變形梯度凝膠電泳(共6頁)

1、變性(binxng)梯度凝膠電泳變性(binxng)梯度凝膠電泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE），是根據(jù)(gnj)DNA在不同濃度的變性劑中解鏈行為的不同而導致電泳遷移率發(fā)生變化，從而將片段大小相同而堿基組成不同的DNA片段分開。具體而言，就是將特定的雙鏈DNA片段在含有從低到高的線性變性劑梯度的聚丙烯酰胺凝膠中電泳，隨著電泳的進行，DNA片段向高濃度變性劑方向遷移，當它到達其變性要求的最低濃度變性劑處，雙鏈DNA形成部分解鏈狀態(tài)，這就導致其遷移速率變慢。由于這種變性具有序列特異性，因此DGGE能將同樣大小的DNA片段很理想地分開，它是

2、一種很有用的分子標記方法。DGGE最初是Lerman 等人于20 世紀80 年代初期發(fā)明的，起初主要用來檢測DNA 片段中的點突變。Muyzer 等人在1993 年首次將其應用于微生物群落結構研究，并證實了這種技術在研究自然界微生物群落的遺傳多樣性和種群差異方面具有明顯的優(yōu)越性。此后十年間，該技術被廣泛用于微生物分子生態(tài)學研究的各個領域，現(xiàn)已廣泛應用于生物多樣性調查、親緣關系鑒定、基因突變檢測等多個領域。這一技術能夠提供群落中優(yōu)勢種類信息，并同時分析多個樣品，具有可重復和操作簡單等特點，適合于調查種群的時空變化。而且可通過對條帶的序列分析或與特異性探針雜交分析，鑒定群落組成。DGGE通過逐漸增

3、加的化學變性劑線性濃度梯度，可以把長度相同但只有一個堿基不同的DNA片段分離。作為一種突變檢測技術，DGGE具有如下的優(yōu)點：（1）突變檢出率高。DGGE的突變檢出率為99%以上。（2）檢測片段長度可達1kb，尤其適用于100500bp的片段。（3）非同位素性。DGGE不需同位素摻入，可避免同位素污染及對人體造成的傷害。（4）操作簡便、快速。DGGE一般在24小時內即可獲得結果。（5）重復性好。但是，該方法需要特殊的儀器，而且合成帶GC夾的引物也比較昂貴。 DGGE的基本原理及方法(fngf)：DGGE不是(b shi)將分子量不同的DNA分開(fn ki)，而是通過聚丙烯酰胺凝膠中變性劑濃度梯

4、度的不同，將序列不同的DNA分開。該方法的原理是根據(jù)DNA 的解鏈特性，不同堿基組成的DNA雙螺旋發(fā)生變性所要求的變性劑濃度不同，混合雙鏈DNA在變性劑濃度呈線性梯度增加的聚丙烯酰胺凝膠電泳時，當泳動到與DNA變性所需變性劑濃度一致的凝膠位置時，相對應的DNA發(fā)生解鏈變性，導致電泳遷移速率降低。由于泳動受阻DNA分子在凝膠中的停留位置不同，從而使不同DNA分子得以分離。根據(jù)變性劑梯度方向的不同，DGGE可分為：垂直DGGE，即變性劑梯度與電場方向垂直，常用于試驗決定分離型、野生型和變異型的最佳變性劑梯度范圍；平行DGGE，其變性劑的梯度和電場方向平行，主要用于解鏈范圍明確的DNA片段的檢測。D

5、GGE對微生態(tài)的分析一般包括三個步驟：核酸提取、16SrRNA序列的PCR擴增以及DGGE指紋圖譜分析。有些學者通過克隆、測序建立微生物區(qū)系的16SrRNA/DNA文庫，通過系統(tǒng)發(fā)育分析，建立進化樹，從而獲得微生物多樣性信息，但這種方法相對于指紋圖譜技術來說，費時費力，價格也相對昂貴。 核酸提?。何⑸锟侱NA的提取是整個分子生物學技術的基礎，是否能獲得具有代表性的總DNA樣品將決定后續(xù)分析的可行性。一般認為微生物提取總DNA的方法分為細胞裂解和核酸抽提兩個步驟。細胞裂解有三種：機械法、化學法和酶法。機械法包括玻璃珠法、超聲波法、凍融法等；化學法包括加入SDS、苯酚等；酶法包括加入裂解酶、蛋白

