藥物作用靶點課件(PPT 67頁)

1、生命科學(xué)研究新進(jìn)展系列講座藥物作用靶點與天然藥物篩選李海航, Ph.D華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院li_haihang.第1頁，共67頁。內(nèi)容一. 前言(我國藥物行業(yè)存在的問題簡介)二. 藥物靶,靶點或靶標(biāo)三. 藥物靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)四. 基于靶標(biāo)的藥物設(shè)計五. 靶點藥物開發(fā)概況六. 基于靶標(biāo)的天然藥物七. 多靶點藥物的開發(fā)八. 重要疾病的靶點藥物九. 天然藥物提取分離與靶點藥物篩選研究.第2頁，共67頁。我國藥物研究與開發(fā)生命科學(xué)各領(lǐng)域中最薄弱,最落后,面臨危機西藥： 到目前為止只有開發(fā)了半個(青蒿素)或一個半自主藥物中醫(yī)藥： 最古老，也最落后缺乏系統(tǒng)的藥物研究與開發(fā)體系急功近利,投機取巧,夸大吹噓等成

2、風(fēng), ”研發(fā)”了大量無用新藥,無用新藥批文中國工程院醫(yī)藥衛(wèi)生學(xué)部院士秦伯益: “國家投入大幅度增長、新藥苗頭不斷涌現(xiàn),可成果寥寥無幾,有國際影響的創(chuàng)新藥一個都沒有?！?49年以來,我國自主研發(fā)、有國際影響的“新藥”僅兩個,50年代合成的二巰基丁二酸鈉和60年代開發(fā)的青蒿素。60年代至今,無一原創(chuàng)藥誕生。我國每年都有上百新藥被注冊,而美國、英國一年難出幾例新藥 .第3頁，共67頁。中國工程院醫(yī)藥衛(wèi)生學(xué)部院士秦伯益原創(chuàng)藥研發(fā)中存在三大誤區(qū) 誤區(qū)一，對基因組藥物學(xué)期盼過早。 盲目追求時髦的新概念2000年自然雜志對人類基因組研究現(xiàn)狀與展望的評述 第一階段: 2000年測定全部DNA序列； 第二階段:

3、 2010年識別所有基因；第三階段: 2050年確定所有基因功能； 第四階段: 2100年確定基因變異與疾病關(guān)系”不少所謂專家學(xué)者“正根據(jù)基因變異設(shè)計藥物”,短期內(nèi)根本不可能.誤區(qū)二，對中醫(yī)藥開發(fā)潛力指望太高。 死守傳統(tǒng)和古老的概念“中醫(yī)藥發(fā)展靠不斷研究，而不是過頭的輿論宣傳”。 “中華民族的繁衍生息靠的是中醫(yī)藥”、“西醫(yī)治病、中醫(yī)治本”、“西藥有毒副作用，中藥沒有毒副作用”、“西醫(yī)對疑難雜癥沒有辦法，中醫(yī)有辦法”。過高指望中醫(yī)不實際。“不少檢查、治療手段需要西醫(yī)，中醫(yī)不能相比?！?誤區(qū)三，傳統(tǒng)的新藥研發(fā)途徑過時了。傳統(tǒng)新藥研發(fā)途徑包括: 經(jīng)驗積累、偶然機遇、藥物普篩、綜合篩選、天然物提取、定

4、向合成、代謝與藥理研究、毒副作用、老藥新用等?，F(xiàn)在新藥研發(fā)的團隊都想“一口氣吃個胖娃娃”、“跨越發(fā)展”,不符合發(fā)展規(guī)律。很多研究人員都沒有“蹲下去找靶點調(diào)研。 .第4頁，共67頁。我國藥物創(chuàng)新和研發(fā)存在的問題中和藥業(yè)1研發(fā)經(jīng)費不足。全國藥物研發(fā)總投入少于美國的輝瑞公司。2技術(shù)水平有限,研發(fā)團隊建設(shè)不力。藥物行業(yè)是技術(shù)密集型行業(yè)。沒有幾個企業(yè)真正投入技術(shù)力量研發(fā)新藥,無研發(fā)部門或研發(fā)部門轉(zhuǎn)行。國外藥企研發(fā)人員占從業(yè)員30%,我國不到4%,且大多從事技術(shù)型改造。3主流研發(fā)機構(gòu)與藥企合作不成熟。研究機構(gòu)重文章,企業(yè)重市場。 4. 宏觀政策影響大,缺乏總體規(guī)劃,高稅收和逐年降價使企業(yè)瀕臨停產(chǎn)。 5.

