生命科學(xué)基礎(chǔ)實驗教學(xué)示范中心27課件

1、生命科學(xué)基礎(chǔ)實驗教學(xué)示范中心 生物化學(xué)技術(shù)原理部分第一章 蛋白質(zhì)（酶）、核酸的分離純化第三章 層析技術(shù)第二章 離心技術(shù)第四章 電泳技術(shù)第一章 蛋白質(zhì)（酶）、核酸的分離純化第一節(jié) 引言 一、分離純化的意義二、分離純化的要求三、分離純化的一般程序第二節(jié) 蛋白質(zhì)（酶）、核酸分離純化的前處理 一、材料的選擇與預(yù)處理 二、細(xì)胞的破碎 三、細(xì)胞器的分離 四、提取第三節(jié) 分離純化 一、 粗提純 二、 精提純 三、 純度鑒定第四節(jié)生物大分子的濃縮、干燥及保存 第一節(jié) 引言蛋白質(zhì)（酶）、核酸存在于一切生物體中，是非常重要的生物大分子；蛋白質(zhì)是生物功能的執(zhí)行者，擔(dān)負(fù)著生物催化、物質(zhì)運輸、運動、防御、調(diào)控及記憶、識

2、別等多種生理功能；核酸是遺傳信息的攜帶者，在生物體中指導(dǎo)各種蛋白質(zhì)的合成。 性質(zhì) 方法分子大小 透析、超濾、差速離心、凝膠過濾溶解度 等電點沉淀、鹽析、有機(jī)溶劑沉淀電荷 電泳、離子交換層析吸附性質(zhì) 吸附層析對配體分子 的生物親和力 親和層析生物大分子的分離純化的方法很多，主要是根據(jù)分子之間特異性的差異，如分子大小 、溶解度、電荷等建立起來的。一、分離純化的意義從生物材料中分離制備蛋白質(zhì)、核酸，研究其結(jié)構(gòu)與功能，對于了解生命活動的規(guī)律，闡明生命現(xiàn)象的本質(zhì)有重大意義；工業(yè)生產(chǎn)的需要：食品、發(fā)酵、紡織、制革等工業(yè)，需要大量的高活性的酶制劑；（如用淀粉酶制造葡萄糖、麥芽糖、糊精以及糖漿等）醫(yī)療的需要：

3、如用豬胰島素治療糖尿病；基因工程的需要。二、分離純化的要求1、純度：主要取決于研究的目的和應(yīng)用上的要求。如作為研究其一級結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)的蛋白、一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系的蛋白質(zhì)制劑、工具酶和標(biāo)準(zhǔn)蛋白、酶法分析的酶制劑，都要求均一；工業(yè)、醫(yī)藥方面應(yīng)用的酶和蛋白質(zhì)制劑，達(dá)到一定純度即可，不要求均一。2、活性：要求大分子保持天然構(gòu)象狀態(tài)，有高度的生物活性。3、收率：希望收率越高越好，但在分離純化過程中總有不少損失，而且提純步驟越多，損失越大。三、分離純化的一般程序生物大分子的分離純化一般可分為以下幾個階段： 材料的選擇和預(yù)處理； 破碎細(xì)胞及提?。ㄓ袝r還需要進(jìn)行細(xì)胞器的分離）； 分離純化：包括粗分級分離和細(xì)

4、分級分離。其中前兩個階段為生物大分子分離純化的前處理。第二節(jié) 蛋白質(zhì)（酶）、核酸 分離純化的前處理一、材料的選擇與預(yù)處理選擇材料主要根據(jù)實驗?zāi)康亩?。工業(yè)生產(chǎn)上注意選擇含量高、來源豐富、易獲得、制備工藝簡單、成本低的動植物組織或微生物做原料。科研選材則無需考慮上述問題，只要能達(dá)到實驗?zāi)康募纯?。實驗材料選定后，常常需要進(jìn)行預(yù)處理，如動物材料需要除去一些與實驗無關(guān)的結(jié)締組織、脂肪組織；植物種子需要除殼；微生物需要將菌體與發(fā)酵液分開。另外，必須盡可能保持材料的新鮮，盡快加工處理，若不立即進(jìn)行實驗或加工，應(yīng)冷凍保存。二、細(xì)胞的破碎分離提取某一生物大分子，首先要求生物大分子從原來的組織或細(xì)胞中以溶解的狀

5、態(tài)釋放出來，并保持原來的天然狀態(tài)，不丟失其生物活性。因此應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)姆椒▽⒔M織和細(xì)胞破碎。但若材料是體液（如血）或生物體分泌到體外的分泌物，則不必進(jìn)行組織細(xì)胞的破碎。組織細(xì)胞的破碎方法很多，根據(jù)不同的實驗規(guī)模，不同的實驗材料和實驗要求，使用的破碎方法和條件也不同。一般動物組織和細(xì)胞可用電動搗碎機(jī)或勻漿器破碎或用超聲波處理破碎；植物組織和細(xì)胞由于具有纖維素、半纖維素和果膠等物質(zhì)組成的細(xì)胞壁，一般常用與石英砂和適當(dāng)?shù)奶崛∫阂黄鹧心サ姆椒ㄆ扑榛蛴美w維素酶處理也能達(dá)到目的；細(xì)菌細(xì)胞的破碎比較困難，因為整個細(xì)菌細(xì)胞壁的骨架實際上是一借共價鍵連接而成的肽聚糖囊狀大分子，非常堅韌。破碎的方法常有超聲波震蕩、

