醫(yī)學資料動物細胞與組織培養(yǎng)技術(shù)

1、第三章 動物細胞與組織培養(yǎng)技術(shù)第一節(jié) 概述 一、動物細胞與組織培養(yǎng)的基本概念 二、動物細胞體外培養(yǎng)的特點 三、發(fā)展歷史 四、動物細胞的體外培養(yǎng)一般條件(掌握） 五、體外培養(yǎng)細胞生物學特性(掌握） 第二節(jié) 動物細胞、組織培養(yǎng)的基本方法(掌握） 第三節(jié) 培養(yǎng)細胞的檢測和特性鑒定 (掌握）第四節(jié) 動物細胞體外培養(yǎng)舉例 第五節(jié) 細胞同步化（了解）第六節(jié) 組織工程、器官培養(yǎng)（定義、培養(yǎng)方法及應用（了解） 2021/7/16 星期五1第一節(jié) 概述 一、基本概念1動物細胞與組織培養(yǎng)(Cell and Tissue Culture) ：指從用無菌方法將動物體內(nèi)細胞或組織取出，模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在體外進行培養(yǎng)

2、，使離體細胞或組織生存、生長并維持結(jié)構(gòu)和功能的一門技術(shù)。 是動物細胞工程的基礎(chǔ)。 2021/7/16 星期五22021/7/16 星期五3 分類： 細胞培養(yǎng) 組織培養(yǎng) 器官培養(yǎng)2021/7/16 星期五42、原代培養(yǎng)(Primary Culture)：亦稱初代培養(yǎng)，指直接從機體取出的細胞或組織進行培養(yǎng)的過程。3繼代培養(yǎng)（ Secondary Culture ）：亦稱傳代培養(yǎng)，從原代培養(yǎng)的細胞繼續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)稱繼代培養(yǎng).4、細胞系(cell line)：由原代細胞培養(yǎng)后經(jīng)初步純化，獲得的以一種細胞為主、能在體外長期生存的不均一的細胞群體，一般為有限細胞系。5、細胞株(cell strain)：細胞系

3、經(jīng)過克隆或其他方法而得的單一類型的細胞群體。2021/7/16 星期五5有限細胞系(infinited cell line)：不能連續(xù)培養(yǎng)的細胞株。無限細胞系(finited cell line)：能夠連續(xù)培養(yǎng)的細胞株，也稱無限系。無限系細胞大多已發(fā)生異倍化，具異倍體核型，有的可能已成為惡性細胞。2021/7/16 星期五6細胞株、細胞系的命名：以組織來源定名，如BHK(幼地鼠腎細胞)以人名定名，如HeLa細胞以時間地點來定名，如S7811細胞系以臨床疾病類型定名，如BALL-1細胞系(來自B淋巴細胞急性白血病人白細胞)2021/7/16 星期五7用于生產(chǎn)的動物細胞株原代細胞二倍體細胞融合細胞

4、基因工程細胞轉(zhuǎn)化細胞常用細胞株：CHO細胞、Vero細胞、BHK-21細胞、WI-38細胞2021/7/16 星期五8二、動物細胞體外培養(yǎng)特點動物細胞生長緩慢，培養(yǎng)時間長。更易受微生物污染 （包括細菌、真菌、病毒、支原體）， 需要防治污染問題。對培養(yǎng)環(huán)境的適應性差，對環(huán)境極其敏感。包括PH值、溫度、剪切力對營養(yǎng)要求高，除了氨基酸、維生素、鹽類、葡萄糖或半乳糖外，一般還需要血清。 原代細胞一般繁殖50代左右退化死亡?？傊?，動物細胞培養(yǎng)對各方面的要求更高，培養(yǎng)難度更大。2021/7/16 星期五92021/7/16 星期五10平滑肌細胞神經(jīng)元細胞血紅細胞形態(tài)上表現(xiàn)為多種多樣，如圓形、橢圓形、正方形

5、、柱形、扁平形、梭形、星形和多邊形等2021/7/16 星期五11三、動物細胞培養(yǎng)的發(fā)展歷史1885年，Wilhelm Roux （勞斯，德國）最先嘗試離體培養(yǎng)雞胚神經(jīng)存活了一段時間。并且，他首次采用了“組織培養(yǎng)”一詞。 1907年，美國胚胎學家Ross Harrison （哈里森）培養(yǎng)蛙胚神經(jīng)細胞長出了軸突（蓋玻片覆蓋凹窩玻璃懸滴培養(yǎng)法）。他被公認為動物組織培養(yǎng)的開山鼻祖。 1912年,法國學者Alexis Carrel（卡雷爾）采用雞胚勻漿組織液與血漿混合使用，培養(yǎng)了各種動物組織的組織塊。在技術(shù)方面，卡雷爾把無菌操作技術(shù)引入組織培養(yǎng)中。1923年，他設(shè)計了卡氏培養(yǎng)瓶。2021/7/16 星

6、期五121913年，Steinhardt建立了單蓋片懸滴培養(yǎng)法。 1925年，Maximow采用雙蓋片法。 1934年，Gey和Lewis 用旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)了許多細胞系。相繼，人們設(shè)計了多種類型的培養(yǎng)瓶。 1948年，Sanford創(chuàng)立了單層細胞培養(yǎng)法，建立了各種細胞系。他還創(chuàng)建了單個細胞培養(yǎng)方法。 1951年，Pomerat設(shè)計了細胞培養(yǎng)灌流小室技術(shù)，使細胞生活在不斷更新的培養(yǎng)液環(huán)境中，便于做細胞顯微攝影和代謝等研究1951年， 厄爾 （Earle） 發(fā)明了體外培養(yǎng)動物細胞的人工合成培養(yǎng)基。2021/7/16 星期五131952年Gey建立了第一個人體細胞系，人體宮頸癌Hela細胞系。 1960

7、年，Barski等人在兩種不同類型的細胞混合培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)有自發(fā)的融合細胞。 1962年，岡田善雄又發(fā)現(xiàn)了已滅活的仙臺病毒可以誘發(fā)體內(nèi)艾氏腹水瘤細胞和非惡性細胞融合。且融合細胞染色體丟失，惡性特征受到抑制。2021/7/16 星期五14四、動物細胞的體外培養(yǎng)一般條件1、恒定的溫度:37 維持培養(yǎng)細胞旺盛生長，必須有恒定適宜的溫度。人體細胞培養(yǎng)的標準溫度為36.50.5，偏離這一溫度范圍，細胞的正常代謝會受到影響，甚至死亡。 培養(yǎng)細胞對低溫的耐受力較對高溫強，溫度上升不超過39時，細胞代謝與溫度成正比；人體細胞在39-401小時，即能受到一定損傷，但仍有可能恢復；在40-411小時，細胞會普遍受到

