RNAi的實驗原理和操作實用技術(shù)復(fù)習(xí)過程

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。RNAi的實驗原理和操作實用技術(shù)RNAi的實驗原理和操作實用技術(shù)幾十年來生物學(xué)上最重要的進(jìn)展，也許是關(guān)于RNA分子能調(diào)節(jié)基因表達(dá)的發(fā)現(xiàn)。RNA干涉（HYPERLINK/biology/Special/RNAi/Index.htmlRNAi）是指雙鏈RNA分子使基因表達(dá)沉寂的現(xiàn)象，是在線蟲中發(fā)現(xiàn)的，在1998年的一篇Nature論文中被公諸于眾。此后，科學(xué)家們明白，HYPERLINK/biology/Special/RNAi/Index.htmlRNAi還有其他形式，它既是一種了解基因功能的強大工具，又是

2、很多生物的HYPERLINK/biology/Special/genomics/Index.html基因組所采用的一種在演化上來講很古老的防衛(wèi)方法。HYPERLINK/biology/Special/RNAi/Index.htmlRNAi肯定有很多新用途，HYPERLINK/biology/Special/RNAi/Index.htmlRNAi還可能具有一些仍然有待去發(fā)現(xiàn)的天然功能。HYPERLINK/biology/Special/RNAi/Index.htmlRNAi實驗原理與方法近年來的研究表明，將與mRNA對應(yīng)的正義RNA和反義RNA組成的雙鏈RNA(dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞，可以使mRN

3、A發(fā)生特異性的降解，導(dǎo)致其相應(yīng)的基因沉默。這種轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制(post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)被稱為RNA干擾（HYPERLINK/biology/Special/RNAi/Index.htmlRNAi）。一、HYPERLINK/biology/Special/RNAi/Index.htmlRNAi的分子機(jī)制通過生化和遺傳學(xué)研究表明，RNA干擾包括起始階段和效應(yīng)階段(inititationandeffectorsteps)。在起始階段，加入的小分子RNA被切割為21-23核苷酸長的小分子干擾RNA片段(smallinterferingRNAs,

4、siRNAs)。證據(jù)表明；一個稱為Dicer的酶，是RNaseIII家族中特異識別雙鏈RNA的一員，它能以一種ATP依賴的方式逐步切割由外源導(dǎo)入或者由HYPERLINK/Search.asp?Field=Title&ClassID=&keyword=轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)基因，病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA，切割將RNA降解為19-21bp的雙鏈RNAs(siRNAs)，每個片段的3端都有2個堿基突出。在HYPERLINK/biology/Special/RNAi/Index.htmlRNAi效應(yīng)階段，siRNA雙鏈結(jié)合一個核酶復(fù)合物從而形成所謂RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RNA-inducedsilenci

5、ngcomplex,RISC）。激活RISC需要一個ATP依賴的將小分子RNA解雙鏈的過程。激活的RISC通過堿基配對定位到同源mRNA轉(zhuǎn)錄本上，并在距離siRNA3端12個堿基的位置切割mRNA。盡管切割的確切機(jī)制尚不明了，但每個RISC都包含一個siRNA和一個不同于Dicer的RNA酶。另外，還有研究證明含有啟動子區(qū)的dsRNA在植物體內(nèi)同樣被切割成21-23nt長的片段,這種dsRNA可使內(nèi)源相應(yīng)的DNA序列甲基化,從而使啟動子失去功能,使其下游基因沉默.二、如何進(jìn)行HYPERLINK/biology/Special/RNAi/Index.htmlRNAi試驗(一)siRNA的設(shè)計1.

6、在設(shè)計HYPERLINK/biology/Special/RNAi/Index.htmlRNAi實驗時，可以先在以下網(wǎng)站進(jìn)行目標(biāo)序列的篩選：HYPERLINK/business/products/order2.htmt_blank/business/products/order2.htmHYPERLINK/techlib/misc/siRNA_finder.htmlt_blank/techlib/misc/siRNA_finder.htmlHYPERLINK/Stu/shilin/rnai.htmlt_blank/Stu/shilin/rnai.htmlHYPERLINK/rnadesign/