6、酶K 和溶解酶等。而許多研究者用其中兩種或三種方法進行組合，發(fā)現(xiàn)組合后提取總DNA 的效果較好。Stahl等（1988）在含有SDS和酚的體系中加入適量的玻璃微珠，機械法裂解瘤胃樣品中的菌體細胞。Zhu等用酶法和玻璃珠相結合的方法提取雞盲腸內容物的微生物總DNA。核酸抽提一般用酚-氯仿-異戊醇抽提，這種方法對去除雜蛋白有良好的效果。Reichardt等（1994）認為， CTAB（十六烷基三甲基溴化胺）法也是常用的方法，不需要貴重儀器，操作較為簡單，能廣泛適用于各種植物的核酸提取，純度也能滿足許多分子生物學操作的要求，所以使用日趨廣泛。16SrRNA基因(jyn)序列的PCR擴增：細菌(xjn

7、)按沉降系數(shù)分為5S、16S和23S三種(sn zhn)，16SrRNA基因是細菌染色體上編碼該rRNA的相應DNA系列。16SrRNA基因序列全長1540bp，有保守區(qū)和可變區(qū)之分，每種細菌的保守區(qū)都是相同的，能反映生物種類的親緣關系，為系統(tǒng)發(fā)育重建提供線索；可變區(qū)因細菌種類而異，通過保守區(qū)設計引物，擴增出可變區(qū)，就可以得知微生物多樣性信息。大多數(shù)情況下，可根據(jù)16SrRNA V3區(qū)和V6-V8區(qū)設計細菌特異性引物進行PCR擴增，有時為了更加準確得獲得微生物多樣性的信息，可先通過細菌16SrRNA序列全長通用引物進行PCR擴增，再對V3或V6-V8區(qū)進行擴增。Yu等的研究表明，通常使用16S

8、的V3區(qū)進行PCR擴增后進行DGGE分析，如果所測的序列長度比較長時，也可以使用16S的V3-V5或V6-V8區(qū)。 DGGE指紋圖譜分析：目前，DGGE電泳圖譜的分析最常用的是相似性聚類分析法。DGGE膠通過掃描儀輸入計算機，通過Molecular Analysis軟件進行相似性分析。通過DGGE后得到的指紋圖譜，每一個條帶代表某個微生物優(yōu)勢菌群，通過測序和序列比對，可以得出此優(yōu)勢菌群的種類。DGGE 操作步驟1、將海綿墊固定在制膠架上，把類似“三明治”結構的制膠板系統(tǒng)垂直放在海綿上方，用分布在制膠架兩側的偏心輪固定好制膠板系統(tǒng)，注意一定是短玻璃的一面正對著自己。2、共有三根聚乙烯細管，其中兩

9、根較長的為15.5cm，短的那根長9cm。將短的那根與Y形管相連，兩根長的則與小套管相連，并連在30ml 的注射器上。3、在兩個注射器上分別標記“高濃度”與“低濃度”，并安裝上相關的配件，調整梯度傳送系統(tǒng)的刻度到適當?shù)奈恢谩?、反時針方向旋轉凸輪(tln)到起始位置。為設置理想的傳送體積，旋松體積調整旋紐。將體積設置顯示裝置固定在注射器上并調整到目標體積設置，旋緊體積調整旋紐。例如1616cm gels(1mm thick)：設體積(tj)調整裝置到14.5。5、配制兩種變性濃度(nngd)的丙烯酰胺溶液到兩個離心管中。6、每管加入18 l TEMED，80 l 10%APS，迅速蓋上并旋緊帽

