修訂藥品GMP要求。生物制品均應(yīng)在2013年12月31日前達到新修訂的藥品GMP要求。藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（2010年修訂）（簡稱新版GMP）41是一次重大的GMP修訂，特別是針對無菌藥品的生產(chǎn)提高了要求，很多生產(chǎn)商為符合新版GMP要求必須對原有廠房進行改建，與此同時很多生物制品通過改建或擴建淘汰老的工藝，采用新工藝。如何將變更后的產(chǎn)品與變更前

42、的產(chǎn)品進行對比是很多生產(chǎn)商面臨的問題。生產(chǎn)方法、工藝、質(zhì)控檢測方法以及產(chǎn)品表征檢測方法的改進，使生產(chǎn)商能夠較好對變更對生產(chǎn)工藝和生產(chǎn)設(shè)施的影響進行識別和評估，這使得從藥學上證明其有可比性成為可能。比如，近年來大分子分離技術(shù)、產(chǎn)品以及工藝相關(guān)技術(shù)大大改進，生產(chǎn)商在建立產(chǎn)品和生物活性表征方面經(jīng)驗證的靈敏方法以及對這些檢測中差異顯著性評價方面所具有的能力，有能力在不必重復進行臨床藥效研究的情況下，對產(chǎn)品可比性研究進行評價。如果可比性試驗證明生產(chǎn)變更并未對產(chǎn)品的安全性、特性、純度和效價產(chǎn)生影響，可認為這兩種產(chǎn)品具有可比性?？杀刃匝芯渴菑S房變更的關(guān)鍵，本文嘗試以注射用重組人生長激素新建廠房的可比性研究為

43、例，對如何評價產(chǎn)品變更前后的可比性進行探討。注射用重組人生長激素產(chǎn)品介紹藥品的安全性和有效性是通過上市前非臨床和臨床試驗而評價，藥品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性通過臨床期間的藥學研究而最終確定的，因此對于已上市產(chǎn)品的變更，其關(guān)鍵質(zhì)量屬性不應(yīng)發(fā)生變更，否則需要追加非臨床或臨床試驗來確認其安全性和有效性。注射用重組人生長激素產(chǎn)品已上市10多年，歐洲藥典、美國藥典和中國藥典均收錄了此產(chǎn)品，具有比較成熟的分析方法，質(zhì)量標準也是基于對產(chǎn)品和工藝的了解而建立的，因此質(zhì)量標準反映了其關(guān)鍵質(zhì)量屬性。下面從原液、半成品和成品3個方面分別介紹新車間產(chǎn)品的研究方法和質(zhì)量標準。原液的研究方法和質(zhì)量標準重組人生長激素的關(guān)鍵質(zhì)量屬性包

44、括一級、二級和三級結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、免疫化學性質(zhì)、生物活性、純度和雜質(zhì)以及產(chǎn)品的穩(wěn)定性，原液的研究方法應(yīng)包含上述內(nèi)容。重組(zhn z)人生長激素的結(jié)構(gòu)(jigu) REF _Ref353918240 h 圖 3給出了人生長激素的一級氨基酸序列(xli)和二硫鍵位置。圖 SEQ 圖 * ARABIC 3人生長激素一級結(jié)構(gòu)圖42重組人生長激素的分子式為C990H1528N262O300S7，分子量22125道爾頓。其他結(jié)構(gòu)信息列于 REF _Ref353935249 h 表4中。新車間重組人生長激素原液應(yīng)進行結(jié)構(gòu)的確證，證明其和天然的人生長激素的結(jié)構(gòu)具有一致的一級和二級結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)確證檢測包括：肽圖

45、質(zhì)譜覆蓋率、質(zhì)譜分子量、N末端和C末端序列檢測、二硫鍵配對檢測和圓二色譜法檢測。兩個車間各取13批原液進行結(jié)構(gòu)檢測， REF _Ref353935249 h 表4列出了檢測項目和兩個車間原液結(jié)構(gòu)的一致性評價標準。表 SEQ 表 * ARABIC 4人生長激素結(jié)構(gòu)確證研究內(nèi)容檢測項目理論值一致性標準質(zhì)譜分子量22,125Dalton3批原液檢測，分子量和理論值誤差小于1%；和對照品平均分子量相差小于20Dalton肽圖質(zhì)譜覆蓋率氨基酸序列兩種酶酶切，分子量覆蓋率應(yīng)大于90%圓二色譜法alfa螺旋占多數(shù)相同條件檢測，應(yīng)和對照品譜圖一致二硫鍵配對兩對二硫鍵：Cys53-Cys165和Cys182-C

