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文檔簡介
1、 酶的生物改造 酶的定向進(jìn)化研究進(jìn)展介 紹 提 綱定向進(jìn)化技術(shù)概述定向進(jìn)化技術(shù)的應(yīng)用定向進(jìn)化的方法 1、酶分子改造的方法基于序列的理性設(shè)計:化學(xué)修飾和定點(diǎn)突變 利用已知酶分子的特征、空間結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)和功能之間關(guān)系,以及氨基酸殘基功能等信息,對酶分子進(jìn)行改造;利用基因操作模擬自然進(jìn)化的非理性設(shè)計:定向進(jìn)化 不需要準(zhǔn)確的酶分子結(jié)構(gòu)信息而通過隨機(jī)突變、基因重組等方法模擬自然進(jìn)化機(jī)制在體外改造酶基因,并定向篩選出所需突變酶; 一、定向進(jìn)化概述實(shí)例:木糖異構(gòu)酶的定點(diǎn)突變改造實(shí)例:木糖異構(gòu)酶的定點(diǎn)突變改造突變前蛋白與木糖復(fù)合物模型 突變后蛋白與木糖復(fù)合物模型 氨基酸殘基與木糖之間距離比突變前下降,不利于體積
2、更大的葡萄糖底物,易于結(jié)合底物木糖,對木糖活性提高 2、生物自然進(jìn)化的局限性自然進(jìn)化過程: 突變自然選擇遺傳后代自然進(jìn)化結(jié)果: 生物多樣性 基因多樣性:為完成同一功能所表現(xiàn)出的 多個基因或同一個基因(同源性)局限性:周期長,效率低 ; 可控性差; 基因工程技術(shù)使得人類快速篩選工業(yè)菌種成為可能,在幾天和數(shù)月內(nèi)即可完成;還可以讓人類按照自己的意愿和需要改造菌種,甚至可以產(chǎn)生自然界中原本不存在的全新酶,以適應(yīng)大工業(yè)生產(chǎn)的需要。-哲理上,承認(rèn)了人類對蛋白質(zhì)的認(rèn)知的嚴(yán)重不足;-技術(shù)上,將大自然已經(jīng)實(shí)踐了幾億年的達(dá)爾文進(jìn)化原理應(yīng)用于試管中,以隨機(jī)突變與隨機(jī)雜交方法來改變蛋白質(zhì)的性能,再輔以篩選來獲得優(yōu)異的
3、變種。 (Frances Arnold, Caltech, 1993) 3、酶的定向進(jìn)化技術(shù)定義: 從一個或多個已經(jīng)存在的親本酶(天然或人為獲得)出發(fā),經(jīng)過基因突變和重組,構(gòu)建一個人工突變基因庫,通過篩選最終獲得預(yù)先期望具有某些特性的進(jìn)化酶; 所謂酶的體外定向進(jìn)化,又稱實(shí)驗分子進(jìn)化,屬于蛋白質(zhì)的非合理設(shè)計,它不需事先了解酶的空間結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制,通過人為地創(chuàng)造特殊的條件,模擬自然進(jìn)化機(jī)制(隨機(jī)突變、重組和自然選擇),在體外改造酶基因,并定向選擇出所需性質(zhì)的突變酶。 4、定向進(jìn)化的原理在待進(jìn)化酶基因的PCR擴(kuò)增反應(yīng)中,利用Taq DNA聚合酶不具有3-5校對功能的性質(zhì),配合適當(dāng)條件,以很低的比率向
4、目的基因中隨機(jī)引入突變,構(gòu)建突變庫,憑借定向的選擇方法,選出所需性質(zhì)的優(yōu)化酶(或蛋白質(zhì)),從而排除其他突變體。定向進(jìn)化的基本規(guī)則是“獲取你所篩選的突變體”。定向進(jìn)化=隨機(jī)突變+選擇。前者是人為引發(fā)的,后者雖相當(dāng)于環(huán)境,但只作用于突變后的分子群,起著選擇某一方向的進(jìn)化而排除其他方向突變的作用,整個進(jìn)化過程完全是在人為控制下進(jìn)行的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性活性有機(jī)溶液中的活性不同的底物的利用酸堿度蛋白質(zhì)的表達(dá)親和性 專一性1234性能代數(shù)達(dá)到目的隨機(jī)突變隨機(jī)雜交篩選目標(biāo)蛋白酶定向進(jìn)化的過程和應(yīng)用范圍二、酶定向進(jìn)化的應(yīng)用酶定向進(jìn)化的典型例子枯草桿菌蛋白酶E熱穩(wěn)定性的分子進(jìn)化內(nèi)酰胺酶的活性提高了32,000倍;半乳