8、損傷，僅小半數(shù)有可能恢復；41-421小時，細胞受到嚴重損傷，大部分細胞死亡，個別細胞仍有恢復可能；當溫度在43以上1小時，細胞全部死亡。低溫下會使細胞代謝速率降低2021/7/16 星期五152、pH：最適為7.27.4 大多數(shù)細胞的適宜pH為7.2-7.4,偏離這一范圍對細胞培養(yǎng)將產(chǎn)生有害的影響.但細胞耐酸性比耐堿性大一些,在偏酸環(huán)境中更利于細胞生長.但有一些細胞也喜歡偏堿環(huán)境中生長,如成纖維細胞最適合pH是7.4-7.6，每種細胞都有其最適pH值. 當PH低于6或高于7.6時的生長會受到影響，甚至死亡。2021/7/16 星期五163、 氣體氣體：需要O2、CO2 （95%空氣、5% C

9、O2）氣體是哺乳動物細胞培養(yǎng)生存必需條件之一,所需氣體主要有氧氣和二氧化碳.氧氣參與三羧酸循環(huán),產(chǎn)生供給細胞生長增殖的能量和合成細胞生長所需用的各種成分.開放培養(yǎng)時一般把細胞置于95%空氣加5%二氧化碳混合氣體環(huán)境中.二氧化碳既是細胞代謝產(chǎn)物,也是細胞生長繁殖所需成分,它在細胞培養(yǎng)中的主要作用在于維持培養(yǎng)基的pH值. 2021/7/16 星期五174、營養(yǎng)：要求高，需要氨基酸、維生素、輔酶、核酸、激素、生長因子等。 2021/7/16 星期五185、無菌培養(yǎng)環(huán)境無毒和無菌是保證細胞生存的首要條件。當細胞放置于體外培養(yǎng)時，與體內(nèi)相比細胞丟失了對微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代謝物質(zhì)積

10、累等，可導致細胞死亡。因此在進行培養(yǎng)中，保持細胞生存環(huán)境無污染、代謝物及時清除等，是維持細胞生存的基本條件。2021/7/16 星期五19（一）培養(yǎng)細胞的生長方式及類型 （二）培養(yǎng)細胞的生長特點（三）培養(yǎng)細胞的生長與增殖過程五、 動物細胞的體外培養(yǎng)生物學特性2021/7/16 星期五20貼壁依賴型細胞 非貼壁依賴型成纖維細胞上皮型細胞游走型細胞多形型細胞（一）培養(yǎng)細胞的生長方式及類型 于懸浮狀態(tài)下即可生長 貼附于支持物表面才能生長的細胞 2021/7/16 星期五211、貼壁依賴型細胞含義：一是細胞之間相互接觸，二是細胞與細胞外基質(zhì)結(jié)合。 單層附壁培養(yǎng)：指動物細胞培養(yǎng)中，大多細胞必須附著在固體

11、表面生長，當細胞布滿表面后即停止生長。2021/7/16 星期五22在體外按照培養(yǎng)細胞的形態(tài)不同，主要可分為以下幾類：成纖維細胞型、上皮型細胞、游走型細胞、多形型細胞 （1）成纖維細胞型：本型細胞的形態(tài)似在體內(nèi)生長的成纖維細胞； 長梭形，細胞在支持物表面呈梭形或不規(guī)則三角形生長，細胞核位于中央，胞質(zhì)向外伸出2-3個長短不同的突起，生長時呈放射狀、漩渦狀走向，細胞間間隙較大。其生長特點為細胞一般并不緊靠相連；中胚層細胞體外培養(yǎng)時一般表現(xiàn)為這一形式。如人胚肺細胞。 2021/7/16 星期五23人的成纖維細胞小鼠的成纖維細胞人骨髓間充質(zhì)細胞（MSC）2021/7/16 星期五242021/7/16

12、 星期五25大鼠血管平滑肌細胞成纖維細胞型2021/7/16 星期五26成纖維型細胞在培養(yǎng)中的細胞凡形態(tài)與成纖維細胞類似時，皆可稱之為成纖維細胞。本型細胞由形態(tài)與體內(nèi)成纖維細胞的形態(tài)相似而得名. 除真正的成纖維細胞外，凡由中胚層間質(zhì)起源的組織細胞常呈本類形態(tài)生長。人胚肺細胞在顯微鏡下呈現(xiàn)為典型的成纖維細胞型。2021/7/16 星期五27（2）上皮型細胞此類型細胞在培養(yǎng)器皿支持物上生長具有扁平狀，不規(guī)則。細胞貼壁后呈不規(guī)則多角形，中央有扁圓形核，細胞彼此緊密相連成單層細胞，呈現(xiàn)“鋪路石狀”。生長時呈膜狀移動，處于膜邊緣的細胞總與膜相連，很少單獨行動。內(nèi)胚層和外胚層細胞體外培養(yǎng)時都可能呈現(xiàn)上皮型

13、。如皮膚、消化道、呼吸道、肺泡、消化腺上皮細胞，血管內(nèi)皮細胞等。Hela細胞呈現(xiàn)為典型的上皮細胞型。2021/7/16 星期五28單層扁平上皮細胞人口腔皮樣癌細胞人宮頸癌上皮細胞（Hela）2021/7/16 星期五29成骨肉瘤細胞(多角形)上皮細胞型2021/7/16 星期五30奶牛腎臟上皮細胞(上皮細胞型)2021/7/16 星期五31體外培養(yǎng)時所謂的上皮細胞型細胞或成纖維細胞型細胞，僅是因為其形態(tài)與體內(nèi)的上皮細胞或成纖維細胞類似，并不能將體外培養(yǎng)的這些細胞與體內(nèi)同名的細胞完全等同；而且，這種名詞系使用于描述細胞的外形而并非說明細胞的起源。與這兩種形態(tài)類似的細胞，可能來自不同性質(zhì)的細胞亞類

14、。取自不同組織的上皮細胞，其生化特征及其原來的形態(tài)要有差異，而來自不同組織的形態(tài)相似的成纖維細胞，其發(fā)展的方向可能并不相同。2021/7/16 星期五32 （3）游走型細胞：不常見，具有類似巨噬細胞樣的特征。本型細胞在支持物上散在生長，一般不連成片。細胞質(zhì)經(jīng)常伸出偽足或突起，呈活躍的游走或變形運動，速度快且不規(guī)則。此型細胞不很穩(wěn)定，有時亦難和其它型細胞區(qū)別。在一定的條件下，由于細胞密度增大聯(lián)成片后，可呈類似多角型或成纖維細胞形態(tài)。如單核巨噬細胞系統(tǒng)的細胞中的顆粒型白細胞、淋巴細胞、巨噬細胞、腫瘤細胞等。2021/7/16 星期五33體外培養(yǎng)的游走型細胞具有類似巨噬細胞樣的特征。主要是：單核巨噬

15、細胞系統(tǒng)的細胞，淋巴細胞，腫瘤細胞。2021/7/16 星期五34單 核 巨 噬 細 胞1、游走型細胞在支持物上分散生長，一般不連接成片、形成群落；2、細胞胞質(zhì)常伸出偽足和突起。3、生長位置不固定，呈游走和變形運動，速度快、方向不規(guī)則。4、細胞內(nèi)易出現(xiàn)色暗的吞噬性顆粒。2021/7/16 星期五35單核巨噬細胞（未刺激狀態(tài)）游走細胞型2021/7/16 星期五36單核巨噬細胞（活化劑刺激6h后）：向四周伸展偽足2021/7/16 星期五37需要注意的是：在實際細胞培養(yǎng)中，可能同時存在2種及其以上細胞形態(tài)；其影響因素包括（1）不同來源細胞細胞形態(tài)學表現(xiàn)不同；（2）不同培養(yǎng)條件下同一細胞表現(xiàn)不同形