5、知識產(chǎn)權(quán)問題日益突出。外國藥企紛紛加大在中國的知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)。在國外上市的新藥中幾乎不可能有新藥供國內(nèi)藥企仿制。美國、日本、歐盟批準(zhǔn)的新藥在化合物專利、制備工藝專利、適應(yīng)癥專利、用法用量專利都獲得相應(yīng)的保護(hù)。 .第5頁，共67頁。我國藥品市場現(xiàn)狀及存在的問題 我國醫(yī)藥業(yè)年均增長17%,在36個行業(yè)中排第18-20位,總值占GDP的3.2%.1）制售假劣藥行為屢禁不止。生產(chǎn)和銷售假劣藥的范圍和規(guī)模不斷擴大。2）藥品虛假廣告鋪天蓋地。夸大療效被藥企奉為營銷寶典,違法率達(dá)95%。3）藥品購銷不規(guī)范,商業(yè)賄賂嚴(yán)重,回扣風(fēng)行。行賄受賄已是公開的秘密。藥品在流通過程中價格翻十幾倍,造成藥價過高。研發(fā)好藥不如

6、搞定幾家醫(yī)院!4）無證經(jīng)營和超范圍經(jīng)營, 買賣、出租、出借許可證等屢禁不止。 5）零售藥店和生產(chǎn)企業(yè)不規(guī)范。80%以上購藥者會向藥店銷售員咨詢,大多數(shù)最后采納其意見選藥。但藥店銷售人員70%以上未經(jīng)正規(guī)醫(yī)藥知識培訓(xùn)。銷售員為“廠家提成”而向顧客推薦高價藥。 一些藥企取得GMP等認(rèn)證后,為節(jié)約成本和迅速獲利而降低生產(chǎn)條件和管理。.第6頁，共67頁。藥物研究與開發(fā)是我國最有發(fā)展?jié)摿Φ男袠I(yè)之一.第7頁，共67頁。藥物開發(fā)途徑的變化傳統(tǒng)的藥物篩選途徑化合物 組織,細(xì)胞,動物 分子(作用靶) 人體現(xiàn)代藥物篩選途徑分子(作用靶) 化合物 細(xì)胞,組織,動物,人體.第8頁，共67頁。靶點藥物與靶向治療手術(shù)靶向

7、給藥: 穿刺給藥,手術(shù)局部給藥,臟器動脈/血管給藥, 靶點/標(biāo)藥物(主動靶向) 靶向給藥(被動靶向)局部給藥: 膏藥,局部用散劑,眼膏,眼藥水,宮內(nèi)給藥,栓劑,腸溶劑,長效緩釋劑或前體藥物: 微球,微囊, 脂質(zhì)體,磁性微球, 細(xì)胞載體, 藥物-大分子/配體/單克隆抗體結(jié)合物我國研究: 脂質(zhì)體, 藥物-糖蛋白/單克隆抗體結(jié)合物, 蛋白質(zhì)等各種天然與合成物相結(jié)合物的微球, 肝/腦靶向前體藥等存在的問題: 工藝復(fù)雜,載藥量少, 穩(wěn)定性差, 制劑, 體內(nèi)代謝, 評價與標(biāo)準(zhǔn), 體內(nèi)生理作用等. 大量生產(chǎn)尚有不少問題. 藥物與病變細(xì)胞特定部位或特定分子結(jié)合來實現(xiàn)藥物的作用。大多是與特定細(xì)胞或蛋白有特異反應(yīng)

8、的分子或分子基團,如抗體、單抗、蛋白受體、激素類等。.第9頁，共67頁。二. 藥靶 (Drug Targets)1 藥靶的定義: 存在于組織細(xì)胞內(nèi), 與疾病發(fā)生有因果關(guān)系或參與疾病發(fā)展, 與藥物相互作用,并可通過藥物對其進(jìn)行調(diào)節(jié)而實現(xiàn)治療目的的特定生物分子2 藥靶的條件: 與疾病相關(guān), 有適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)特性和親和力結(jié)合小分子物,在病變細(xì)胞或組織中表達(dá),在細(xì)胞培養(yǎng)體系中可通過調(diào)節(jié)靶標(biāo)活性產(chǎn)生特定效應(yīng),在動物模型中再現(xiàn),藥物在人體內(nèi)有效。3. 藥靶的化學(xué)成分: 絕大多數(shù)(98%以上)為蛋白質(zhì)。50%以上屬G蛋白耦聯(lián)受體,絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸蛋白激酶,鋅金屬肽酶,絲氨酸蛋白酶,核激素受體及磷酸二酯酶等