7、default.aspx?SID=45358710t_blank/rnadesign/default.aspx?SID=453587102.HYPERLINK/biology/Special/RNAi/Index.htmlRNAi目標(biāo)序列的選取原則：(1)從轉(zhuǎn)錄本（mRNA）的AUG起始密碼開始，尋找“AA”二連序列，并記下其3端的19個堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點。有研究結(jié)果顯示GC含量在45%55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。Tuschl等建議在設(shè)計siRNA時不要針對5和3端的非編碼區(qū)（untranslatedregions，UTRs)，原因是這些地方有豐富的

8、調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，而這些UTR結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù)合物可能會影響siRNP核酸內(nèi)切酶復(fù)合物結(jié)合mRNA從而影響siRNA的效果。(2)將潛在的序列和相應(yīng)的HYPERLINK/biology/Special/genomics/Index.html基因組數(shù)據(jù)庫（人，或者小鼠，大鼠等等）進(jìn)行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。例如使用BLAST（/BLAST/）(3)選出合適的目標(biāo)序列進(jìn)行合成。通常一個基因需要設(shè)計多個靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。3.陰性對照一個完整的siRNA實驗應(yīng)該有陰性對照，作為陰性對照的siRNA應(yīng)該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是

9、和mRNA沒有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA序列打亂，同樣要檢查結(jié)果以保證它和目的靶細(xì)胞中其他基因沒有同源性。4.目前已證實的siRNA可以在下面的網(wǎng)頁找到：HYPERLINK/catalog/category.aspx?key=49t_blank/catalog/category.aspx?key=49HYPERLINK/techlib/tb/tb_502.htmlt_blank/techlib/tb/tb_502.htmlHYPERLINK/mmcmanus/www/siRNADB.htmlt_blank/mmcmanus/www/siRNADB.htmlHYPERLINK/

10、Order_Entry/jsp/BrowseCatalog.jsp?Category=Publishedt_blank/Order_Entry/jsp/BrowseCatalog.jsp?Category=Published(二)siRNA的制備目前為止較為常用的方法有通過化學(xué)合成，體外轉(zhuǎn)錄，長片斷dsRNAs經(jīng)RNaseIII類降解(e.g.Dicer,E.coli,RNaseIII)體外制備siRNA，以及通過siRNA表達(dá)載體或者病毒載體，PCR制備的siRNA表達(dá)框在細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生siRNA。體外制備1.化學(xué)合成許多國外公司都可以根據(jù)用戶要求提供高質(zhì)量的化學(xué)合成siRNA。主要的缺點包

11、括價格高，定制周期長，特別是有特殊需求的。由于價格比其他方法高，為一個基因合成34對siRNAs的成本就更高了，比較常見的做法是用其他方法篩選出最有效的序列再進(jìn)行化學(xué)合成。最適用于：已經(jīng)找到最有效的siRNA的情況下，需要大量siRNA進(jìn)行研究不適用于：篩選siRNA等長時間的研究，主要原因是價格因素2.體外轉(zhuǎn)錄以DNAOligo為模版，通過體外轉(zhuǎn)錄合成siRNAs，成本相對化學(xué)合成法而言比較低，而且能夠比化學(xué)合成法更快的得到siRNAs。不足之處是實驗的規(guī)模受到限制，雖然一次體外轉(zhuǎn)錄合成能提供足夠做數(shù)百次轉(zhuǎn)染的siRNAs，但是反應(yīng)規(guī)模和量始終有一定的限制。而且和化學(xué)合成相比，還是需要占用研

12、究人員相當(dāng)?shù)臅r間。值得一提的是體外轉(zhuǎn)錄得到的siRNAs毒性小，穩(wěn)定性好，效率高，只需要化學(xué)合成的siRNA量的1/10就可以達(dá)到化學(xué)合成siRNA所能達(dá)到的效果，從而使轉(zhuǎn)染效率更高。最適用于：篩選siRNAs，特別是需要制備多種siRNAs，化學(xué)合成的價格成為障礙時。不適用于：實驗需要大量的，一個特定的siRNA。長期研究。3.用RNaseIII消化長片斷雙鏈RNA制備siRNA其他制備siRNA的方法的缺陷是需要設(shè)計和檢驗多個siRNA序列以便找到一個有效的siRNA。而用這種方法制備一份混合有各種siRNAs“混合雞尾酒”就可以避免這個缺陷。選擇通常是2001000堿基的靶mRNA模版，