6、與石英砂研磨、高壓擠壓或溶菌酶處理（以分解肽聚糖）。三、細(xì)胞器的分離細(xì)胞器包括細(xì)胞核、線粒體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，植物細(xì)胞還有葉綠體。如果要分離制備分布在這些細(xì)胞器中的生物大分子，為了防止其他細(xì)胞組分中的物質(zhì)對制備物的干擾或污染，還需先將細(xì)胞器分離出來，然后在某一細(xì)胞器中分離某一物質(zhì)。細(xì)胞器的分離一般采用差速離心法，即將破碎后的細(xì)胞在適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)中進(jìn)行離心，常用的介質(zhì)有蔗糖、甘露醇、檸檬酸、聚乙二醇等。各種細(xì)胞組分按質(zhì)量大小的不同，經(jīng)過不同速度的離心后，沉降于離心管的不同部位，經(jīng)多次分步離心后，即可獲得所需組分。四、提取組織細(xì)胞破碎過程中，大量的胞內(nèi)酶及細(xì)胞內(nèi)含物被釋放出來，必須立即將其置于一定條件

7、下和溶劑中，讓制備物充分溶解，并盡可能保持原來的天然狀態(tài)，避免因長久放置造成制備物的分解破壞，這就是提取。提取實際上就是將制備物從復(fù)雜的生物體系中轉(zhuǎn)移到特定的人工液相體系中（通常是水、緩沖液、稀鹽溶液或有機(jī)溶劑）。1、蛋白質(zhì)（酶）的提取大多數(shù)蛋白質(zhì)均能溶于水、稀鹽、稀堿或稀酸溶液中，故蛋白質(zhì)的提取一般以水溶液提取為主。通常采用類似生理條件下的緩沖液，如20-50m mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH7.0-7.5）或0.1mol/L Tris-HCl（pH7.5-8.0）緩沖液作提取液。對于一些和脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中非極性較多的蛋白質(zhì)和酶，不溶于水、稀鹽、稀堿、稀酸，常在提取液中加入適量的有機(jī)

8、溶劑，如乙醇、丙酮、異丙醇、正丁醇等。2、核酸的提取DNA和RNA在細(xì)胞中常與蛋白質(zhì)結(jié)合，以核蛋白的形式存在。DNA的提?。阂话闶抢肈NA-核蛋白（DNP）易溶于1mol/L NaCl溶液。RNA的提取：利用RNA-核蛋白（RNP）易溶于0.14mol/LNaCl溶液，先提取得到RNP。提取得到DNP或RNP后，再將蛋白質(zhì)除去即可得到相應(yīng)的核酸。蛋白質(zhì)的去除可以選擇去污劑法或有機(jī)溶劑法。去污劑法是利用SDS等陰離子去污劑與蛋白質(zhì)帶正電荷的側(cè)鏈結(jié)合，從而使核酸與蛋白質(zhì)分開。然后加入濃醋酸鉀溶液，使SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物沉淀，并使多余的SDS轉(zhuǎn)化為溶解度小的鉀鹽而同時沉淀。有機(jī)溶劑法是利用酚、氯仿

9、的混合液作蛋白質(zhì)的變性劑，當(dāng)它們與含核酸和蛋白質(zhì)的水溶液一起振搖時形成乳狀液，蛋白質(zhì)因充分接觸酚和氯仿而變性，與核酸分開。離心后可分為兩相，一般上層為含核酸的水相，下層為有機(jī)相，交界處是變性凝聚的蛋白質(zhì)層。最后利用乙醇或異丙醇將核酸沉淀離心收集即可。 蛋白質(zhì)的去除 第三節(jié) 分離純化從細(xì)胞中提取得到的生物大分子往往是不純凈的，含有大量雜質(zhì)，必須進(jìn)一步分離純化，這一階段可分為粗分級分離和細(xì)分級分離兩步進(jìn)行。一、粗提純1.蛋白質(zhì)的粗提純主要是利用鹽析法、等電點沉淀、有機(jī)溶劑沉淀等方法，使目的蛋白與其它較大量的雜蛋白分開。這些方法的特點是簡便，處理量大，既能除去大量雜質(zhì)，又能濃縮蛋白質(zhì)，但分辨率低。（

10、1）鹽析向蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽（NH4)2SO4，Na2SO4，NaCl，使蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀，這種現(xiàn)象稱為鹽析。鹽析作用是由于當(dāng)鹽濃度較高時，鹽離子與水分子作用，使水的活度降低，原來溶液中大部分的自由水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子的水化水，從而降低蛋白質(zhì)極性基團(tuán)與水分子之間的作用，破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化層。 不同的蛋白質(zhì)分子，由于其分子表面的極性基團(tuán)的種類、數(shù)目以及排布的不同，其水化層厚度不同，故鹽析所需要的鹽濃度也不一樣，因此調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)中鹽的濃度，可以使不同的蛋白質(zhì)分別沉淀。如：血清球蛋白清蛋白(NH4)2SO450%飽和度飽和析出析出分段鹽析（2）等電點沉淀蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，其溶解度

11、與其凈電荷數(shù)量有關(guān)，隨溶液pH變化而變化。在溶液pH值等于蛋白質(zhì)等電點時，蛋白質(zhì)的溶解度最小。不同的蛋白質(zhì)有不同的等電點，因此通過調(diào)節(jié)溶液pH到目的蛋白的等電點，可使之沉淀而與其它蛋白質(zhì)分開，從而除去大量雜蛋白。（3）有機(jī)溶劑法與水互溶的極性有機(jī)溶劑如甲醇、乙醇、丙酮等能使蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低。有機(jī)溶劑引起蛋白質(zhì)變性的原因有兩個：降低水的介電常數(shù)，使蛋白質(zhì)分子表面可解離基團(tuán)的離子化程度減弱，水化程度降低，促進(jìn)了蛋白質(zhì)分子的聚集沉淀。是極性有機(jī)溶劑與蛋白質(zhì)爭奪水化水，而使蛋白質(zhì)分子沉淀。室溫下，這些有機(jī)溶劑不僅能使蛋白質(zhì)沉淀，而且伴隨著變性。若預(yù)先將有機(jī)溶劑冷卻，然后在不斷攪拌下將其逐漸