9、6個家族。4. 藥靶的意義: 藥物發(fā)現(xiàn)從依賴動物篩選逐漸轉(zhuǎn)變到“一病一靶”。是高通量藥物篩選及其模型建立的基礎(chǔ). 5. 最成的例: 膽固醇合成抑制劑 HMG(3-羥基-3甲基戊二酸單酰)輔酶A還原酶為靶點的選擇性抑制劑, 已有系列他汀類降脂藥物,全球銷售量最大藥,最有效降膽固醇藥. .第10頁，共67頁。三. 藥靶的發(fā)現(xiàn) 靶點的發(fā)現(xiàn)主要通過基因, 蛋白質(zhì)和藥物三個方面. 1. 基因水平上的靶點發(fā)現(xiàn)1)人類遺傳學(xué),生物信息學(xué),表達(dá)圖譜,代謝途徑分析,基因芯片,mRNA差異顯示,消減雜交等,結(jié)合表型變化發(fā)現(xiàn)大量候選靶標(biāo). (重要和關(guān)鍵基因)2) 宿主和病原菌或正常細(xì)胞與病理細(xì)胞之間的基因差異表達(dá)和

10、基因序列分析,找出疾病相關(guān)基因. 3) 疾病相關(guān)基因(靶基因)功能分析,包括基因敲除,過量表達(dá), RNA 干擾,反義mRNA 和核酶抑制及計算機模擬基因產(chǎn)物結(jié)構(gòu)和功能分析,確認(rèn)藥物靶點. .第11頁，共67頁。2. 以蛋白質(zhì)組學(xué)為基礎(chǔ)發(fā)現(xiàn)藥物靶標(biāo)人體內(nèi)可能的藥靶約300015000個,目前發(fā)現(xiàn)的不到500個,多數(shù)藥靶是蛋白質(zhì),如酶、受體、激素。1) 差異蛋白質(zhì): 差異蛋白組學(xué)法比較疾病和正常狀態(tài)蛋白表達(dá)差異,找可能藥靶.常用技術(shù): 蛋白質(zhì)芯片,二維凝膠電泳,同位素親和標(biāo)簽,雙向熒光差異凝膠電泳等技術(shù)及它們和質(zhì)譜鑒定的結(jié)合。應(yīng)用較多的: 二維凝膠電泳和質(zhì)譜分析。急性淋巴細(xì)胞白血病中的高表達(dá)多肽O

11、p18有磷酸化和非磷酸化兩種形式,抑制Op18及其表達(dá)或磷酸化能有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖,有望以O(shè)p18為靶開發(fā)藥物。2) 蛋白質(zhì)相互作用: 蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用。常用方法: 有酵母雙雜交,噬菌體展示,表面等離子共振,串聯(lián)親和純化和雙分子熒光互補等。酵母雙雜交是發(fā)現(xiàn)藥靶的重要途徑。通過報告基因表達(dá)產(chǎn)物可敏感地檢測蛋白質(zhì)之間相互作用路徑及藥物干擾阻止其相互作用以達(dá)到治療疾病的目的。.第12頁，共67頁。3. 藥物分子為探針發(fā)現(xiàn)藥物靶標(biāo)1) “藥釣靶”與“靶釣藥”: 生物分子相互作用分析。用藥物單分子作為探針,跟蹤監(jiān)測它與蛋白質(zhì)分子之間的相互作用來發(fā)現(xiàn)藥靶。 配體垂釣: 將藥物分子探針固定在傳感器芯

12、片表面,將與之相互作用的分子(如配體蛋白質(zhì))溶液流過芯片表面,檢測溶液中分子與芯片表面分子結(jié)合和解離的整個過程,稱作“配體垂釣” 。親和層析: 固定藥物分子篩選靶點,或固定靶點來篩選藥物分子。 2) 計算機模擬: 以藥物為探針,計算機模擬藥物與蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)及其相互作用,找出能與其特定結(jié)合的蛋白或潛在藥靶。3) 藥物作用前后基因和蛋白質(zhì)表達(dá)的改變,找出可能的藥靶。如: 用基因芯片研究苦參堿誘導(dǎo)白血病K562細(xì)胞基因表達(dá)譜,發(fā)現(xiàn)CCNB1, cyclinD1,PCNA等基因表達(dá)顯著改變,可能是苦參堿作用靶點。.第13頁，共67頁。四. 基于靶標(biāo)的藥物設(shè)計利用配體-靶標(biāo)復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)信息設(shè)計新藥,