13、用體外轉(zhuǎn)錄的方法制備長片斷雙鏈dsRNA，然后用RNaseIII(orDicer)在體外消化，得到一種siRNAs“混合雞尾酒”。在除掉沒有被消化的dsRNA后，這個siRNA混合物就可以直接轉(zhuǎn)染細(xì)胞，方法和單一的siRNA轉(zhuǎn)染一樣。由于siRNA混合物中有許多不同的siRNAs，通常能夠保證目的基因被有效地抑制。dsRNA消化法的主要優(yōu)點在于可以跳過檢測和篩選有效siRNA序列的步驟，為研究人員節(jié)省時間和金錢（注意：通常用RNAseIII通常比用Dicer要便宜）。不過這種方法的缺點也很明顯，就是有可能引發(fā)非特異的基因沉默，特別是同源或者是密切相關(guān)的基因。現(xiàn)在多數(shù)的研究顯示這種情況通常不會造

14、成影響。最適用于：快速而經(jīng)濟(jì)地研究某個基因功能缺失的表型不適用于：長時間的研究項目，或者是需要一個特定的siRNA進(jìn)行研究，特別是基因治療體內(nèi)表達(dá)前面的3種方法主要都是體外制備siRNAs，并且需要專門的RNA轉(zhuǎn)染試劑將siRNAs轉(zhuǎn)到細(xì)胞內(nèi)。而采用siRNA表達(dá)載體和基于PCR的表達(dá)框架則屬于：從轉(zhuǎn)染到細(xì)胞的DNA模版中在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄得到siRNAs。這兩種方法的優(yōu)點在于不需要直接操作RNA。4.siRNA表達(dá)載體多數(shù)的siRNA表達(dá)載體依賴三種RNA聚合酶III啟動子(polIII)中的一種，操縱一段小的發(fā)夾RNA(shorthairpinRNA,shRNA)在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)。這三類啟動

15、子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6啟動子和人H1啟動子。之所以采用RNApolIII啟動子是由于它可以在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)更多的小分子RNA，而且它是通過添加一串（3到6個）U來終止轉(zhuǎn)錄的。要使用這類載體，需要訂購2段編碼短發(fā)夾RNA序列的DNA單鏈，退火，HYPERLINK/Search.asp?Field=Title&ClassID=&keyword=克隆克隆到相應(yīng)載體的polIII啟動子下游。由于涉及到HYPERLINK/Search.asp?Field=Title&ClassID=&keyword=克隆克隆，這個過程需要幾周甚至數(shù)月的時間，同時也需要經(jīng)過測序以保證HYPERLINK/Se

16、arch.asp?Field=Title&ClassID=&keyword=克隆克隆的序列是正確的。siRNA表達(dá)載體的優(yōu)點在于可以進(jìn)行較長期研究帶有抗生素標(biāo)記的載體可以在細(xì)胞中持續(xù)抑制靶基因的表達(dá)，持續(xù)數(shù)星期甚至更久。病毒載體也可用于siRNA表達(dá)，其優(yōu)勢在于可以直接高效率感染細(xì)胞進(jìn)行基因沉默的研究，避免由于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率低而帶來的種種不便,而且轉(zhuǎn)染效果更加穩(wěn)定。最適用于：已知一個有效的siRNA序列，需要維持較長時間的基因沉默。不適用于：篩選siRNA序列（其實主要是指需要多個HYPERLINK/Search.asp?Field=Title&ClassID=&keyword=克隆克隆和測序等

17、較為費時、繁瑣的工作）。5.siRNA表達(dá)框架siRNA表達(dá)框架(siRNAexpressioncassettes，SECs)是一種由PCR得到的siRNA表達(dá)模版，包括一個RNApolIII啟動子，一段發(fā)夾結(jié)構(gòu)siRNA，一個RNApolIII終止位點，能夠直接導(dǎo)入細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)而無需事前HYPERLINK/Search.asp?Field=Title&ClassID=&keyword=克隆克隆到載體中。和siRNA表達(dá)載體不同的是，SECs不需要載體HYPERLINK/Search.asp?Field=Title&ClassID=&keyword=克隆克隆、測序等頗為費時的步驟，可以直接由P