16、態(tài)；如血清成分，培養(yǎng)基，溫氣環(huán)境等2021/7/16 星期五38（4）多形型細胞：形態(tài)上不規(guī)則的細胞，不常見，一般分胞體和胞突兩部分，胞突細長形類似絲狀偽足；胞體略呈多角形，但較規(guī)則。如神經(jīng)組織細胞如神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞等。2021/7/16 星期五39神經(jīng)細胞（DAB顯色）多形型細胞神經(jīng)細胞2021/7/16 星期五40大鼠 海馬神經(jīng)細胞2021/7/16 星期五412 非貼附型細胞 懸浮型細胞：指細胞在體外培養(yǎng)時不必貼壁，可在培養(yǎng)液中懸浮生長。 見于少數(shù)特殊的細胞，如血液白細胞、淋巴組織細胞、雜交瘤細胞轉(zhuǎn)化細胞系、某些類型的癌細胞及白血病細胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長。這種細胞

17、的形態(tài)特點：胞體始終為球形。優(yōu)點：生存空間大，培養(yǎng)效率高，利于大量生產(chǎn)，與培養(yǎng)基充分接觸無需消化傳代，易于收獲細胞。缺點是不如貼附生長型觀察方便，而且并非所有的培養(yǎng)細胞都能懸浮生長。貼壁細胞經(jīng)懸浮適應后也可以長期懸浮培養(yǎng)2021/7/16 星期五42實際情況下，所培養(yǎng)的細胞并不一定呈現(xiàn)某種典型的形態(tài)，能影響細胞形態(tài)的因素很多，細胞形態(tài)學特征僅是對培養(yǎng)物判斷或識別的一種參考性指標，如果想明確某一培養(yǎng)物的確切類型，必須借助于更為特異的鑒定方法。2021/7/16 星期五43影響細胞形態(tài)學特征的因素 血清成分、培養(yǎng)基成分、添加成分、培養(yǎng)基的酸堿度、氣相環(huán)境、溫度等。 如,Hela細胞原本是一種上皮型

18、癌細胞,但在過酸或過堿的條件下培養(yǎng),可以呈現(xiàn)梭形,當酸堿度適中時又可以恢復上皮型特征。2021/7/16 星期五44(二）培養(yǎng)細胞的生長特點貼附和伸展接觸抑制密度抑制2021/7/16 星期五451貼附 貼附并伸展，是多數(shù)體外培養(yǎng)細胞的基本生長特點。貼附底物：其他細胞、膠原、玻璃或塑料等。一類特殊的促細胞附著的物質(zhì)（如基膜素、纖維連接素、型膠原、血清擴展因子等）可能參加細胞的貼附過程。培養(yǎng)細胞在未貼附于底物之前一般均似球體樣；當與底物貼附后，細胞將逐漸伸展而形成一定的形態(tài)。細胞貼附和伸展過程：2021/7/16 星期五46貼附過程：促細胞附著因子吸附于底物上 懸浮的圓形細胞與底物附著 細胞將伸

19、展成其原來的形態(tài)。2021/7/16 星期五47貼附過程 2021/7/16 星期五48影響細胞的貼附和伸展的因素：細胞因素；生物因素（如促附著因子）； 機械、物理因素（如低溫或培養(yǎng)液的流動過快)；其它一些因素的影響（例如：離子的作用).可采取的措施：包被；減少接種時細胞懸液的量；培養(yǎng)液中離子成分及濃度培養(yǎng)液的溫度2021/7/16 星期五492接觸抑制（Contact inhibition） 細胞從接種到長滿底物表面后，由于細胞繁殖數(shù)量增多相互接觸后，不再增加。一般的正常細胞并不互相重疊于其上面而生長；但是，轉(zhuǎn)化細胞或癌瘤細胞則接觸抑制下降，他們互相之間可在上面或下面經(jīng)過而重疊生長。 202

20、1/7/16 星期五502021/7/16 星期五512021/7/16 星期五523、密度依賴性（Density inhibition）3T3細胞系，在細胞稀少狀態(tài)下培養(yǎng)時，其生長迅速；但一旦細胞生長匯合成一片時（每6cm培養(yǎng)皿約106個細胞），其分裂增殖停止。其確切的細胞密度常與培養(yǎng)液中的血清濃度有關(guān)。上述這種生長特性即為密度依賴性調(diào)節(jié)（或密度抑制）。轉(zhuǎn)化細胞或惡性腫瘤細胞則與正常細胞不同，他們的密度依賴性調(diào)節(jié)常常降低，因而可以生長至較高的終末細胞密度。2021/7/16 星期五53（四） 體外培養(yǎng)細胞的生長與增殖過程 1、單個細胞的生長過程：與體內(nèi)細胞周期相似，經(jīng)歷G1、S、G2、M期。

21、細胞的分裂周期長 細胞分裂時間為1248h， 細胞的分裂 周期=間期+分裂期 間期（G1+S+G2） 分裂期（M）2021/7/16 星期五542021/7/16 星期五55體外培養(yǎng)細胞壽命的過程可分為三個階段 原代培養(yǎng)期 傳代期 衰退期 2、細胞系的生長過程： 2021/7/16 星期五56(1)原代培養(yǎng)（初代培養(yǎng)）為新鮮組織自體內(nèi)取出接種培養(yǎng)至第一次傳代的階段,一般持續(xù)14周。特點：原代細胞培養(yǎng)通常為異質(zhì)性，細胞獨立生存性差，多呈二倍體核型，更能代表其來源組織的細胞類型及組織特異性，是檢測藥物的很好實驗工具。2021/7/16 星期五57(2)傳代期 當細胞持續(xù)生長增殖一段時間，達到一定的

22、細胞密度后，就應當將細胞分離成兩部分（或更多）至新的培養(yǎng)器皿中，并補充更新培養(yǎng)液，此即為傳代。 特點:在細胞整個生命期中此期的持續(xù)時間最長， 一般情況下，可傳代1050代。 細胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型，被稱為二倍體核型。2021/7/16 星期五58 有限細胞系和永久細胞系 動物細胞離體培養(yǎng)起始物，我們稱之為原代培養(yǎng)（primary culture）。經(jīng)繼代培養(yǎng)后即成為有限細胞系(finite cell line)。有限細胞系：細胞自動物體內(nèi)取出后，在培養(yǎng)中僅持續(xù)生長有限時間，然后將自行停止生長。即使提供生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)（包括血清），最終也會死亡。這種壽命僅能維持一段時間的細胞系，稱為