12、加入蛋白質(zhì)溶液中，防止有機(jī)溶劑局部濃度過高，則在很大程度上解決變性問題。不同的蛋白質(zhì)由于水化層厚度不同，發(fā)生沉淀需要的有機(jī)溶劑濃度不同，因此可利用不同濃度的有機(jī)溶劑分離不同的蛋白質(zhì)。2.核酸的粗提純從細(xì)胞中提取得到的核酸，?；祀s有蛋白質(zhì)及各種大小的核酸同類物等雜質(zhì)，可采用適當(dāng)方法進(jìn)行粗提純。粗提純中，進(jìn)一步將蛋白質(zhì)除去,可用去污劑或有機(jī)溶劑多次反復(fù)提取。從RNA除去混雜的DNA，可用DNAase將DNA降解掉。從DNA中除去混雜的RNA，可用RNAase將RNA降解掉。二、精提純1.蛋白質(zhì)精提純一般蛋白質(zhì)樣品經(jīng)粗制分級后，體積較小，雜質(zhì)大部分被除去。進(jìn)一步提純，通常使用高分辨率的柱層析及電泳方

13、法。常用的柱層析方法有凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析、親和層析。常用的電泳方法有聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳。另外，結(jié)晶也是蛋白質(zhì)分離純化的方法之一，制備的結(jié)晶物常常作為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析之用。核酸樣品進(jìn)行精提純，一般常用超離心、電泳、柱層析等方法。超離心包括速度區(qū)帶離心、沉降平衡超離心。電泳包括聚丙烯酰胺凝膠電泳、瓊脂糖電泳。 前者凝膠孔徑小，適合分離1000個核苷酸以下的核酸分子。后者孔徑大，適合分離較大的核酸分子。柱層析主要有凝膠過濾柱層析、離子交換層析、羥基磷灰石柱層析。2.核酸精提純?nèi)?純度鑒定生物大分子經(jīng)過分離提純，最后還要鑒定制品的純度。蛋白質(zhì)和酶制品純度鑒定通常采用的方法有

14、：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法、等電聚焦電泳法、超速離心沉降分析法等。選用任何單獨一種鑒定方法都不能最后確定蛋白質(zhì)的純度，必須同時采用2-3種不同的方法才能確定。核酸的純度鑒定一般采用瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠電泳，沉降分析和紫外吸收法（A260/A280）等方法。同蛋白質(zhì)一樣，核酸純度鑒定也必須采用2-3種方法才能確定。第四節(jié)生物大分子的濃縮、干燥及保存一、濃縮1.吸收法2.超濾法二、干燥1.真空干燥2.冷凍真空干燥三、樣品的保存1.干態(tài)保存2.液態(tài)保存 離心技術(shù)概論 一般制備離心 超離心技術(shù)第二章 離心技術(shù)臺式高、超速離心機(jī)0.6-10萬rpm離心機(jī)制備性分析性分析性超速離心機(jī)普通離心機(jī)冰

15、凍離心機(jī)臺式（或地面式）普通離心機(jī)大容量冰凍離心機(jī)小于0.6萬rpm高速冰凍離心機(jī)0.6-2.5萬超速冰凍離心機(jī)2.5-8萬或更高(分析性超速離心主要用于檢測大分子物質(zhì)的沉降特征和結(jié)構(gòu)等)概述一般制備離心 一般制備離心是指在分離、濃縮、提純樣品中，不必制備密度梯度的一次完成的離心操作，實驗室用低、高速離心機(jī)可應(yīng)用于此項技術(shù)。 臺式或地面式普通離心機(jī)高速冰凍離心機(jī)科研人員將采集的臍帶血放置到低溫超速離心機(jī)內(nèi)進(jìn)行技術(shù)處理超速冰凍離心機(jī)應(yīng)用范圍： 病毒及亞細(xì)胞組份分離 蛋白梯度分離 脂蛋白分離 RNA梯度沉淀 質(zhì)粒DNA提純 制備性超速離心主要利用離心機(jī)轉(zhuǎn)子高速旋轉(zhuǎn)時所產(chǎn)生的強(qiáng)大離心力，加快顆粒的沉

16、降速度，把樣品中不同沉降系數(shù)或浮力密度差的物質(zhì)分開。沉降系數(shù)指單位(cm)離心場中顆粒沉降的速度，用s表示，其單位是110-13秒，簡稱S，即1S110-13秒。沉降速度是指在強(qiáng)大離心力作用下，單位時間內(nèi)物質(zhì)運動的距離。制備超離心的關(guān)鍵是如何根據(jù)顆粒和介質(zhì)的性質(zhì)以及轉(zhuǎn)子的某些參數(shù)來確定轉(zhuǎn)速和離心時間。顆粒沉降的時間和速度取決于：離心力、顆粒的大小形狀和密度、沉降介質(zhì)的密度和粘度。超離心技術(shù)一、原理和計算二、轉(zhuǎn)子離心管及選擇三、離心技術(shù)類型四、梯度回收一、原理和計算（一）離心力和相對離心力當(dāng)離心機(jī)轉(zhuǎn)頭以一定的角速度w（弧度/秒）旋轉(zhuǎn)，顆粒的旋轉(zhuǎn)半徑為r（厘米）時，任何顆粒均受一個向外的離心力，此