5、糖苷酶的底物特異性提高了1000倍,且活性提高66倍;天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶對支鏈氧代氨基酸活性提高105倍且對纈氨酸的催化效率提高2.1106倍等。定向進(jìn)化的成功例子成功的例子Reetz等 (2019) 將脂酶水解對硝基-2-甲基癸酯的對映體選擇性提高了40倍You和Arnold (2019) 提高了枯草桿菌蛋白酶E的表達(dá)水平和在有機(jī)溶劑中的活性,使酶的總活力提高了500倍Zhao和Arnold(2019)在保持酶活力不變的條件下將枯草桿菌蛋白酶E的作用溫度提高了17度三、酶定向進(jìn)化的基本過程隨機(jī)突變 不同的定向進(jìn)化方法構(gòu)建突變基因文庫 載體的選擇,基因重組,組建基因文庫突變基因的篩選 平板篩選法,
6、熒光篩選法,表面展示法 1、定向進(jìn)化的方法無性進(jìn)化方法:易錯PCR法,盒式誘變有性進(jìn)化方法 1)DNA改組法(DNA Shuffling) 2)體外隨機(jī)重組法(RPR) 3)交錯延伸法(StEP)基因家族的同源重組外顯子的改組雜合進(jìn)化無性進(jìn)化:易錯PCR方法 無性進(jìn)化:易錯PCR方法 方法:向單一酶分子基因內(nèi)隨機(jī)引入突變(在PCR擴(kuò)增過程中調(diào)整反應(yīng)條件),制造突變酶庫以便篩選;特點(diǎn):遺傳變化僅發(fā)生在單一分子內(nèi)部,屬于無性進(jìn)化 改變4種底物的濃度比,或降低一種dNTP的量(降至5-10),加入dITP來代替被減少的dNTP. 緩沖液中另加0.5mmol/L Mn2+ 提高鎂離子濃度(常規(guī)PCR時
7、濃度為0.5-2.5mmol/L); 添加一定濃度的錳離子;易錯PCR方法實(shí)例 1993年,Chen and Arnold在非水相DMF中,定向進(jìn)化枯草桿菌蛋白酶E活力獲得成功,在60和85的DMF中,活力分別提高256和131倍;優(yōu)點(diǎn):操作簡便,隨機(jī)突變豐富;缺點(diǎn):正突變概率低,突變基因文庫較大,文庫篩選工作量大;適用范圍:適用于較小基因的定向進(jìn)化有性進(jìn)化:DNA改組方法(1994,Stemmer)有性進(jìn)化:DNA改組方法方法:從正突變基因庫中分離得到的DNA序列用酶隨機(jī)切割,得到的隨機(jī)片斷經(jīng)不加引物的多次PCR循環(huán),獲得全長基因,實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢突變的組合;特點(diǎn):遺傳變化僅發(fā)生在來自不同基因片斷之
8、間的 重組,所以稱為有性進(jìn)化;實(shí)例:對內(nèi)酰胺酶進(jìn)行DNA改組,3次循環(huán)得到的進(jìn) 化酶對抗生物素頭孢噻嗚抗性增加32000倍;優(yōu)點(diǎn):將已有的正突變基因結(jié)合,正突變效率高;缺點(diǎn):無引物PCR之前必須把DNase I去除干凈,以 防突變基因的被切割;有性進(jìn)化:體外隨機(jī)重組法(2019,Arnold)能以單鏈DNA為模板,以隨機(jī)序列引物進(jìn)行PCR反應(yīng),再除去模板,互為模板和引物進(jìn)行裝配和擴(kuò)增有性進(jìn)化:交錯延伸法(2019,Arnold)將常規(guī)的退火和延伸合并成一步,縮短反應(yīng)時間基因家族的同源重組方法:單一酶分子基因進(jìn)化過程中集中有利突變速度較慢,從自然存在的基因家族出發(fā),由于基因之間存在顯著差異,所得
9、突變庫體現(xiàn)了基因多樣性和增加了有利突變的概率;實(shí)例:Stemmer等從4種微生物中選擇編碼頭孢菌素的4個同源基因,分別進(jìn)行單獨(dú)進(jìn)化和同源重組,結(jié)果單獨(dú)進(jìn)化抗性提高8倍、而同源重組比其中2種微生物分別提高270和540倍; 國內(nèi)海藻糖的酶法制備即采用該方法;特點(diǎn):由于定向進(jìn)化的高效性,被認(rèn)為是DNA改組的發(fā)展方向;The Molecular Breeding directed molecular evolution process 對一組同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行比較,以一 定的標(biāo)準(zhǔn)程序計算出各氨基酸序列的共有序列; 人工合成同序基因后重組表達(dá)。 Martin Lehmann等(20002019