23、有限細胞系。 大多數(shù)細胞系在有限的代數(shù)內(nèi)以不變的形式增殖，當超過有限世代后，它們可能有兩種情況，一是衰老死亡，二是發(fā)育成永久細胞系或稱連續(xù)細胞系。 有限細胞系轉(zhuǎn)換成永久細胞系的過度期稱為轉(zhuǎn)換期(crisis)，其轉(zhuǎn)換過程在動物細胞培養(yǎng)中稱為體外轉(zhuǎn)化(in vitro transformation)。 永久細胞系有如下特征：細胞形態(tài)變化，如細胞變小，黏附性減少，具有較高的核質(zhì)比；生長速率增加，倍增時間縮短；對血清的依賴性減??；貼壁依賴性降低；細胞異倍體和非整倍體增加，細胞接種到體內(nèi)后，生癌率上升。2021/7/16 星期五59熒光原位雜交顯示端粒2021/7/16 星期五60結(jié)果：細胞群體中具有

24、迅速增殖能力的細胞將漸占優(yōu)勢而非增殖的或增殖緩慢的細胞將被減弱。 2021/7/16 星期五612021/7/16 星期五62(3)衰退期，此期細胞雖仍存活，但增殖基本停止，細胞形態(tài)輪廓增強，進而細胞發(fā)生衰退、死亡。細胞在第二期末或第三期初階段，通過所謂“危機期”(crisis)，獲得不死性而具有持久或無限增殖的能力。失去接觸抑制。2021/7/16 星期五633、每代細胞的生長過程在細胞的生長過程中，繁殖到一定密度后，將之分開而移至新的培養(yǎng)皿中稱為接種。 細胞”一代”：僅指從細胞接種到分離再培養(yǎng)的一段時間。2021/7/16 星期五64潛伏期每代細胞的生長階段：指數(shù)生長期 停止期2021/7

25、/16 星期五65培養(yǎng)細胞傳代的生存期：1)潛伏期(latent phase) 2)指數(shù)生長期(logarithmic growth phase)又稱對數(shù)期-試驗用3)平臺期又稱生長停滯期(stagnate phase)。 - -傳代2021/7/16 星期五661）潛伏期2021/7/16 星期五672）指數(shù)生長期細胞增殖旺盛，成倍增長，活力最佳，適用于進行實驗研究。持續(xù)35天。 細胞生長增殖狀況可以細胞群體倍增時間及細胞分裂指數(shù)等來判斷。在此階段，若細胞處于理想的培養(yǎng)條件，將不斷生長繁殖，細胞數(shù)量日漸增加。細胞將接觸而連成一片，漸次鋪滿培養(yǎng)器皿底物，提供細胞生長的區(qū)域逐漸減少甚至消失。因接

26、觸抑制而細胞運動停止、密度抑制而細胞終止分裂。細胞不再繁殖而進入平臺期。2021/7/16 星期五683 平臺期又稱生長停滯期。此期細胞生長的底物面積已被生長的細胞所占滿，細胞量和密度達到飽和，細胞停細胞雖尚有活力但已不再分裂增殖，細胞數(shù)量持平。特點細胞雖已停止生長，但仍存在代謝活動并可繼續(xù)存活一定的時間。若及時分離培養(yǎng)、進行傳代，將細胞分開接種至新的培養(yǎng)器皿并補充以新鮮培養(yǎng)液，細胞將于培養(yǎng)器皿中成為下一代的細胞而再次繁殖。否則細胞因中毒而發(fā)生死亡。2021/7/16 星期五692021/7/16 星期五70第二節(jié) 動物細胞、組織培養(yǎng)的方法 一、體外培養(yǎng)的一般過程二、動物細胞培養(yǎng)的基本方法 三

27、、動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù) 四、動物細胞體外培養(yǎng)舉例 五、動物細胞體外培養(yǎng)現(xiàn)狀與展望2021/7/16 星期五71一、體外培養(yǎng)的一般過程體外細胞培養(yǎng)一般過程： 組織獲得 組織消化 接種培養(yǎng)傳代及細胞凍存復蘇等2021/7/16 星期五72動物胚胎或幼齡動物的組織、器官細胞懸液胰蛋白酶1代細胞原代培養(yǎng)50代細胞傳代培養(yǎng)無限傳代單個細胞加培養(yǎng)液動物組織細胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質(zhì)，將細胞網(wǎng)絡(luò)起來形成具有一定彈性和韌性的組織和器官。（分解彈性纖維）2021/7/16 星期五73 動物細胞培養(yǎng)的基本過程2021/7/16 星期五742021/7/16 星期五75過程 組織取材 組織細胞的分離

28、培養(yǎng) 機械法 消化法 2021/7/16 星期五76機械法分離胚胎 2021/7/16 星期五77（二）、 原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)技術(shù) 1、原代培養(yǎng)分為兩種：1） 組織塊培養(yǎng)法 2） 組織消化培養(yǎng)（單層培養(yǎng)法）：適用于細胞間質(zhì)較少的軟組織，如胚胎、羊膜、上皮、肝腎及傳代細胞等。一般而言幼體組織比老齡組織，分化低的比分化高，腫瘤組織比正常組織易于培養(yǎng)。2021/7/16 星期五78（一）取材 2021/7/16 星期五79基本步驟：無菌取出目的組織 用利刀無菌切割成12mm小塊 以Hanks液漂洗干凈,低速離心，棄上清 移入培養(yǎng)瓶，加入適當培養(yǎng)基浸潤 培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)1800，置1530分，使其貼壁 培養(yǎng)

29、瓶翻回，置于37培養(yǎng)（1）組織塊培養(yǎng) 2021/7/16 星期五80組織塊培養(yǎng)法 a：取材修剪沖洗b：剪切成1mm3左右的小塊c：移入培養(yǎng)瓶d：分布組織小塊間距5mme：翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶并加培養(yǎng)液37靜止1-2hf：翻正培養(yǎng)瓶進行培養(yǎng)g：原代細胞生長2021/7/16 星期五81 取材分離和組織消化 無菌取出目的組織 用利刀無菌切割成細塊 胰蛋白酶液消化 Hanks液漂洗兩次，低速離心棄上清 吸管吹打分散細胞 移入培養(yǎng)瓶薄層培養(yǎng)(2)組織消化培養(yǎng) 加入30-50倍體積0.25%濃度胰蛋白酶溶液37消化30-60min，每5-10min搖動一次2021/7/16 星期五82相關(guān)酶類包括：胰蛋白酶、膠原

30、酶、鏈霉蛋白酶、黏蛋白酶、蝸牛酶等，需根據(jù)酶及組織成分的特點選擇使用2021/7/16 星期五83原代培養(yǎng)與檢查 接種、培養(yǎng) 常規(guī)檢查（檢查細胞形態(tài)及活力、檢查營養(yǎng)液pH及污染）2021/7/16 星期五842、傳代培養(yǎng)技術(shù)傳代：當原代培養(yǎng)成功后，細胞分裂增殖成片時，需要對其分離重新培養(yǎng)，這一操作過程成為傳代。第一次傳代時間：有80-90%或剛剛?cè)繀R合的細胞是傳代的理想時期。過早產(chǎn)量不足，過晚細胞狀態(tài)不佳。 2021/7/16 星期五85基本步驟： 吸出培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液 加入胰蛋白酶和EDTA混和液 (以能覆蓋整個瓶底為準） 吸出消化液，加入培養(yǎng)液終止消化 吸管輕輕吹打使細胞分散成懸液，計數(shù)