13、基本過程: 確定藥物作用靶標(biāo)(如蛋白質(zhì)、核酸等) ; 對靶標(biāo)進(jìn)行分離純化; 確定靶標(biāo)三維結(jié)構(gòu),提出系列假定配體與靶分子復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu); 依據(jù)這些結(jié)構(gòu)信息,利用相關(guān)計算機程序進(jìn)行配體分子設(shè)計,模擬出最佳配體結(jié)構(gòu)模型; 合成模擬結(jié)構(gòu)物,測試活性。若滿意可進(jìn)入前臨床實驗. 重復(fù)以上過程,直至滿意為止.需要的條件: X射線衍射和核磁共振(NMR)等結(jié)構(gòu)研究手段,研究靶蛋白分子結(jié)構(gòu),計算機輔助的靶蛋白結(jié)構(gòu)模型建立和藥物設(shè)計。如治療艾滋病的安瑞那韋(amprenavir, Agenerase) 和奈非那韋(nelfinavir, viracept) 就是用HIV蛋白酶的晶體結(jié)構(gòu)開發(fā)的藥物. .第14頁，

14、共67頁。藥物研發(fā)需要生物學(xué),化學(xué),電腦物理,儀器分析等多個領(lǐng)域合作.第15頁，共67頁。五. 靶點藥物開發(fā)概況現(xiàn)代藥物開發(fā)是基于特定靶尋找先導(dǎo)化合物,進(jìn)而篩選候選藥物的過程。人類基因組研究結(jié)果預(yù)測: 有600種小分子靶點,1800多蛋白質(zhì)靶點,及2100種基因治療和siRNA治療靶點。失敗教訓(xùn): 近20年對高選擇性靶點的集中研發(fā),候選新藥經(jīng)臨床試驗后成功上市的比例不但沒有增加，反而不斷下降。新靶標(biāo)藥物研發(fā)的失敗率不斷增加。對藥物研發(fā)思路產(chǎn)生了極大的挑戰(zhàn).FDA 1989-2000 年批準(zhǔn)的361個新分子實體藥物,僅6%是基于新藥物靶點。因此,制藥公司紛紛調(diào)整研發(fā)模式: 新靶標(biāo)藥物研發(fā),已有靶

15、標(biāo)藥物研發(fā),me-too類改良藥物以及部分生物仿制藥研發(fā)等。經(jīng)典“可藥性”靶點：酶、G-蛋白偶聯(lián)受體和核激素受體等。這些靶點的藥理機制較明確,開發(fā)經(jīng)驗較成熟,成功率高。有開發(fā)潛力的靶: 同源序列少(不超過5個),參與的調(diào)節(jié)路徑少(不超過2個),分布的主要組織少(不超過2個),靶標(biāo)的開發(fā)潛力/前景較好。.第16頁，共67頁。1.上市藥物的靶標(biāo)數(shù)量Drews等(1997) 粗略推定為483個分子藥物靶標(biāo)。Hopkins 和 Groom (2002) 根據(jù)藥物起效的5條原則,目前藥物僅通過120個靶標(biāo)起主要作用。Golden (2003) : 所有上市藥物對應(yīng)了273種蛋白。Imming (2006

16、) 等對藥物靶標(biāo)作了明確界定,認(rèn)為藥物靶標(biāo)是一種能夠與化學(xué)試劑特異結(jié)合并產(chǎn)生臨床療效的分子結(jié)構(gòu)。不包括藥理學(xué)和生物化學(xué)研究工具以及相關(guān)技術(shù)。得出的結(jié)論：目前的分子藥物靶點數(shù)目為218個。Overington 等(2006)提出有價值的評估: 藥物數(shù)量減至1357種。所有藥物通過324個靶標(biāo)起作用,其中266個為人類基因衍生的,其余為病原體靶標(biāo)。小分子藥物作用于248種蛋白,其中207個靶標(biāo)由人體基因組編碼;口服小分子藥物靶標(biāo)227個,其中186個為人類基因靶標(biāo)。Overington JP, Al-Lazikan IB, Hopkinsal. How many drug targets are

17、there? Nat Rev Drug Discov, 2006, 5(12) : 993-996.第17頁，共67頁。2. 上市藥物靶點的類別生物化學(xué)分類: 上市小分子和生化藥靶點, 50%以上屬4 個關(guān)鍵生化類別: G-蛋白偶聯(lián)受體(26.8%),核受體(13%),配體門控性離子通道(7.9%)及電壓門控離子通道(5.5%) 。其他包括青霉素結(jié)合蛋白,髓過氧化酶,神經(jīng)遞質(zhì),DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶,纖維結(jié)合蛋白,細(xì)胞色素P450等。生物結(jié)構(gòu)位點: 細(xì)胞膜表面(60%),細(xì)胞質(zhì)(16%),細(xì)胞核(10%),胞外分泌(8%),線粒體(3%),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(2%),過氧化酶體(1%)。約1/3的靶點是膜本身疾