46、ys189僅有C53-C165和C182和C189兩對分子內(nèi)二硫鍵，沒有錯配和分子間二硫鍵N末端序列NH2-FPTIPLSRLFN末端10個殘基序列為NH2-FPTIPLSRLFC末端序列SVEGSCGF-COOHC末端8個殘基序列為SVEGSCGF-COOH放行(fngxng)標準注射用重組人生長激素(shn chn j s)產(chǎn)品已上市10多年，并且(bngqi)是在中華人民共和國藥典中有收錄，因此質(zhì)量標準反映了其關(guān)鍵質(zhì)量屬性，下面從原液、半成品和成品3個方面分別介紹新車間產(chǎn)品的研究方法和質(zhì)量標準。原液的研究方法和質(zhì)量標準重組人生長激素的關(guān)鍵質(zhì)量屬性包括一級、二級和三級結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、免疫化

47、學性質(zhì)、生物活性、純度和雜質(zhì)，以及產(chǎn)品的穩(wěn)定性，因此原液的研究方法應(yīng)從上述方面進行。重組人生長激素(shn chn j s)的結(jié)構(gòu) REF _Ref353918240 h 圖 3給出了人生長激素(shn chn j s)的一級氨基酸序列和二硫鍵位置。圖 SEQ 圖 * ARABIC 4人生長激素(shn chn j s)一級結(jié)構(gòu)圖重組人生長激素的分子式為C990H1528N262O300S7，分子量22125道爾頓。其他結(jié)構(gòu)信息列于 REF _Ref353935249 h 表4中。新車間重組人生長激素原液，應(yīng)進行結(jié)構(gòu)的確證，證明其和天然的人生長激素的結(jié)構(gòu)具有一致的一級和二級結(jié)構(gòu)。兩個車間各取1

48、3批原液進行結(jié)構(gòu)檢測，檢測包括：肽圖質(zhì)譜覆蓋率、質(zhì)譜分子量、N末端和C末端序列檢測、二硫鍵配對檢測和圓二色譜法檢測。 REF _Ref353935249 h 表4列出了這些檢測的理論值和兩個車間原液結(jié)構(gòu)的一致性評價標準。表 SEQ 表 * ARABIC 5人生長激素結(jié)構(gòu)確證研究內(nèi)容檢測項目理論值一致性標準質(zhì)譜分子量22,125Dalton3批原液檢測，分子量和理論值誤差小于1%；和對照品平均分子量相差小于20Dalton肽圖質(zhì)譜覆蓋率氨基酸序列兩種酶酶切，分子量覆蓋率應(yīng)大于90%圓二色譜法alfa螺旋占多數(shù)相同條件檢測，應(yīng)和對照品譜圖一致二硫鍵配對兩對二硫鍵：Cys53-Cys165和Cys1

49、82-Cys189僅有C53-C165和C182和C189兩對分子內(nèi)二硫鍵，沒有錯配和分子間二硫鍵N末端序列NH2-FPTIPLSRLFN末端10個殘基序列為NH2-FPTIPLSRLFC末端序列SVEGSCGF-COOHC末端8個殘基序列為SVEGSCGF-COOH放行(fngxng)標準新車間重組人生長激素原液不僅應(yīng)符合放行(fngxng)檢驗標準，還應(yīng)基于收集的歷史數(shù)據(jù)，通過統(tǒng)計學方法建立兩個車間比較的驗收標準。根據(jù)分析方法的性質(zhì)，可以將放行標準分為定量標準和定性標準，定性標準作為定量標準的補充，更全面的展現(xiàn)產(chǎn)品(chnpn)雜質(zhì)增減情況。重組人生長激素主要相關(guān)雜質(zhì)有：脫氨組分、氧化組分

50、、多聚體、工藝中被截斷的人生長激素片段。主要工藝雜質(zhì)有：內(nèi)毒素、宿主菌體蛋白、外源DNA、微生物。內(nèi)控放行標準的檢測方法涵蓋了上述雜質(zhì)的分析。因此可以通過對放行檢測結(jié)果的比較，證明廠房的變更對原液的理化性質(zhì)、純度和雜質(zhì)是否產(chǎn)生了不利影響。新車間采用至少10批次原液和老車間進行比較，原液應(yīng)符合放行標準，同時對定量檢測數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，比較兩個車間的平均值和標準偏差，判斷兩者是否有顯著差異。 REF _Ref353931977 h 表 6列出了主要的放行標準檢測項目，檢測方法基本是藥典方法，分析方法可靠并均經(jīng)過驗證。表 SEQ 表 * ARABIC 6 重組人生長激素原液的放行標準檢測項目分析方法外