31、 重新接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)1）貼壁生長細胞傳代 培養(yǎng)2021/7/16 星期五862021/7/16 星期五872）懸浮生長細胞傳代離心法傳代 直接傳代法 離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分-800g）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。直接傳代法：懸浮細胞沉淀在瓶壁時，將上清培養(yǎng)液去除l2一23，然后用吸管直接吹打形成細胞懸液再傳代。2021/7/16 星期五88（三）細胞純化2021/7/16 星期五89（四）細胞的凍存復蘇細胞低溫冷凍貯存是細胞室的常規(guī)工作。1、凍存意義：1）長期保存細胞；2）防止細胞老化；3）減少人力、經(jīng)費，減少污染。2021/7/16 星期五902、凍存和復蘇的原則：慢

32、凍快融當細胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細胞器脫水，細胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細胞內(nèi)形成冰晶。在細胞凍存時要盡可能均勻地減少細胞內(nèi)水分，減少細胞內(nèi)冰晶的形成是減少細胞損傷的關(guān)鍵。 如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反結(jié)晶就大，大結(jié)晶會造成細胞膜、細胞器的損傷和破裂。復蘇過程應快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。2021/7/16 星期五913、保存細胞三要素：營養(yǎng)、保護劑和低溫低溫保護劑的應用在細胞凍存時加入保護劑，能大大提高凍存效果。常用的低溫保護劑是甘油或DMSO，滲透性保護劑，可迅速透入細胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結(jié)過程，能使

33、細胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對細胞的損傷。保護劑的濃度在515%之間，常用10%。2021/7/16 星期五924、慢凍程序標準程序： 當溫度在-25 以上時， 12 /min 當溫度達-25 以下時， 510 /min 當溫度達-100時，可迅速放入液氮中簡易程序： 將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降12 的速度，在40分鐘內(nèi)降至液氮表面，停30分鐘后，直接投人液氮中。2021/7/16 星期五93細胞凍存方法1預先配制凍存液： 含20%血清培養(yǎng)基 9份 DMSO 1份2 取對數(shù)生

34、長期細胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量凍存液, 用吸管吹打制成細胞懸液（1106 5 106細胞/ml)3 分裝：每瓶1ml，密封后標記冷凍細胞名稱和冷凍日期。4、凍存1)傳統(tǒng)方法：冷存管置于410分鐘 -2030分鐘 -801618小時(或隔夜)液氮槽長期儲存。-20不可超過1小時，以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 (2)程序降溫：利用已設(shè)定程序的等速降溫機以-1-3/分鐘之速度由室溫降至(-80以下)-120，再放在液氮長期儲存。適用于懸浮型細胞與hybridoma之保存。 2021/7/16 星期五94凍存要點：1）慢凍2）取對數(shù)生長

35、期細胞進行凍存，無微生物污染；3）細胞濃度：達到10 6/毫升 4）合適的冷凍保護劑：DMSO,常用10%。5）使用高濃度血清 2021/7/16 星期五955、細胞復蘇方法與快速融化的手段，以保證細胞外結(jié)晶在很短的時間內(nèi)融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細胞造成損害 。程序：（l）從液氮中取出冷凍管，迅速投入3738 水浴中，使其融化（1分鐘左右）。 （2）5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的10倍以上。 （3）低速離心10分鐘。 （4）去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復蘇的細胞。2021/7/16 星期五962021/7/16 星期五97二、動物細胞培養(yǎng)的基本方法 懸滴培養(yǎng)法 旋轉(zhuǎn)

36、管培養(yǎng)法 灌注小室培養(yǎng)法 培養(yǎng)瓶培養(yǎng)方法 培養(yǎng)板培養(yǎng)法 克隆培養(yǎng)法2021/7/16 星期五981、懸滴培養(yǎng)法 懸滴培養(yǎng)法：又稱植塊懸滴培養(yǎng)法，1907年，哈里森首創(chuàng)。即將組織或器官植塊接種在一張蓋玻片上，滴上一滴培養(yǎng)液，然后翻轉(zhuǎn)蓋玻片使植塊及營養(yǎng)液懸掛于蓋玻片下，再置于一凹形載玻片上，最后用熔蠟密封后放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。優(yōu)點：1）容易換片。 2）培養(yǎng)物在培養(yǎng)過程中，不需移動位置，有利于組織分化。2021/7/16 星期五992、旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法 蓋爾（Gey，1933年）、劉易斯（Lewis，1934年）建立該方法。 特點：是培養(yǎng)中組織塊或細胞交替地與培養(yǎng)液和空氣直接接觸。包括旋轉(zhuǎn)管、旋轉(zhuǎn)鼓、支架

37、等。 缺點：不易在顯微鏡下觀察。2021/7/16 星期五1002021/7/16 星期五1013、灌注小室培養(yǎng)法 在蓋玻片懸滴法基礎(chǔ)上發(fā)展而來，可用于連續(xù)觀察細胞動態(tài)變化，研究各種因素影響作用及活細胞反應。1912年由Burrows首創(chuàng)。2021/7/16 星期五1024、 培養(yǎng)瓶培養(yǎng)方法 培養(yǎng)瓶培養(yǎng)方法：指將培養(yǎng)對象直接接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。 1923年，卡雷爾（Carrel）設(shè)計了卡氏瓶。Earle設(shè)計了T-培養(yǎng)瓶。采用的材料對細胞無毒，透明。2021/7/16 星期五103懸浮細胞培養(yǎng)瓶滾動培養(yǎng)瓶2021/7/16 星期五104蓋玻片+培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法：先以蓋玻片為生長表面，將擬培養(yǎng)細胞或組

38、織接種于蓋玻片上，然后放進培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)。優(yōu)點：1）可以避免培養(yǎng)瓶表面粗糙等原因?qū)ε囵B(yǎng)物的影響2）可以方便顯微觀察、染色等操作，以及永久保存；3）增加了培養(yǎng)瓶培養(yǎng)面積。2021/7/16 星期五1055、 培養(yǎng)板培養(yǎng)法 培養(yǎng)板培養(yǎng)法又稱微量培養(yǎng)法。 一般是一次性使用2021/7/16 星期五1066、克隆培養(yǎng)法就是將細胞懸液中獲得的單個細胞用于培養(yǎng)，使之重新繁殖成一個新的細胞群體的培養(yǎng)技術(shù) 2021/7/16 星期五107過程:制細胞懸液連續(xù)稀釋獲得單細胞單細胞接種培養(yǎng)細胞株 :由細胞系進一步克隆化，而獲得的由單一細胞形成的細胞群體。 2021/7/16 星期五108動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)