17、離心力為： F= m2r 式中，F(xiàn)通常以地心引力表示，稱為相對離心力（RCF），相對離心力指在離心力場中，作用于顆粒的離心力相當(dāng)于地球重力的倍數(shù)，單位是重力加速度g（980厘米/秒2），這時RCF可表示如下： RCF = 2r/980 實際上，這一關(guān)系式常用每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)n（或rpm），以更通用表達(dá)式來表示，由于=2n/60 于是： RCF=42（rpm）2r/3600*980 簡化得： RCF=1.11910-5 （rpm）2r 一般低轉(zhuǎn)速時常用rpm來表示，高轉(zhuǎn)速離心則以g表示。半徑相對離心力轉(zhuǎn)速方法：三點一線，左對左，右對右為了便于進(jìn)行轉(zhuǎn)速和相對離心力之間的換算，人們在式的基礎(chǔ)上制作了三者關(guān)

18、系的列線計算圖RCF=1.11910-5 （rpm）2r二、轉(zhuǎn)子離心管及選擇（一）離心管常見的玻璃離心管質(zhì)硬且脆，不能承受超離心的壓力。用于超離心機(jī)轉(zhuǎn)子中的離心管分為塑料管及不銹鋼管兩類。離心時樣品一般應(yīng)裝滿離心管，否則將可能因有氣泡而使管的外部受壓不均，造成離心管破裂，使轉(zhuǎn)子不平衡產(chǎn)生事故。 （二）離心管帽超離心機(jī)所用離心管一般都附有管帽，離心時離心管需戴上管帽。（三）轉(zhuǎn)子及選擇 主要有角轉(zhuǎn)子、水平轉(zhuǎn)子、垂直轉(zhuǎn)子、區(qū)帶轉(zhuǎn)子等幾種類型。1、角轉(zhuǎn)子指離心管腔與轉(zhuǎn)軸成一定傾角的轉(zhuǎn)子，角度越大，沉降越結(jié)實，分離效果越好，相反，角度越小，顆粒沉降距離短，沉降速度快，但分離效果差。顆粒在角轉(zhuǎn)子中沉降時，

19、先沿離心力方向撞向離心管，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一側(cè)會出現(xiàn)顆粒沉積，稱為“壁效應(yīng)”。最適合差速離心，強(qiáng)度大、方便，但加速或減速時，對樣品有攪動。 2、水平轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)子活動管套內(nèi)的離心管，旋轉(zhuǎn)時隨著轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)動，從垂直懸吊上升到水平位置（約200800rpm）時。顆粒在水平轉(zhuǎn)子中的沉降是沿管子方向的，梯度離心中顆粒沉降區(qū)帶橫過離心管，離心后區(qū)帶不必重新定位，但只有處于樣品區(qū)帶中心的顆粒才直接向管底沉降，其它顆粒則撞向壁的兩側(cè)，產(chǎn)生“壁效應(yīng)”，但受振動和變速攪亂后對流現(xiàn)象小得多。3、垂直轉(zhuǎn)子角式轉(zhuǎn)子的特殊形式，主要用于等密度梯度離心，這種轉(zhuǎn)子顆粒移動距離短，比水平式和角式轉(zhuǎn)子節(jié)約大量時間，但速度

20、劇變?nèi)菀桩a(chǎn)生對流擾亂。4、區(qū)帶轉(zhuǎn)子 三、離心技術(shù)類型 常用離心技術(shù)一般包括差速離心法，速度區(qū)帶法和等密度梯度沉降法。（一）差速離心法原理：采用逐漸增加離心速度或低速和高速交替進(jìn)行離心，使沉降速度不同的顆粒在不同的分離速度及不同的離心時間下分批分離的方法，稱為差速離心法。當(dāng)以一定離心力在一定的離心時間內(nèi)進(jìn)行離心時，在離心管底部就會得到最大和最重顆粒的沉淀，分出的上清液在加大轉(zhuǎn)速下再進(jìn)行離心，又得到第二部分較大、較重顆粒的“沉淀”及含小和輕顆?！吧锨逡骸?，如此多次離心處理，即能把液體中的不同顆粒較好分開。這時所得沉淀是不純的，需經(jīng)再懸浮和再離心（23次），才能得到較純顆粒。用于分離不同大小的細(xì)胞和

21、細(xì)胞器。在差速離心中細(xì)胞器沉降的順序依次為：核、線粒體、溶酶體與過氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體、最后為核蛋白體。已破碎的細(xì)胞 沉淀（細(xì)胞核） 上清液 沉淀（細(xì)胞膜碎片、線粒體、溶酶體） 上清液 沉淀（核糖核蛋白體）上清液（可溶性組分）500g，1010 000g，10100 000g，3h（二）速度區(qū)帶法速度區(qū)帶主要用于分離密度相近而大小不等的細(xì)胞或細(xì)胞器。這種沉降方法所采用的介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分離生物顆粒的最小密度。生物顆粒（細(xì)胞或細(xì)器）在十分平緩的密度梯度介質(zhì)中按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達(dá)到分離。（三）等密度梯度沉降法原理：等密度梯度沉降（isopycnic sed

22、imentation）適用于分離密度不等的顆粒。細(xì)胞或細(xì)胞器在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)足夠大離心力和是夠長時間則沉降或漂浮到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達(dá)到平衡，從而將不同密度的細(xì)胞或細(xì)胞器分離。等密度梯度離心一般常用CsCl、RuCl、蔗糖、甘油等做介質(zhì)。介質(zhì)梯度不需預(yù)先制備，離心時把密度均一的介質(zhì)液和樣品混合后裝入離心管，通過離心形成梯度，讓顆粒在梯度中進(jìn)行再分配。常用來分離提取核酸、亞細(xì)胞器和質(zhì)粒。四、梯度回收1、穿刺法 這是一種簡易的手工操作法，采用針穿刺離心管底部，使梯度靠重力自由滴出，然后依次作分布收集，此法適用于薄壁塑料管，流出液部分收集于小試管中，經(jīng)分析決定取舍或合并。 此法