10、后上下顛倒數(shù)次混勻。用連有聚乙烯管標有“高濃度”的注射器吸取所有高濃度的膠，對于低濃度的膠操作同上。7、通過推動注射器推動桿小心趕走氣泡并輕柔地晃動注射器，推動溶液到聚丙烯管的末端。注意不要將膠液推出管外，因為這樣會造成溶液的損失，導致最后凝膠體積不夠。8、分別將高濃度、低濃度注射器放在梯度傳送系統(tǒng)的正確一側固定好，注意這里一定要把位置放正確，再將注射器的聚丙烯管同Y 形管相連。9、輕柔并穩(wěn)定地旋轉凸輪來傳送溶液，在這個步驟中最關鍵的是要保持恒定勻速且緩慢地推動凸輪，以使溶液恒速的被灌入到三明治式的凝膠板中。10、小心插入梳子，讓凝膠聚合大約一個小時。并把電泳控制裝置打開，預熱電泳緩沖液到60

11、。11、迅速清洗用完的設備。12、聚合完畢后拔走梳子，將膠放入到電泳槽內，清洗點樣孔，蓋上溫度控制裝置使溫度上升到60。13、用注射針點樣（預先準備好的活性污泥16S rDNA V3區(qū)PCR 擴增產(chǎn)物，變性聚丙烯酰胺凝膠電泳純化）。14、電泳（200V，5h）。15、電泳完畢后，先撥開一塊玻璃板，然后將膠放入盤中。用去離子水沖洗，使膠和玻璃板脫離。16、倒掉去離子水，加入 250 ml 固定液（10% 乙醇，0.5% 冰醋酸）中，放置15min。17、倒掉固定液，用去離子水沖洗兩次，倒掉后加入250 ml 銀染液（0.2% AgNO3，用之前加入200l 甲醛）中，放置在搖床上搖蕩，染色15m

12、in。18、倒掉銀染液，用去離子水沖洗(chngx)兩次，倒掉后加入250 ml 顯色(xin s)液（1.5% NaOH， 0.5% 甲醛(ji qun)）顯色。19、待條帶出現(xiàn)后拍照。DGGE操作注意事項1、配置試劑時一定要用去離子水，制膠洗膜時用的各個容器也要用去離子水洗滌干凈，以防止氯離子污染。2、制膠是實驗的關鍵。在往玻璃板中灌膠時，要勻速地轉動滑輪，將凝膠液勻速地灌入玻璃板。3、灌完膠后，立刻清洗注射器，以防丙烯酰胺凝固，堵塞管子。4、DGGE的電泳緩沖液要超過“RUN”刻度線，不要超過“Maximam”刻度線。5、點樣時，要用小型注射器，伸入點樣孔底部點樣。6、銀染的整個過程中，

13、一定要戴手套。以避免手接觸膠而帶來的污染。7、每次用完儀器后要及時清理，清洗玻璃板培養(yǎng)皿等玻璃儀器。實驗中常見問題分析1、DGGE圖譜的優(yōu)化：利用DGGE分析復雜樣品時，獲得高分辨率的圖譜是重要的前提條件。影響DGGE 分辨率的因素很多。如DNA(或RNA) 提取效果、PCR(或RT-PCR) 擴增效果、電泳時間、電泳溫度、凝膠濃度、變性劑梯度、染色方法等。在DGGE 的操作過程的每一個環(huán)節(jié)都會對后續(xù)分析產(chǎn)生影響并導致誤差的產(chǎn)生，因此為了獲得DGGE 的最大分辨率，必須對全部環(huán)節(jié)進行優(yōu)化。2、DGGE圖譜的分析：在獲得DGGE 圖譜后，需要對圖譜中條帶的核酸序列進行分析，并對圖譜進行統(tǒng)計學分析

14、，闡述不同樣品間的關系，從而合理的解釋復雜的指紋圖譜。隨著DGGE 的廣泛應用，一些統(tǒng)計學方法也不斷應用于圖譜的分析。這些分析方法從不同角度對圖譜進行歸納總結。如解釋群落結構和演替規(guī)律，種群遺傳多樣性，優(yōu)勢條帶的位置和強度分析等。無論選擇哪種分析方法，對數(shù)據(jù)分析時得到的結論都應該是一致的。參考文獻J. 薩姆布魯克，E.F. 弗里克，T. 曼妮阿蒂斯. 1992. 分子克隆實驗(shyn)指南，第二版. 金冬雁等譯. 北京(bi jn)：科學技術出版社邢德峰，任南琪. 2006. 應用(yngyng)DGGE研究微生物群落時的常見問題分析J. 微生物學報46（2）：331-335宮曼麗，任南琪，

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