39、動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)是建立在貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)法基礎(chǔ)上，再融合固定化細胞、流式細胞術(shù)、填充床、生物反應器、人工灌流技術(shù)等發(fā)展起來的。（一）培養(yǎng)方法 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng) 反應器貼壁培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)技術(shù) 微載體培養(yǎng)技術(shù) 多孔載體培養(yǎng) 微囊化培養(yǎng)技術(shù) 中空纖維法固定化培養(yǎng)2021/7/16 星期五1091、反應器貼壁培養(yǎng) 此種培養(yǎng)方式中，細胞貼附于固定的表面生長，不因為攪拌而跟隨培養(yǎng)液一起流動，因此比較容易更換培養(yǎng)液，不需要特殊的分離細胞和培養(yǎng)液的設(shè)備，可以采用灌流培養(yǎng)獲得高細胞密度，能有效地獲得一種產(chǎn)品；但擴大規(guī)模較難，不能直接監(jiān)控細胞的生長情況，故多用于制備用量較小、價值高的生物藥品。 2021/7/16

40、星期五1102、懸浮培養(yǎng)技術(shù)適于少數(shù)懸浮生長型細胞2021/7/16 星期五1113、微載體培養(yǎng)技術(shù)1967年，Van Wezel開發(fā)了微載體系統(tǒng)培養(yǎng)貼壁細胞，以直徑60-250um微珠作為微載體。原理：其原理是將對細胞無害的顆粒-微載體加入到培養(yǎng)容器的培養(yǎng)液中，作為載體，使細胞在微載體表面附著生長，同時通過持續(xù)攪動使微載體始終保持懸浮狀態(tài)。 理想的細胞支持物特征：生物相容性；無毒害；好的傳質(zhì)特征；機械穩(wěn)定性好；比表面大，適于細胞生長；顆粒均一；能高壓滅菌；可重復利用，易清洗；接種方便；能固定大部分細胞，能保護細胞，易使細胞、載體和培養(yǎng)基分離；適合貼壁細胞和懸浮細胞培養(yǎng)。2021/7/16 星

41、期五112微載體系統(tǒng)培養(yǎng)細胞具體步驟 p110選擇合適的微載體類型浸泡水化及消毒接種培養(yǎng)觀察和細胞計數(shù)消化分離細胞傳代培養(yǎng)交聯(lián)葡萄糖DEAE-纖維素蛋白質(zhì)：變性膠原高分子材料：硅膠、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯無機玻璃基質(zhì)常用商品化微載體有三種：Cytodex1、2、3，Cytopore和Cytoline。 2021/7/16 星期五113多孔載體培養(yǎng)優(yōu)點：易固定化、比表面大、細胞在載體內(nèi)生長，免受機械損傷；可以提高通氣量，強化傳質(zhì)。適用于貼壁細胞培養(yǎng)、懸浮細胞固定化連續(xù)灌流培養(yǎng)和大規(guī)模高密度培養(yǎng)系統(tǒng)。多孔載體材料要求：生物相容性、機械穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性2021/7/16 星期五1144、微囊化培養(yǎng)技術(shù)

42、 人造的半透膜制成的多孔微球體，借鑒固定化技術(shù)將細胞包裹在微囊內(nèi)。適用于單克隆抗體、干擾素等的制備。微囊直徑控制在200-400m為宜。制備中應注意： 溫和、快速、不損傷細胞，盡量在液體和生理條件下操作； 所用試劑和膜材料對細胞無毒害； 膜的孔徑可控制，必須使營養(yǎng)物和代謝物自由通過； 膜應有足夠機械強度抵抗培養(yǎng)中攪拌。 2021/7/16 星期五1155、中空纖維法Richard Kncazek 1972年發(fā)明。最初使用醋酸纖維素和硝酸纖維素混合組成海綿狀多孔結(jié)構(gòu)?？梢阅M細胞體內(nèi)三維狀態(tài)。目前材料有：硅膠、聚丙烯等。優(yōu)點是： 占地空間少； 細胞產(chǎn)量高，細胞密度可達109數(shù)量級； 生產(chǎn)成本低，

43、且細胞培養(yǎng)維持時間長，適用于長期分泌的細胞 2021/7/16 星期五116動物細胞培養(yǎng)的產(chǎn)物2021/7/16 星期五117（二）動物細胞生物反應器培養(yǎng)（） 1、生物反應器的特點分析 反應器主要結(jié)構(gòu)形式： 攪拌式 氣升式 固定床式技術(shù)要求：能提供均勻溫和的混合狀態(tài)，剪切力小，傳質(zhì)效果好；反應器空間利用率高，選用合適載體系統(tǒng)和材料；能保證嚴格無菌；能控溫、酸堿、溶氧和CO2濃度等；能方便快捷實現(xiàn)培養(yǎng)液連續(xù)添加，樣品采集和觀察。2021/7/16 星期五1182、生物反應器應用概況 * 動物細胞培養(yǎng)常用的生物反應器： 柱狀中空纖維反應器 板框式中空纖維反應器 中心灌流式反應器 灌流微載體生物反應

44、器 旋轉(zhuǎn)壁式反應器2021/7/16 星期五1192021/7/16 星期五1202021/7/16 星期五121（三）動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)操作方式 分批式操作 流加式操作 半連續(xù)式操作 連續(xù)式操作 灌流式操作 優(yōu)點：操作簡單，培養(yǎng)周期短，污染和細胞突變的風險小。缺點：費用高，每一次收液后，都要進行一系列新的接種放大的準備工作，此期間生產(chǎn)停工。而且收液率低.優(yōu)點：生產(chǎn)效率高，可反復長期培養(yǎng)，反復收獲產(chǎn)品。優(yōu)點：反應器的培養(yǎng)狀態(tài)可以達到恒定，細胞在穩(wěn)定的狀態(tài)下生長。缺點：開放式操作，容易造成污染。細胞容易發(fā)生變異，且對設(shè)備等要求高。優(yōu)點：培養(yǎng)狀態(tài)恒定，細胞在穩(wěn)定的狀態(tài)下生長。產(chǎn)量高等.2021/7

45、/16 星期五122（四）、動物細胞生物反應器大規(guī)模培養(yǎng) 產(chǎn)品1、應用 病毒疫苗：乙肝、脊椎灰質(zhì)炎和狂犬疫苗等非抗體免疫調(diào)節(jié)劑：干擾素、白細胞介質(zhì)、B細胞生長因子、巨噬細胞激活因子、T細胞替代因子等多態(tài)生長因子：神經(jīng)、成纖維、表皮、血清生長因子等酶類：組織血纖維酶原激活劑激素：紅細胞、促黃體生成素、促濾胞素腫瘤特異性抗原：癌胚抗原單克隆抗體病毒殺蟲劑：桿狀病毒2021/7/16 星期五1232、關(guān)鍵技術(shù) 細胞培養(yǎng)環(huán)境 ：氨離子、乳酸、二氧化碳、甲基乙二醛、滲透壓、載體細胞死亡與凋亡 ：基因工程的調(diào)控培養(yǎng)基與細胞系：無血清培養(yǎng)基的研發(fā)，基因工程的應用 過程監(jiān)控：在線氧吸收速率、葡萄糖分析，親和層