10、)把這種方法應(yīng)用在真菌植酸酶家族設(shè)計合成了同源植酸酶基因,并表達(dá)出具熱穩(wěn)定性的同源植酸酶。外顯子改組真核基因中外顯子編碼一個折疊結(jié)構(gòu)域,故內(nèi)含子(轉(zhuǎn)錄后被剪切剩下外顯子)間的重組,可使獨(dú)立外顯子組裝成編碼新蛋白質(zhì)的基因,可導(dǎo)致蛋白質(zhì)的快速進(jìn)化;在自然界中,不同分子的內(nèi)含子間發(fā)生同源重組,導(dǎo)致不同外顯子的結(jié)合,是產(chǎn)生新蛋白質(zhì)的有效途徑之一。與DNA改組不同,外顯子改組是靠同一種分子間內(nèi)含子的同源性帶動,而DNA改組不受任何限制,發(fā)生在整個基因片段上;雜合進(jìn)化把來自不同酶分子中的結(jié)構(gòu)單元或是整個酶分子進(jìn)行組合或交換,以產(chǎn)生具有所需性質(zhì)的酶雜合體。纖維素酶定向進(jìn)化2.基因文庫的構(gòu)建定義:通過DNA重
11、組技術(shù)將隨機(jī)突變獲得的各種突變基因與適宜載體進(jìn)行重組,獲得重組載體;再通過細(xì)胞轉(zhuǎn)化等方法將重組載體轉(zhuǎn)入合適的細(xì)胞或進(jìn)行體外包裝成為有感染活性的重組噬菌體,形成突變基因文庫。載體的選擇:質(zhì)粒載體 噬菌體DNA載體: 噬菌體、M13噬菌體 黏粒載體:人工構(gòu)建的載體 噬菌粒載體基因重組: 體外通過DNA連接酶的作用,將基因與載體DNA連接在一起形成重組DNA的過程。重組方法:黏性末端連接 平頭末端連接 修飾末端連接組裝突變基因文庫 將重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞或包裝成為有感染活性的重組噬菌體的過程。組裝方法:重組質(zhì)粒載體-轉(zhuǎn)化(原核和真核) 重組噬菌體載體-包裝 3、基因突變庫的篩選方法目標(biāo) 根據(jù)定向進(jìn)
12、化要求,在一定的環(huán)境要求下進(jìn)行篩選,從突變基因文庫中得到所需的突變基因。難點(diǎn) 突變庫容量大,一般達(dá)到106,工作量巨大關(guān)鍵 高通量篩選:通量大,效率高方法 平板篩選法,熒光篩選法,噬菌體表面展示法,細(xì)胞表面展示法平板篩選方法依據(jù)細(xì)胞生長情況篩選熱穩(wěn)定性:溫度梯度和高溫環(huán)境抗生素耐受性:抗生素濃度梯度pH穩(wěn)定性: pH梯度極端環(huán)境:高鹽、低溫、高濃毒物質(zhì)平板篩選方法依據(jù)顏色變化篩選大腸桿菌-半乳糖苷酶基因顯色:噬菌體DNA載體(藍(lán)色)反應(yīng)產(chǎn)物顯色:磷酸酯酶水解硝基酚磷酸生成黃色硝基酚脂肪酶篩選海因酶篩選平板篩選方法依據(jù)透明圈大小篩選淀粉酶的進(jìn)化:淀粉平板培養(yǎng)基豆鼓纖溶酶的進(jìn)化:血纖維蛋白培養(yǎng)基熒
13、光篩選方法利用自身熒光激發(fā)特性 生成產(chǎn)物本身是具有熒光激發(fā)特性的物質(zhì)利用熒光報告基因辣根過氧化合物酶和單加氧酶的融合基因: 原理:萘萘酚醌類化合物(能激發(fā)熒光)綠色熒光蛋白基因:獲2019年諾貝爾化學(xué)獎 2019年諾貝爾化學(xué)獎介紹獲獎 2019年度諾貝爾化學(xué)獎授予日本科學(xué)家下村修、美國科學(xué)家馬丁沙爾菲,以及美國華裔科學(xué)家錢永健。他們?nèi)艘驗樵诰G色熒光蛋白()研究和應(yīng)用方面做出的突出貢獻(xiàn)將各分得2019年度13的諾貝爾化學(xué)獎獎金。 2019年諾貝爾化學(xué)獎介紹評論 生物學(xué)有些現(xiàn)象只能在打碎細(xì)胞以后才能做,所以實(shí)際上是從“死物”上來推測生物的情況。而下村修、錢永健和馬丁沙爾菲發(fā)明的用熒光分子標(biāo)記其他