23、對梯度擾動小，但離心管不能再用，不適合回收管底有沉淀的梯度，也不使用于不銹鋼或厚壁塑料管。2、取代法 回收梯度中最常使用的一種方法，分為向上及向下取代兩種。取代法優(yōu)點是不破壞離心管，能用于較粘梯度，可借光學(xué)（放射性）系統(tǒng)進(jìn)行流出液跟蹤，簡化分析化驗工作。缺點是開始取代操作時易引起擾亂，操作需特別小心，梯度粘度太大時也不合適。 濃取代液 稀 濃通入空氣、輕液體收集 濃 稀收集3、虹吸法 用一根聚乙烯小管插到管底部，用虹吸法吸出梯度，它也不損傷離心管，尤其適用于不銹鋼管中物質(zhì)的分級分離，但虹吸時易引起分離區(qū)帶擾亂，最好使用專門的裝置。 除取代法和虹吸法外，有時從管上部直接仔細(xì)地用注射器或吸管定量移

24、出梯度液，效果也較好。4、切割法 適用于極粘梯度，就是用離心管切割器將凍結(jié)的塑料管切成薄片，從而將梯度分部收集，此法僅適用于賽璐璐或硝酸纖維素管。梯度的分析分析梯度中的回收物質(zhì)常用紫外吸收法、酶活力測定法、放射標(biāo)記法。蛋白質(zhì)、核酸或某些含蛋白質(zhì)、核酸占優(yōu)勢的細(xì)胞器、病毒可用紫外吸收法測定。細(xì)胞器一般可測定標(biāo)志酶活性，通常每一組分至少選二種標(biāo)志酶，如一時找不到更好的測定目的物，也可測光吸收來推斷分布的組分，對于同位素標(biāo)記物，最好是測定其放射活性。此外，某些情況下也可用免疫法，電泳法測定物質(zhì)在梯度中的分布，亞細(xì)胞成分可用電鏡或光學(xué)顯微鏡觀察分析各分部的組分，最后分析結(jié)果。第三章 層析技術(shù)引言層析法

25、的基本原理層析法的分類第一節(jié) 吸附層析技術(shù)第二節(jié) 分配層析技術(shù)第三節(jié) 凝膠過濾層析技術(shù)第四節(jié) 離子交換層析法第五節(jié) 親和層析法第六節(jié) 高壓液相層析（HPLC）引言層析法也稱色譜法，是1906年俄國植物學(xué)家Michael Tswett發(fā)現(xiàn)并命名的。他將植物葉子的色素通過裝填有吸附劑的柱子，各種色素以不同的速率流動后形成不同的色帶而被分開，由此得名為“色譜法”（Chromatography) 。后來無色物質(zhì)也可利用吸附柱層析分離。1944年出現(xiàn)紙層析。以后層析法不斷發(fā)展，相繼出現(xiàn)氣相層析、高壓液相層析、薄層層析、親和層析、凝膠層析等。層析法的基本原理層析法是利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差異（如

26、吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等），使各組分在兩相（一相為固定的，稱為固定相；另一相流過固定相，稱為流動相）中的分布程度不同，從而使各組分以不同的速度移動而達(dá)到分離的目的。層析法的分類按兩相所處的狀態(tài)分類： 流動相有兩種狀態(tài)： *液體作為流動相 *氣體作為流動相 固定相也有兩種狀態(tài)： *固體吸附劑作為固定相 *以吸附在固體上的液體作為固定相按兩相所處的狀態(tài)分為： 液相層析 液-固層析 液-液層析 氣相層析 氣-固層析 氣-液層析按層析過程的機(jī)理分類：吸附層析：利用吸附劑表面對不同組分吸附性能的差異，達(dá)到分離鑒定的目的。分配層析：利用不同組分在流動相和固定相之間的分配系數(shù)不同，使之

27、分離。離子交換層析：利用不同組分對離子交換劑親和力的不同。凝膠層析：利用某些凝膠對于不同分子大小的組分阻滯作用的不同。按操作形式不同分類：柱層析：將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個方向移動而達(dá)到分離。紙層析：用濾紙做液體的載體，點樣后，用流動相展開，以達(dá)到分離鑒定的目的。薄層層析：將適當(dāng)粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙層析類似的方法進(jìn)行物質(zhì)的分離和鑒定。第一節(jié) 吸附層析技術(shù)一、基本原理吸附層析法（液-固層析法，LSC） 原理：利用固定相的固體吸附劑表面對不同組分吸附力的大小及洗脫液對它的溶解作用（解吸作用）的差異進(jìn)行分離。 特點：適合分離不同種類的化合物(醇類和芳香烴）。二、吸附劑吸附劑是具有大表面積的

28、活性多孔固體，與待分離物質(zhì)的極性官能團(tuán)作用。常用的吸附劑有活性炭、硅石、氧化鋁、羥基磷灰石等羥基羥基磷灰石（HA）Ca10(PO4)6.(OH)2,可用于分離蛋白質(zhì)與核酸。其表面有Ca2+和PO43-兩種帶電基團(tuán)；酸性和中性蛋白質(zhì)可與Ca2+結(jié)合；堿性蛋白質(zhì)可與PO43-結(jié)合。HA柱層析最重要的用途之一是分離單鏈DNA和雙鏈DNA，因為它對雙鏈DNA的親和力大于單鏈DNA。第二節(jié) 分配層析技術(shù)分配層析法（液-液層析法，LLC）原理：利用混合物在兩種不相混溶的液相（固定相和流動相）之間的分配系數(shù)的不同而達(dá)到分離各組分的目的。固定相液體均勻覆蓋于載體表面，流動相流過固定相。分配系數(shù)：當(dāng)一種溶質(zhì)分布