46、析與在線取樣系統(tǒng)偶聯(lián)等2021/7/16 星期五124第三節(jié) 培養(yǎng)細胞的檢測和特性鑒定 一、培養(yǎng)細胞的常規(guī)檢查 細胞接種或傳代以后，在生存期間，實驗者每天或至多間隔1-2天，要對細胞做常規(guī)性檢查. 觀察的結(jié)果是：污染與否，細胞生長和pH等情況，隨時掌握細胞動態(tài)變化，以便做換液或傳代處理，如發(fā)現(xiàn)異常情況應及時采取措施。2021/7/16 星期五1251、細胞形態(tài) 生長狀態(tài)良好的細胞，在一般顯微鏡下觀察時透明度大，輪廓不清，只有用相差顯微鏡，才能看清細胞的細微結(jié)構(gòu)。細胞機能不良時，輪廓增強，胞質(zhì)中常出現(xiàn)空泡、脂滴和其他顆粒狀物，細胞之間空隙加大，細胞形態(tài)可變得不規(guī)則甚至失去原有特點，如上皮細胞變成

47、類纖維細胞等。只有狀態(tài)良好的細胞才宜利用進行實驗。在很多情況下，細胞雖機能狀態(tài)不良，但仍可生長，如支原體輕度污染時即如此。因此生長與否尚不能作為判定細胞好壞的唯一標準，必須做全面分析。2021/7/16 星期五1262、細胞生長情況很多情況下，開始從組織最先“長”出的為游走細胞，它們單獨活動，形態(tài)不規(guī)則，用縮時逐格顯微電泳法可揭示出它們極活躍的變形、游走和吞噬活動。在游走細胞之后，接著出現(xiàn)的是成纖維細胞或上皮細胞。說細胞“生長”不如說移動更為恰當，因這時尚很少見細胞分裂，僅有細胞運動而已。只有當細胞分裂出現(xiàn)后，細胞數(shù)量逐漸增多，形成較大的生長暈或連接成片時，才真正進入了生長狀態(tài)。2021/7/

48、16 星期五1273、培養(yǎng)液 在正常情況下，培養(yǎng)液呈桃紅色。用一般溫箱培養(yǎng)時，隨細胞生長時間的延長，CO2積累增多，在超越緩沖范圍后，營養(yǎng)液酸化變黃，如不及時調(diào)節(jié)PH，對細胞會發(fā)生不利影響，嚴重時細胞脫落死亡。培養(yǎng)液中加Hepes或用CO2溫箱培養(yǎng)可使PH維持穩(wěn)定。用磷酸鹽緩沖系統(tǒng)時，可因瓶口漏氣，CO2溢出，也可能由于培養(yǎng)瓶和瓶塞洗刷不潔殘留堿性物，使之變堿發(fā)紅。更換營養(yǎng)液時間，可依營養(yǎng)物的消耗而定，細胞生長旺盛時天換一次，生長緩慢時，天亦可。2021/7/16 星期五1284、微生物污染 在長時間多量培養(yǎng)工作中，即使用品消毒操作嚴密，亦難避免偶爾發(fā)生污染。2021/7/16 星期五129污

49、染的途徑污染途徑-空氣、器材、操作、血清、組織樣品污染對培養(yǎng)細胞的影響及檢測體外培養(yǎng)細胞自身沒有抵抗污染的能力，而且培養(yǎng)基中加入的抗生素的抗污染能力也是有限的，因而培養(yǎng)細胞一旦發(fā)生污染多數(shù)將無法挽救。2021/7/16 星期五1301）細菌的污染及檢測多數(shù)培養(yǎng)細胞在遭到細菌的污染后，培養(yǎng)液短期內(nèi)顏色變黃，產(chǎn)生大量酸性物質(zhì)，出現(xiàn)明顯混濁現(xiàn)象，可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒漂浮。培養(yǎng)檢測，可以取少量培養(yǎng)液涂布在無菌瓊脂培養(yǎng)基上，過夜查看。防止，通常在嚴格的實驗操作之外，培養(yǎng)基中加入青霉素、鏈霉素能夠有效的防止細菌污染。2021/7/16 星期五1312）真菌的污染檢測真菌的污染物通常是培養(yǎng)基表面漂浮

50、的白色及黃色、黑色的小點。在顯微鏡下可見絲狀細胞的交叉。防止，酒精棉球擦洗清除瓶口污染，必要時加入抗真菌劑。2021/7/16 星期五1322021/7/16 星期五1333）支原體的污染和防止 支原體是一種介于細菌和病毒之間、能獨立生活的微生物，無細胞壁，直徑最小可以達到0.2 m，在0.22m的濾膜過濾仍然有1%左右的支原體可以通過。支原體污染后的培養(yǎng)細胞中沒有明顯可見的特征，所以很難發(fā)現(xiàn)。2021/7/16 星期五134 相差顯微鏡檢測：將細胞接種于事先放置于培養(yǎng)瓶內(nèi)的蓋玻片上，24h后取出，用相差油鏡觀察，支原體呈暗色微小顆粒位于細胞表面和細胞之間；熒光染色法：用能與DNA特異性結(jié)合的

51、熒光染料Hoechst33258，可使支原體內(nèi)含有的DNA著色，染色后用熒光顯微鏡觀察。具體方法如下：首先將細胞接種蓋玻片上，在細胞未長滿前取出玻片，用不含酚紅的Hanks液漂洗一下，用1：3醋酸甲醇固定10min，然后用生理鹽水漂洗，置于用生理鹽水配置濃度為50g/ml的Hoechst33258中染色10min。染色后用蒸餾水洗1-2min，向細胞面滴加pH5.5磷酸緩沖液數(shù)滴，然后置熒光顯微鏡下觀察。鏡下支原體為散在于細胞周圍或附于細胞膜表面的亮綠色小點。2021/7/16 星期五135電鏡檢查：用掃描電鏡方法簡便快速，也可以利用透射電鏡。鏡下觀察支原體膜為三層結(jié)構(gòu)，其中央有電子密度大的密

52、度顆粒群或絲狀的中心束。支原體多吸附或散在于細胞表面和細胞之間。橫斷面與細胞微絨毛相似，但微絨毛電子密度比支原體小，且中央無顆粒群或中央束。支原體代謝需固醇類物質(zhì)，部分種類需要精氨酸、2或葡萄糖，每一種支原體都有自身特點。DNA分子雜交檢查或支原體培養(yǎng)等方法：檢出率高，但方法較復雜。 2021/7/16 星期五1362021/7/16 星期五1374）病毒的污染及檢測濾器對病毒沒有任何阻擋作用，通常不容易被污染，因為病毒不能在細胞外復制，而且它們通常具有宿主細胞的感染限制。通常其檢測方式是抗體檢測及PCR檢測。細胞交叉污染及檢測不容易發(fā)生，常見的細胞形態(tài)觀察可以區(qū)分。2021/7/16 星期五