18、CR得到，不用一天的時間。因此，SECs成為篩選siRNA的最有效工具，甚至可以用來篩選在特定的研究體系中啟動子和siRNA的最適搭配。如果在PCR兩端添加酶切位點，那么通過SECs篩選出的最有效的siRNA后，可以直接HYPERLINK/Search.asp?Field=Title&ClassID=&keyword=克隆克隆到載體中構(gòu)建siRNA表達(dá)載體。構(gòu)建好的載體可以用于穩(wěn)定表達(dá)siRNA和長效抑制的研究。這個方法的主要缺點是PCR產(chǎn)物很難轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中（晶賽公司的Protocol可以解決這一問題）不能進(jìn)行序列測定，PCR和DNA合成時可能差生的誤讀不能被發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致結(jié)果不理想。最適用于：篩選

19、siRNA序列，在HYPERLINK/Search.asp?Field=Title&ClassID=&keyword=克隆克隆到載體前篩選最佳啟動子不適用于：長期抑制研究。（如果HYPERLINK/Search.asp?Field=Title&ClassID=&keyword=克隆克隆到載體后就可以了）(三)siRNA的轉(zhuǎn)染將制備好的siRNA，siRNA表達(dá)載體或表達(dá)框架轉(zhuǎn)導(dǎo)至真核細(xì)胞中的方法主要有以下幾種：1.磷酸鈣共沉淀將氯化鈣，RNA(或DNA)和磷酸緩沖液混合，沉淀形成包含DNA且極小的不溶的磷酸鈣顆粒。磷酸鈣-DNA復(fù)合物粘附到細(xì)胞膜并通過胞飲進(jìn)入目的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。沉淀物的大小和質(zhì)

20、量對于磷酸鈣轉(zhuǎn)染的成功至關(guān)重要。在實驗中使用的每種試劑都必須小心校準(zhǔn)，保證質(zhì)量，因為甚至偏離最優(yōu)條件十分之一個pH都會導(dǎo)致磷酸鈣轉(zhuǎn)染的失敗。2.電穿孔法電穿孔通過將細(xì)胞暴露在短暫的高場強電脈沖中轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。將細(xì)胞懸浮液置于電場中會誘導(dǎo)沿細(xì)胞膜的電壓差異，據(jù)認(rèn)為這種電壓差異會導(dǎo)致細(xì)胞膜暫時穿孔。電脈沖和場強的優(yōu)化對于成功的轉(zhuǎn)染非常重要，因為過高的場強和過長的電脈沖時間會不可逆地傷害細(xì)胞膜而裂解細(xì)胞。一般，成功的電穿孔過程都伴隨高水平（50%或更高）的毒性。3.DEAE-葡聚糖和polybrene帶正電的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚體復(fù)合物和帶負(fù)電的DNA分子使得DNA可以結(jié)合在細(xì)胞表面

21、。通過使用DMSO或甘油獲得的滲透休克將DNA復(fù)合體導(dǎo)入。兩種試劑都已成功用于轉(zhuǎn)染。DEAE-葡聚糖僅限于瞬時轉(zhuǎn)染。4.機(jī)械法轉(zhuǎn)染技術(shù)也包括使用機(jī)械的方法，比如顯微注射和基因槍（biolisticparticle）。顯微注射使用一根細(xì)針頭將DNA，RNA或蛋白直接轉(zhuǎn)入細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核?；驑屖褂酶邏簃icroprojectile將大分子導(dǎo)入細(xì)胞。5.陽離子脂質(zhì)體試劑在優(yōu)化條件下將陽離子脂質(zhì)體試劑加入水中時，其可以形成微小的（平均大小約100-400nm）單層脂質(zhì)體。這些脂質(zhì)體帶正電，可以靠靜電作用結(jié)合到DNA的磷酸骨架上以及帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面。因此使用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的原理與以前利用中性脂質(zhì)體轉(zhuǎn)

22、染的原理不同。使用陽離子脂質(zhì)體試劑，DNA并沒有預(yù)先包埋在脂質(zhì)體中，而是帶負(fù)電的DNA自動結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體上，形成DNA-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物。據(jù)稱，一個約5kb的質(zhì)粒會結(jié)合2-4個脂質(zhì)體。被俘獲的DNA就會被導(dǎo)入培養(yǎng)的細(xì)胞?，F(xiàn)存對DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)原理的證據(jù)來源于內(nèi)吞體和溶酶體。為了達(dá)到高的轉(zhuǎn)染效率，在轉(zhuǎn)染實驗過程中，需要注意以下幾點：1.純化siRNA在轉(zhuǎn)染前要確認(rèn)siRNA的大小和純度。為得到高純度的siRNA，推薦用玻璃纖維結(jié)合，洗脫或通過15-20%丙烯酰胺膠除去反應(yīng)中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和鹽離子。注意：化學(xué)合成的RNA通常需要跑膠電泳純化（即PAGE膠純化）。2.避免RNA酶