29、在兩個互不相溶的溶劑中時，它在固定相和流動相兩相內(nèi)的濃度之比是個常數(shù)，稱為分配系數(shù)。 K=c1/c2分配系數(shù)小的溶質(zhì)在流動相中的分配的數(shù)量多，移動快；分配系數(shù)大的溶質(zhì)在固定相分配的數(shù)量多，移動慢。因此可彼此分開。特點：液-液層析法適合于分離同系物或同分異構(gòu)體ABCDE321616 8 16 8 4 4 12 12 2 2 8 12 8層析柱分離物質(zhì)的示意圖：固定相為固體顆粒，裝在層析柱內(nèi)，高5cm，固定相周圍充滿液體流動相，每厘米柱中液相體積為1cm3。若在柱頂加入1cm3溶劑,其中含32mg樣品，同時應(yīng)有相同體積的溶劑從柱底流出，此時樣品處于柱中A位置。若樣品的分配系數(shù)是1，則它在固相與液相

30、間等量分配。若再有1cm3的溶劑加到柱上，A部分中的溶劑帶著16mg的物質(zhì)向下移動到B，A和B中的物質(zhì)都將發(fā)生再分配，不同組分的含量 不同組分在柱中的位置上部中部下部不同物質(zhì)分配系數(shù)不同時：第三節(jié) 凝膠過濾層析技術(shù)一、基本原理概念（排阻層析，分子篩層析）：當(dāng)生物大分子通過裝有凝膠顆粒的層析柱時，根據(jù)它們分子大小不同而進(jìn)行分離的技術(shù)。原理：凝膠顆粒內(nèi)部具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，被分離的混合物流過層析柱時，比凝膠孔徑大的分子不能進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動，并最先被洗脫出來；比網(wǎng)孔小的分子能不同程度的自由出入凝膠孔內(nèi)外，在柱內(nèi)經(jīng)過的路程較長移動速度較慢，最后被洗脫出來。二、凝膠的種類和性質(zhì)

31、1.交聯(lián)葡聚糖凝膠（Sephadex) 1) Sephadex G G 后的數(shù)字為凝膠吸水值的10倍。 G 反應(yīng)凝膠的交聯(lián)程度、膨脹程度和分部范圍。 2） Sephadex LH-20，是Sephadex G-25的羧丙基衍生物，溶于水和親脂性溶劑，用于分離不溶于水的物質(zhì)。2.瓊脂糖凝膠（Sepharose ;pharmacia;Bio-Gel) 依靠糖鏈之間的次級鍵維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，瓊脂糖密度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越密集。 3.聚丙烯酰胺凝膠 一種人工合成的凝膠，以丙烯酰胺為單位，由甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)而成。交聯(lián)劑越多，孔隙度越小。 商品名為生物膠-P（Bio-Gel P)。 4.聚苯乙烯凝膠（Styro

32、gel) 大網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)。三、 凝膠過濾在試驗室中的應(yīng)用1）生物大分子物質(zhì)的分離純化2）分子量的測定3）分級分離4）溶液濃縮5）平衡常數(shù)的測定6）細(xì)胞及顆粒的分離LogMABCLogM測V測蛋白質(zhì)通過凝膠柱的速度即洗脫體積與其分子量有關(guān)， LogM=（k1-k2）Ve（Ve為洗脫體積）先測得幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的Ve，并以其分子量對數(shù)對Ve作圖得一直線，再測出待測樣品的Ve，查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可確定分子量。原理:根據(jù)離子交換樹脂對需要分離的各種離子的親和力不同而達(dá)到分離的目的。將離子交換樹脂裝入層析柱。離子交換樹脂通常是不溶于水的高分子物質(zhì)，分子中含有可解離的基團(tuán)。含有酸性可解離基團(tuán)的稱為陽離子交換樹脂，可解

33、離出H+，含有堿性可解離基團(tuán)的稱為陰離子交換樹脂，可解離出OH-。第四節(jié) 離子交換層析法離子交換層析的基本原理+若選擇陽離子交換樹脂，則帶正電荷的物質(zhì)與H+發(fā)生交換而結(jié)合在樹脂上。若選擇陰離子交換樹脂，則帶負(fù)電荷的物質(zhì)可與OH-發(fā)生交換而結(jié)合在樹脂上。物質(zhì)在樹脂上結(jié)合的牢固程度即親和力大小有差異，因此選用適當(dāng)?shù)南疵撘罕憧蓪⒒旌衔镏械慕M分逐個洗脫下來，達(dá)到分離純化的目的。+原理：利用生物大分子間特異的親和能力來純化生物大分子，如：抗原和抗體；酶和底物或輔酶或抑制劑；激素和受體；RNA和其互補(bǔ)的DNA等。將待純化物質(zhì)的特異配體通過適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)反應(yīng)共價的連接到載體上，待純化的物質(zhì)可被配體吸附，雜質(zhì)則不

34、被吸附，通過洗脫雜質(zhì)即可除去。被結(jié)合的物質(zhì)再用含游離的相應(yīng)配體溶液把它從柱上洗脫下來。第五節(jié) 親和層析法+CC配基蛋白質(zhì)1.配基固相化2.親和吸附固體載體3.解吸附C第六節(jié) 高壓液相層析（HPLC）特點：使用的固相支持劑顆粒很細(xì)，表面積很大,因而分辨率很高。 溶劑系統(tǒng)采用高壓，因此洗脫速度增大。許多類型的柱層析都可用HPLC來代替，如分配層析、離子交換層析、吸附層析、凝膠過濾等。第四章 電 泳 技 術(shù)引言第一節(jié) 電泳的基本原理第二節(jié) 聚丙烯酰胺凝膠電泳第三節(jié) 瓊脂糖凝膠電泳第四節(jié) 免疫電泳一、概述二、聚丙烯酰胺凝膠的制備三、凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑大小的關(guān)系四、不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳引言電泳的