53、138污染的預防培養(yǎng)前培養(yǎng)操作時其他注意事項必要的細胞備份對新引進或構(gòu)建的細胞株應加強觀察，并做必要的支原體和病毒的檢查。定期消毒培養(yǎng)箱。2021/7/16 星期五1392021/7/16 星期五140二、培養(yǎng)細胞的生物學鑒定1、細胞形態(tài)觀察內(nèi)容：細胞形態(tài)、核質(zhì)比例、染色質(zhì)、核仁大小及多少、微絲微管排列狀態(tài)等方法：倒置相差顯微鏡、電鏡2021/7/16 星期五1412021/7/16 星期五1422021/7/16 星期五1432、細胞生長情況細胞生長曲線測定1）、細胞計數(shù)法血細胞計數(shù)器：人工計數(shù)細胞Counter計數(shù)儀2021/7/16 星期五1442021/7/16 星期五145用酒精沖洗

54、計數(shù)板后擦凈，將蓋片覆在計算板上，微微移向一側(cè)， 以便滴加細胞懸液. 取一吸管伸入培養(yǎng)瓶，輕輕吹打細胞懸液，混勻。從蓋片邊緣滴加細胞懸液，使其充滿計數(shù)板和蓋片間的空隙中。 注意：勿使液體漫過蓋片或出現(xiàn)氣泡。 鏡下觀察計數(shù)： 計算計數(shù)板四角大格內(nèi)的細胞數(shù)，壓線者只計算 左側(cè)和上方的,右側(cè)和下方的不計算在內(nèi)。2021/7/16 星期五146步驟取生長良好接近匯合的細胞，用胰酶消化，用新培養(yǎng)基制成細胞懸液后計數(shù)。如是非貼壁細胞，則離心棄舊培養(yǎng)基后，換上一定量的新鮮培養(yǎng)基然后制成細胞懸液計數(shù)。 根據(jù)細胞計數(shù)結(jié)果按每個小方瓶5104mL作傳代培養(yǎng)接種細胞，共接種21瓶細胞。24 h后開始計數(shù)細胞，以后每

55、隔24 h計數(shù)一次，每次取3瓶細胞，分別進行計數(shù)。計算平均值。連續(xù)計數(shù)7 d。根據(jù)細胞計數(shù)結(jié)果，以單位細胞數(shù)(細胞數(shù)mL)為縱坐標，以時間為橫坐標繪制生長曲線。2021/7/16 星期五1472）、 四唑鹽（MTT）比色法四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍， 四唑鹽比色法的原理：活細胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍紫色產(chǎn)物（formazan)，并沉淀在細胞中，而死細胞沒有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細胞中藍紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。再用酶標儀測定OD值 MTT法簡單快速、準確，廣泛應用于新藥篩選、細胞毒牲試驗、腫瘤放射敏感性實驗等。2021/7/

56、16 星期五148操作步驟 （1）單細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板；103-104細胞/孔，每孔培養(yǎng)基總量200微升（96孔培養(yǎng)板每孔容積370微升），37、5CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時間（根據(jù)實驗目的決定培養(yǎng)時間） （2）加入2毫克毫升的MTT液（50微升孔）；繼續(xù)培養(yǎng)3小時。 （3）吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入DMSO液（150微升孔），將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩10分鐘，使結(jié)晶物溶解。 （4）酶標儀在490nm處檢測各孔OD值記錄結(jié)果，繪制細胞生長曲線2021/7/16 星期五149CCK-8試劑盒 原理：Cell Counting Kit-8（CCK-8試劑盒）是檢一種基于水溶性四唑鹽的廣泛應

57、用快速高靈敏度檢測試劑盒，為MTT法的替代方法，試劑盒中采用水溶性四唑鹽在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的formazan。細胞增殖越多越快，則顏色越深；細胞毒性越大，則顏色越淺。對于同樣的細胞，顏色的深淺和細胞數(shù)目呈良好線性關(guān)系。用于測細胞增殖、細胞存活和細胞毒性。2021/7/16 星期五1502、細胞分裂指數(shù)體外培養(yǎng)細胞生長、分裂繁殖的能力，可用分裂指數(shù)來表示。它與生長曲線有一定的聯(lián)系，如隨著分裂指數(shù)的不斷提高，細胞也就進入了指數(shù)生長期。 分裂指數(shù)指細胞群體中分裂細胞所占的百分比，它是測定細胞周期的一個重要指標，也是不同實驗研究選擇細胞的重要依據(jù)。20

58、21/7/16 星期五151步驟 消化細胞，將細胞懸液接至內(nèi)含蓋玻片的培養(yǎng)皿中。 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時，使細胞長在蓋片上。 取出蓋片，按下列順序操作： 1） PBS漂洗3分鐘甲醇：冰醋酸=3：1固定液中固定30分鐘Giemsa液染色10分鐘自來水沖洗。 2）蓋片晾干后反扣在載玻片上，鏡檢。 3） 計算: 分裂指數(shù)=分裂細胞數(shù)/總細胞數(shù)100% 2021/7/16 星期五152細胞周期（1）放射性核素標記自顯影用3H標記脫氧胸腺嘧啶核苷 處理30min后，每間隔30min取材，直到48h為止，觀察和計算細胞分裂相出現(xiàn)時間、高峰和消失分裂相數(shù)，繪圖分析。（2）流式細胞儀測定法2021/7/1

59、6 星期五1534、培養(yǎng)細胞活力測定細胞活力測定是腫瘤體外研究中應用最廣的技術(shù)手段之一。任何培養(yǎng)瓶內(nèi)生長的細胞都由死細胞和活細胞組成，從形態(tài)上區(qū)別死、活細胞是困難的。1 、細胞克隆形成率實驗克隆形成試驗是測定單個細胞增殖能力的有效方法之一，其基本原理是單個細胞在體外增殖6代以上，其后代所組成的細胞群體形成肉眼可見的克隆?？寺⌒纬陕视脕肀硎炯毎脑鲋衬芰?克隆形成率克隆形成數(shù)接種細胞數(shù)，通過計數(shù)克隆形成率，可對單個細胞的增殖潛力作定量分析，了解細胞的增殖率和對生存環(huán)境的適應性。克隆形成率高者其獨立生存能力強。這種方法常用于抗癌藥物敏感性試驗、腫瘤放射生物學試驗等。常用的方法有平板克隆形成試驗和軟

60、瓊脂克隆形成試驗。缺點：操作繁瑣優(yōu)點：精確、可靠2021/7/16 星期五1542、臺盼藍法 活細胞不被染色，死細胞染成藍色，用活細胞占細胞中的百分比表示細胞活力 臺盼藍排斥試驗：（1）臺盼藍濃度： 母液：4%，用雙蒸水配制；工作液：0.4%，用PBS稀釋。（2）稀釋倍數(shù)： 臺盼藍工作液：細胞懸液 = 1：9（3）結(jié)果判斷：鏡下觀察見死細胞被染成淡蘭色，活細胞不著色。（4）細胞活力的計算活細胞率 = 活細胞總數(shù) / （活細胞總數(shù)+死細胞總數(shù)） 100%2021/7/16 星期五1552021/7/16 星期五156（三）培養(yǎng)細胞種屬鑒定方法1、熒光抗體染色鑒別細胞的種屬 間接熒光抗體染色技術(shù)采