23、污染微量的RNA酶將導(dǎo)致siRNA實驗失敗。由于實驗環(huán)境中RNA酶普遍存在，如皮膚，頭發(fā)，所有徒手接觸過的物品或暴露在空氣中的物品等，此保證實驗每個步驟不受RNA酶污染非常重要。3.健康的HYPERLINK/Search.asp?Field=Title&ClassID=&keyword=細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)物和嚴(yán)格的操作確保轉(zhuǎn)染的重復(fù)性通常，健康的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較高。此外，較低的傳代數(shù)能確保每次實驗所用細(xì)胞的穩(wěn)定性。為了優(yōu)化實驗，推薦用50代以下的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，否則細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率會隨時間明顯下降。4.避免使用抗生素Ambion公司推薦從細(xì)胞種植到轉(zhuǎn)染后72小時期間避免使用抗生素?？股貢诖┩傅募?xì)胞中積累

24、毒素。有些細(xì)胞和轉(zhuǎn)染試劑在siRNA轉(zhuǎn)染時需要無血清的條件。這種情況下，可同時用正常培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基做對比實驗，以得到最佳轉(zhuǎn)染效果。5.選擇合適的轉(zhuǎn)染試劑針對siRNA制備方法以及靶細(xì)胞類型的不同，選擇好的轉(zhuǎn)染試劑和優(yōu)化的操作對siRNA實驗的成功至關(guān)重要。6.通過合適的陽性對照優(yōu)化轉(zhuǎn)染和檢測條件對大多數(shù)細(xì)胞，看家基因是較好的陽性對照。將不同濃度的陽性對照的siRNA轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞（同樣適合實驗靶siRNA），轉(zhuǎn)染48小時后統(tǒng)計對照蛋白或mRNA相對于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的降低水平。過多的siRNA將導(dǎo)致細(xì)胞毒性以至死亡。7.通過標(biāo)記siRNA來優(yōu)化實驗熒光標(biāo)記的siRNA能用來分析siRNA穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)

25、染效率。標(biāo)記的siRNA還可用作siRNA胞內(nèi)定位及雙標(biāo)記實驗（配合標(biāo)記抗體）來追蹤轉(zhuǎn)染過程中導(dǎo)入了siRNA的細(xì)胞，將轉(zhuǎn)染與靶蛋白表達(dá)的下調(diào)結(jié)合起來。三、HYPERLINK/biology/Special/RNAi/Index.htmlRNAi的應(yīng)用前景1.研究基因功能的新工具已有研究表明HYPERLINK/biology/Special/RNAi/Index.htmlRNAi能夠在哺乳動物中滅活或降低特異性基因的表達(dá)，制作多種表型，而且抑制基因表達(dá)的時間可以隨意控制在發(fā)育的任何階段，產(chǎn)生類似基因敲除的效應(yīng)。線蟲和果蠅的全部HYPERLINK/biology/Special/genomics

26、/Index.html基因組序列已測試完畢，發(fā)現(xiàn)大量未知功能的新基因，HYPERLINK/biology/Special/RNAi/Index.htmlRNAi將大大促進(jìn)對這些新基因功能的研究。與傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)相比，這一技術(shù)具有投入少，周期短，操作簡單等優(yōu)勢，近來HYPERLINK/biology/Special/RNAi/Index.htmlRNAi成功用于構(gòu)建HYPERLINK/Search.asp?Field=Title&ClassID=&keyword=轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)基因動物模型的報道日益增多，標(biāo)志著HYPERLINK/biology/Special/RNAi/Index.htmlRNAi將成為研究基因功能不可或缺的工具。2.研究信號傳導(dǎo)通路的新途徑聯(lián)合利用傳統(tǒng)的缺失突變技術(shù)和HYPERLINK/biology/Special/RNAi/Index.htmlRNAi技術(shù)可以很容易地確定復(fù)雜的信號傳導(dǎo)途徑中不同基因的上下游關(guān)系，Clemensy等應(yīng)用HYPERLI