51、觀目檢鑒別方法（1）中華人民共和國藥典二部重組人生長激素項下的鑒別（1）項方法（反相色譜法）方法（2）中華人民共和國藥典二部重組人生長激素項下的鑒別（4）項方法（等電聚焦電泳IEF）檢查相關(guān)蛋白中華人民共和國藥典二部注射用重組人生長激素項下的相關(guān)蛋白檢測方法（反相色譜法）高分子蛋白中華人民共和國藥典二部注射用重組人生長激素項下的高分子蛋白檢測方法（分子排阻色潽法）電荷異構(gòu)體等電聚焦電泳細菌內(nèi)毒素中華人民共和國藥典二部附錄XI E殘余宿主蛋白中華人民共和國藥典二部重組人生長激素項下的菌體蛋白殘余量檢測方法DNA殘留中華人民共和國藥典二部重組人生長激素項下的外源性DNA殘留量下的方法含量中華人民共

52、和國藥典二部注射用重組人生長激素項下方法生物學活性中華人民共和國藥典二部附錄XII P生長激素生物測定法是采用去垂體大鼠體重法和脛骨法進行的生物活性測定法，和生長激素的體內(nèi)藥效學研究采用相同的方法，因此去垂體大鼠體重法和脛骨法測定結(jié)果也反映了動物體內(nèi)藥效結(jié)果。中華人民共和國藥典二部重組(zhn z)人生長激素各論中規(guī)定生物活性：照生長激素生物測定法（附錄XII P）依法檢查(jinch)，每1mg蛋白中含生長激素(shn chn j s)不得少于2.5單位（每年至少測定一次）。兩個車間各取13批同時進行重組人生長激素體內(nèi)生物學活性的檢驗，兩個車間原液的生物活性應(yīng)符合中華人民共和國藥典重組人生長

53、激素各論中的規(guī)定，兩者的活性平均值和標準偏差應(yīng)沒有顯著差異，以此證明廠房的變更未改變其體內(nèi)生物學活性。免疫化學性質(zhì)免疫化學性質(zhì)的檢測可以采用免疫斑點法或western blot方法，兩種方法均針對重組人生長激素的抗原特性進行檢測。免疫化學性質(zhì)的研究，可以證明兩個車間生產(chǎn)的原液抗原特異性一致性，它的一致性可以進一步說明兩者結(jié)構(gòu)的一致。強制降解試驗和長期穩(wěn)定性新車間生產(chǎn)的原液可以通過高溫和光照強制破壞試驗，檢測相關(guān)蛋白、高分子蛋白質(zhì)、電荷異構(gòu)體、含量，比較兩者之間降解物和降解速率。在工藝不變的情況下降解產(chǎn)物類型和降解速率應(yīng)該沒有顯著變化，新車間原液和老車間強制降解比較應(yīng)不得產(chǎn)生新的降解產(chǎn)物。重組人

54、生長激素原液為冷凍保存，因此無需進行加速穩(wěn)定性考察，僅進行長期穩(wěn)定性考察。將新車間和老車間的長期穩(wěn)定性歷史數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和比較，降解速率和雜質(zhì)類別上應(yīng)沒有明顯的差異。重組人生長激素原液長期穩(wěn)定性考察方法如下：擬考察點為0、3、6、12、18、24、36個月。原液包裝形式和老車間一致，貯存溫度28。按照中國藥典2010年版附錄XIX C“原料藥與藥物制劑穩(wěn)定性試驗指導原則”，本品為注射劑，指導原則規(guī)定的重點考察項目為：外觀色澤、含量、pH值、可見異物、有關(guān)物質(zhì)。因此重點考察項目為：性狀、含量、pH值、可見異物、有關(guān)物質(zhì)（相關(guān)蛋白、高分子蛋白）、水分指標。在0、24和36個月進行全項檢測。半成品

55、的研究方法和質(zhì)量標準重組人生長激素原液和輔料按照處方比例進行混合后除菌過濾得到半成品。半成品的放行標準包括：內(nèi)毒素、無菌、蛋白含量。新車間半成品應(yīng)符合放行標準，和歷史數(shù)據(jù)比較沒有顯著差異。半成品除放行標準的檢測還應(yīng)增加穩(wěn)定性考察，在室溫下，考察0、8、16和24小時半成品相關(guān)蛋白、高分子蛋白和含量，新車間半成品在考察期內(nèi)應(yīng)符合成品的放行標準，比較兩個車間上述指標平均值和相對標準偏差，兩個車間應(yīng)無顯著差異。成品(chngpn)的研究方法和質(zhì)量標準注射用重組人生長激素已經(jīng)被錄入(l r)中華人民共和國藥典，因此其放行標準是不低于中華人民共和國藥典2010年版的各論的要求(yoqi)，放行檢測涵蓋了