14、分子的方法,使科學(xué)家們能在活細(xì)胞、活生物上直接觀察一些生物現(xiàn)象。所以,可以說是把一些“死物學(xué)”變成了真正的“生物學(xué) (北大饒毅)綠熒光水母通過體內(nèi)綠色熒光蛋白發(fā)光科學(xué)家在線形蟲體內(nèi)植入綠色熒光蛋白質(zhì)綠色熒光蛋白的應(yīng)用分子標(biāo)記:GFP標(biāo)記的微管結(jié)構(gòu)綠色熒光蛋白的應(yīng)用 分子標(biāo)記: FISH分析菌株(a)未加探針;(b)DAPI染色(c)-探針雜交(d)Msint-1268探針雜交菌株Y1;(e)Msint-1268探針雜交M. trichosporium OB3b綠色熒光蛋白的應(yīng)用藥物篩選綠色熒光蛋白的應(yīng)用融合表達(dá):線粒體中表達(dá)的GFP綠色熒光蛋白的應(yīng)用生物傳感器: GFP在植物研究中的應(yīng)用噬菌體
15、表面展示法 內(nèi)涵 利用絲狀噬菌體的外膜結(jié)構(gòu)蛋白與某些特定的外源蛋白或多肽分子形成穩(wěn)定的復(fù)合物,使外源蛋白或多肽富集在噬菌體表面的一種分子展示技術(shù) 特點(diǎn) 有效性高,是前景廣闊的篩選方法噬菌體顯示篩選模式噬菌體顯示的幾種類型M13噬菌體pIII和pVIII的顯示酵母細(xì)胞表面展示法 通過錨定在酵母細(xì)胞表面的特點(diǎn)蛋白質(zhì)與某些外源蛋白質(zhì)或多肽形成穩(wěn)定的化合物,使外源蛋白或多肽富集在酵母細(xì)胞表面的一種分子展示技術(shù)。核糖體顯示技術(shù)RNA-蛋白質(zhì)融合技術(shù)RNA-蛋白質(zhì)的融合寡霉素與核苷酸的連接Myc ds-DNA的富集實(shí)例:天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的熱穩(wěn)定性的定向進(jìn)化高通量篩選方法的建立生物信息學(xué)技術(shù)手段的建立天冬氨酸
16、轉(zhuǎn)氨酶熱穩(wěn)定性的改造研究內(nèi)容及執(zhí)行情況 高通量篩選方法的建立 基于酶聯(lián)免疫分析方法,選用醫(yī)用檢測試劑盒作為檢測試劑,建立了快速高效的酶活性檢測方法,結(jié)合使用96孔酶標(biāo)板,形成了酶的高通量篩選方法。 建立了改進(jìn)的可高通量操作的質(zhì)??焖贆z測方法,改進(jìn)后的質(zhì)??鞕z工作量為原方法的1/3左右,可用于高通量篩選和鑒定所構(gòu)建的基因工程菌。生物催化的數(shù)據(jù)整合和信息分析峰值運(yùn)算速度達(dá)3000億次/秒的集群系統(tǒng) 基因表達(dá) 蛋白質(zhì)表達(dá) 蛋白質(zhì)-DNA相互作用 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用 基因和其他功能相互作用 蛋白質(zhì)定位 網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié) 功能注解 生物信息學(xué)技術(shù)手段的建立天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶熱穩(wěn)定性改造天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的作用酶法制備L苯丙氨酸的關(guān)鍵酶 ; L-苯丙氨酸的主要用途 氨基酸輸液 L-苯丙氨酸是人體八大必須氨基酸之一,是氨基酸輸液的主要成份; 甜味劑的合成 由L-苯丙氨酸和L天冬氨酸合成的阿斯巴甜是二十世紀(jì)九十年代以來最受關(guān)注的非糖型肽類甜味劑,形成了對L-苯丙氨酸的強(qiáng)烈需求; 肉桂酸酶法苯丙酮酸酶法結(jié)構(gòu)分析軟件Rasmol 分析酶的三維結(jié)構(gòu)序列分析軟件Clustal W分析酶的一維結(jié)構(gòu)利用生物信息學(xué)技術(shù)進(jìn)行酶結(jié)構(gòu)分析應(yīng)用DeepView(蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件)確立天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的熱穩(wěn)定性有
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