35、概念：帶電物質(zhì)在電場中向相反電極移動的現(xiàn)象稱為電泳（electrophoresis）。電泳現(xiàn)象早在十九世紀(jì)初就已發(fā)現(xiàn)（1808年俄國物理學(xué)家Ress進(jìn)行了世界上第一次電泳實驗）。但電泳技術(shù)的廣泛應(yīng)用，則是在1937年用濾紙作為支持介質(zhì)成功地進(jìn)行紙電泳以后，特別是近幾十年以來，電泳技術(shù)發(fā)展很快，各種類型的電泳技術(shù)相繼誕生，在生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。按電泳的原理來分，可分為二類：自由界面電泳：又稱移動界面電泳，是指在沒有支持介質(zhì)的溶液中進(jìn)行的電泳。其裝置復(fù)雜，價格昂貴，費時費力，不便于推廣應(yīng)用。區(qū)帶電泳：是指有支持介質(zhì)的電泳，待分離物質(zhì)在支持介質(zhì)上分離成若干區(qū)帶。支持介質(zhì)的作用

36、主要是防止電泳過程中的對流和擴(kuò)散，以使被分離的成分得到最大分辨率的分離。區(qū)帶電泳由于采用的介質(zhì)不同以及技術(shù)上的差異，又可分為不同的類型。 電泳的分類引言按支持介質(zhì)種類的不同，區(qū)帶電泳可分為：紙電泳：用濾紙作為支持介質(zhì)，多用于核苷酸的定性定量分析。醋酸纖維素薄膜電泳：醫(yī)學(xué)上，常用于分析血清蛋白、胎盤球蛋白，其優(yōu)點是簡便迅速，便于保存照相，比紙電泳分辨率高。 以上二種類型的電泳，由于介質(zhì)的孔徑度大，沒有分子篩效應(yīng)，主要靠被分離物的電荷多少進(jìn)行分離。引言淀粉凝膠電泳：多用于同工酶分析，凝膠鋪厚些，可一層一層剝層分析（一板多測）。天然淀粉經(jīng)加工處理即可使用，但孔徑度可調(diào)性差，并且由于其批號之間的質(zhì)量相

37、差很大，很難得到重復(fù)的電泳結(jié)果，加之電泳時間長，操作麻煩，分辨率低，實驗室中已很少使用。瓊脂糖凝膠電泳：一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應(yīng)。聚丙烯酰胺凝膠電泳：可用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢測。其分辨率較高。聚丙烯酰胺和瓊脂糖是目前實驗室最常用的支持介質(zhì)引言第一節(jié) 電泳的基本原理電泳是在電場的作用下而產(chǎn)生的物質(zhì)運動，不同的物質(zhì)在一定的電場強(qiáng)度下，由于所帶電荷不同，向相反電極泳動速度不同進(jìn)而達(dá)到分離目的。 . 電泳的基本原理在一定pH條件下，每一種分子都具有特定的電荷（種類和數(shù)量）、大小和形狀，在一定時間內(nèi)它們在相同電場中泳動速度不同，各自集中到

38、特定的位置上而形成緊密的泳動帶。這就是帶電粒子可以用電泳技術(shù)進(jìn)行分離、分析和鑒定的基本原理。 +-若將帶凈電荷Q的粒子放入電場，則該粒子所受到的電荷引力為： F引=EQ （1）在溶液中,運動粒子與溶液之間存在阻力F阻 F阻=6rV 當(dāng)F引=F阻時 EQ= 6rV V= 由上式可以看出,粒子的移動速度(泳動速度V)與電場強(qiáng)度(E)和粒子所帶電荷量(Q)成正比,而與粒子的半徑(r)及溶液的粘度()成反比。非球形分子（如線狀DNA）在電泳過程中受到更大的阻力，即粒子的泳動速度與粒子形狀也有關(guān)。EQ6r（2）（3）（4） 電泳的基本原理由（4）可知，帶電粒子的泳動速度受電場強(qiáng)度影響，使得同一種帶電粒子

39、在不同電場里泳動速度不同，為了便于比較，常用遷移率m（或稱泳動度，指帶電粒子在單位電場強(qiáng)度下的泳動速度）代替泳動速度表示粒子的泳動情況。 m = V/E = Q/6r （5） 由上式可以看出，遷移率僅與球形粒子所帶電荷數(shù)量，粒子大小及溶液粘度有關(guān)而與電場強(qiáng)度無關(guān)。EQ6r（4）V= 電泳的基本原理 由于蛋白質(zhì)、氨基酸等的電離度隨溶液pH變化而不同，所以實際上常使用有效遷移率。有效遷移率U為遷移率m和當(dāng)時條件下電離度的乘積。 U = m （6） 將（6）式代入（5）式得： U = （7） .Q.6r 由（7）式可以看出，凡能影響溶液粘度的因素如溫度，影響分子帶電量Q及解離度的因素如pH的改變，都

40、會對有效遷移率，產(chǎn)生影響。 電泳的基本原理 以上討論的是在溶液中進(jìn)行的自由界面電泳的情況，在用支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳中，除上述影響因素外，有效遷移率還受電滲（是指在電場中，液體對于固體支持物的相對移動）的影響。電泳時應(yīng)避免用高電滲物質(zhì)作支持介質(zhì)。 最后要考慮選用離子強(qiáng)度適宜的溶液。離子強(qiáng)度影響粒子的電動電勢，溶液的離子強(qiáng)度越高，由于溶液中的離子會分擔(dān)大部分電流，則粒子的電動電勢越小，泳動速度越慢；反之越快。 總之，電泳受粒子本身大小、形狀、所帶電量、溶液粘度、溫度、pH、電滲及離子強(qiáng)度多種因素的影響。 電泳的基本原理第二節(jié) 聚丙烯酰胺凝膠電泳一、概述聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide

41、 gel electropho-resis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳方法。聚丙烯酰胺凝膠具有機(jī)械強(qiáng)度好，有彈性，透明，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，對pH和溫度變化小，沒有吸附和電滲作用小的特點，是一種很好的電泳支持介質(zhì)。聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體（acry-lamide，簡稱Acr）和交聯(lián)劑N，N-甲叉雙丙烯酰胺（methylanebisacrylamide，簡稱Bis）在催化劑作用下合成的。CH2=CHC=ONH2CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH-CH2-CH-CH2-CH-nCH2-CH- C=O C=O NH2 NH CH2 NH C=O-C

42、H2-CH-CH2-CH-nCH2-CH- C=O C=O NH NH2丙烯酰胺N,N-甲叉雙丙烯酰胺聚丙烯酰胺二、聚丙烯酰胺凝膠的制備聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化體系有兩種： 1.化學(xué)聚合 化學(xué)聚合的催化劑通常采用過硫酸銨，此外還需要加速劑TEMED（N，N，N，N-四甲基乙二胺），它能以自由基的形式存在。微量TEMED的加入，可使過硫酸銨形成氧自由基，這些自由基的產(chǎn)生可引發(fā)丙烯酰胺單體形成自由基，從而與甲叉雙丙烯酰胺的聚合、交聯(lián)反應(yīng)，形成有一定孔徑的聚丙烯酰胺。. 光聚合通常用核黃素為催化劑，核黃素經(jīng)光照形成無色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引發(fā)聚合反應(yīng)。TEMED的存在，可以加速聚合。 上述

43、聚合反應(yīng)受許多因素的影響： （1）大氣氧能淬滅自由基，阻止多聚體鏈長的增加。在進(jìn)行化學(xué)聚合前，一般用減壓抽氣的辦法除去溶液中溶解的空氣?；蛟谀z液表面，往往覆蓋一層水，隔絕空氣，可加速聚合。 （2）低溫、低pH都會減慢聚合反應(yīng)速度。 （3）有些材料如聚丙烯酸甲酯有機(jī)玻璃，一些金屬等可抑制聚合反應(yīng)。2.光聚合 凝膠的物理性質(zhì)如機(jī)械強(qiáng)度、彈性、透明度和粘著度都取決于凝膠總濃度（T）和Acr與Bis兩者之比。凝膠總濃度（T）和交聯(lián)度（C）的計算公式分別為：T= C= 凝膠孔徑大小，主要受凝膠濃度的影響。凝膠濃度越大，孔徑越小。凝膠濃度過大，膠硬而脆，易折斷；濃度過小，凝膠稀軟，不易操作，也易斷裂。當(dāng)凝

44、膠濃度確定后，交聯(lián)度為5%時，凝膠具有最小孔徑，超過5%或低于5%時凝膠孔徑都要增大。 三、凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑大小的關(guān)系A(chǔ)cr（g）+Bis（g）V（ml）X100%Acr（g）+Bis（g）Bis（g）X100% 在濃度為7.5% 的凝膠中，大多數(shù)生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)能得到滿意的分離效果。因此，把濃度為7.5% 凝膠稱為標(biāo)準(zhǔn)膠。對于一個未知樣品，常用7.5%的標(biāo)準(zhǔn)膠或4%-10% 的凝膠梯度來測試，而后選出適宜的凝膠濃度。 用于研究大分子核酸的凝膠多為2.4%的大孔凝膠，此時凝膠太軟，不易操作，可加入0.5%瓊脂糖，或在3%凝膠中加入20%蔗糖以增加機(jī)械強(qiáng)度而又不影響凝膠孔徑大小。四、不連續(xù)

45、聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)的不連續(xù)性表現(xiàn)在以下幾個方面： 1.凝膠由上、下兩層凝膠組成，兩層凝膠的孔徑不同，上層為大孔徑的濃縮膠，下層為小孔徑的分離膠。 2.緩沖液離子組成及各層凝膠的pH不同。電極緩沖液為pH8.3的Tris-甘氨酸緩沖液，濃縮膠為pH6.7的Tris-HCl緩沖液，而分離膠為pH8.9的Tris-HCl緩沖液。 3.在電場中形成不連續(xù)的電位梯度。 在這樣一個不連續(xù)的系統(tǒng)里，存在三種物理效應(yīng)，即電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)和濃縮效應(yīng)，由于這三種物理效應(yīng)，使樣品分離效果好，分辨率高。8.38.38.96.7+-水平板式電泳槽垂直板式電泳槽電泳條帶第三節(jié) 瓊脂糖凝膠電泳 瓊脂糖凝膠電泳是用瓊

46、脂或瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法。對于分子量較大的樣品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔徑較大的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離。 瓊脂糖凝膠約可區(qū)分相差100bp的DNA片段，其分辨率雖比聚丙烯酰胺凝膠低，但它制備容易，分離范圍廣，尤其適于分離大片段DNA。普通瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍為0.2-20kb，利用脈沖電泳，可分離高達(dá)107bp的DNA片段。第四節(jié) 免疫電泳把電泳技術(shù)與免疫擴(kuò)散結(jié)合起來，叫做免疫電泳。 免疫電泳技術(shù)是基于抗原的電泳遷移以及與抗體的專一性免疫沉淀反應(yīng)。在大部分電泳中，樣品中的抗原通過含有相應(yīng)抗體的pH8.6的薄層瓊脂糖凝膠，抗原在pH8.6時通常帶強(qiáng)負(fù)電，而抗體在此pH不

47、帶電，不能遷移?？乖诤锌贵w的凝膠中電泳時發(fā)生免疫反應(yīng)。最初，抗原過量，所以僅產(chǎn)生可溶性的免疫混合物，與抗原一起向陽極移動，當(dāng)抗體與抗原比例合適時就形成大的、不溶性的免疫沉淀?？捎糜跈z查蛋白質(zhì)制劑的純度，研究抗血清制劑中是否具有抗某種已知抗原的抗體，檢驗兩種抗原是否相同等。 lXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!

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