56、注射用重組人生長激素理化性質(zhì)、純度和雜質(zhì)、生物學活性等產(chǎn)品關(guān)鍵質(zhì)量屬性?？梢宰鳛樵u價兩個車間產(chǎn)品質(zhì)量的比較標準。新車間注射用重組人生長激素的研究，不僅要求符合放行標準，還應(yīng)進行生物活性和穩(wěn)定性考察。新車間至少3個連續(xù)批和老車間進行比較，比較方法如下：半成品和成品放行檢測中的定量項目應(yīng)采用統(tǒng)計分析的方法和老車間的歷史數(shù)據(jù)比較，比較平均值，相對標準偏差。兩個車間同期生產(chǎn)的產(chǎn)品均應(yīng)符合質(zhì)量標準。對兩個車間同期生產(chǎn)的產(chǎn)品雜質(zhì)進行分析，應(yīng)沒有新增雜質(zhì)的出現(xiàn)。兩個車間的產(chǎn)品同時進行高溫和光照的強制降解試驗，比較兩個車間產(chǎn)品在高溫和光照情況下降解速率是否有不同，雜質(zhì)類型是否有差異。新車間連續(xù)3批產(chǎn)品進行加速

57、穩(wěn)定性考察，采用市售小包裝貯存，溫度252，濕度60%5%。參照中國藥典2005年版附錄XIX C原料藥與藥物制劑穩(wěn)定性試驗指導原則以及化學藥物穩(wěn)定性研究技術(shù)指導原則設(shè)置考察時間點，考察點為0、1、3、4.5和6個月。重點考察項目為：性狀、含量、pH值、可見異物和有關(guān)物質(zhì)（相關(guān)蛋白和高分子蛋白）。0和6個月進行全項檢測。新車間和老車間產(chǎn)品的歷史數(shù)據(jù)進行比較，兩者在降解速率和雜質(zhì)類別上應(yīng)沒有明顯的差異。新車間每個規(guī)格至少3批進行長期穩(wěn)定性考察，采用市售小包裝貯存，貯存溫度53。按照中國藥典2005年版附錄XIX C原料藥與藥物制劑穩(wěn)定性試驗指導原則以及化學藥物穩(wěn)定性研究技術(shù)指導原則設(shè)置考察時間點

58、。時間點在第一年一般為每3個月末一次，第二年每6個月末一次，以后每年末一次。即第0、3、6、9、12、18、24、36個月末取樣檢測考察指標。重點考察項目為：性狀、含量、pH值、可見異物和有關(guān)物質(zhì)（相關(guān)蛋白和高分子蛋白）。0、24和36個月分別進行全項檢測。和老車間同規(guī)格產(chǎn)品進行比較，兩者在穩(wěn)定性上應(yīng)沒有明顯差異。表 SEQ 表 * ARABIC 7注射用重組人生長激素放行標準檢測方法檢測項目分析方法外觀目檢鑒別方法（1）中華人民共和國藥典二部重組人生長激素項下的鑒別（1）項方法（反相色譜法）方法（2）中華人民共和國藥典二部重組人生長激素項下的鑒別（4）項方法（等電聚焦電泳IEF）檢查水分費休

59、氏法容量滴定法相關(guān)蛋白中華人民共和國藥典二部注射用重組人生長激素項下的相關(guān)蛋白檢測方法（反相色譜法）高分子蛋白中華人民共和國藥典二部注射用重組人生長激素項下的高分子蛋白檢測方法（分子排阻色潽法）電荷異構(gòu)體等電聚焦電泳異常毒性中華人民共和國藥典二部附錄XI C細菌內(nèi)毒素中華人民共和國藥典二部附錄XI E裝量差異中華人民共和國藥典二部附錄I B注射劑無菌中華人民共和國藥典二部附錄XI H 薄膜過濾法酸堿度中華人民共和國藥典二部附錄 VI H溶液的澄清度與顏色中華人民共和國藥典二部附錄IX A第一法和附錄IX B可見異物中華人民共和國藥典二部附錄IX H燈檢法不溶性微粒中華人民共和國藥典二部附錄IX

60、 C第一法含量中華人民共和國藥典二部注射用重組人生長激素項下方法生物學活性中華人民共和國藥典二部重組人生長激素項下方法初步(chb)風險(fngxin)評估輸入(shr)物料的變更分析和風險評估根據(jù) REF _Ref353921443 h 圖 2的工藝流程圖，首先對注射用重組人生長激素工藝中的輸入物料分別進行分析，找出由于廠房變更而引起變化的輸入物料，然后針對這些輸入物料進行變更的風險識別和評估。 REF _Ref353922859 h 表8將注射用重組人生長激素的全部輸入物料列出，并對可能引起變化的物料進行了識別。表SEQ 表 * ARABIC8輸入物料的變更分析物料名稱是否變更風險分析細胞