18、病領(lǐng)域分布: 268個上市藥物靶點,依次是腫瘤,傳染病和寄生蟲病,神經(jīng)系統(tǒng),感覺器官病及循環(huán)系統(tǒng)疾病等。這些疾病都有代表性靶點藥物化學(xué)分類: 腫瘤和抗感染領(lǐng)域的主要藥物靶點是酶。中樞神經(jīng)系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)疾病通常靶向G-蛋白偶聯(lián)受體、離子通道或載體等。不同化學(xué)特征藥物所靶向的靶點: 合成藥物通常靶向G-蛋白偶聯(lián)受體、酶、離子通道和載體等。天然產(chǎn)物主要靶向N-末端重復(fù)序列, 而生物制品(抗體或重組制劑)主要靶向其他膜受體。.第18頁，共67頁。Distribution of Targets by Biochemical Criteria .第19頁，共67頁。Distribution of Targ

19、ets in Therapeutic Areas .第20頁，共67頁。六. 多靶點藥物 多靶點藥物定義: 同時作用于某一疾病相關(guān)或病原體的多個分子靶,具有多種藥理活性。比單靶藥物的療效顯著、作用全面、副作用少。原因: 疾病起因多因素性: 單一靶基因異常引起的疾病只占少數(shù),多數(shù)疾病由多基因或多靶點引起,如心血管病,腫瘤及神經(jīng)退行性疾病等,糖尿病等.信號傳導(dǎo)途徑的多樣化: 如癌癥等,有多條信號傳遞途徑,并有互通性。 平衡機制與旁路系統(tǒng): 1) 同一靶作用多樣,過分抑制導(dǎo)致嚴(yán)重毒副作用； 2) 代謝，信號或調(diào)控途徑多樣性,抑制一條途徑會激活另外的途徑/旁路;3) 疾病的適應(yīng)/耐藥性,如病毒的突變等

20、. 理論基礎(chǔ):按照拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)模型理論: 一個系統(tǒng)中對35 個因素(相當(dāng)于藥靶) 的部分抑制可以達(dá)到對單一最重要因素的完全抑制。疾病網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)研究: 單獨對某一靶點調(diào)節(jié),在復(fù)雜疾病治療中有局限性。多靶點藥物可同時作用于疾病網(wǎng)絡(luò)中多個靶點,對各靶點產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng),使總效應(yīng)大于各單效應(yīng)之和,達(dá)到最佳治療效果.第21頁，共67頁。多靶點藥物的分類及作用方式按藥物組分不同分三種形式:1）多種藥聯(lián)合用藥 (Multidrug combination): 最為常見,為抗艾滋病和腫瘤主要策略。缺點是所含藥物彼此易發(fā)生相互作用而產(chǎn)生不良反應(yīng).2）多組分藥物 (Multicomponent drug): 藥劑中含多種活

21、性組分,效果較好的聯(lián)合用藥被制成多組分藥,如抗艾滋病藥Atripla,抗哮喘藥Advair 和丙肝藥Rebetron。3）單組分藥同時選擇性作用于多個靶點: 即嚴(yán)格意義上的多靶點藥物 (multitarget drug).優(yōu)化一個多靶點藥使之同時產(chǎn)生多靶點選擇性而不是非選擇性難度很大. 按靶間關(guān)系的作用方式分三類: 影響不同靶而產(chǎn)生組合作用: 各靶存在于特定組織、細(xì)胞或細(xì)胞間液中的相同或不同部位,代謝或信號通路; 藥物對第一個靶點的作用可對第二個靶點產(chǎn)生影響: 如改變藥物代謝、抑制外排泵或阻斷其他抗性機制; 作用于某一靶分子或分子復(fù)合物上的不同位點發(fā)揮聯(lián)合作用進(jìn)而增強藥理活性. .第22頁，共

22、67頁。多靶點藥物的發(fā)現(xiàn)策略和篩選模型高通量靶點篩選使用非細(xì)胞體系,不能模擬完整細(xì)胞的生物學(xué)特性, 因此不能用于多靶點藥物篩選。1) 基于細(xì)胞表型分析: 單細(xì)胞水平: 高效性,含有疾病相關(guān)的代謝或信號通路, 增加了潛在協(xié)同作用的發(fā)現(xiàn), 廣泛用于多靶點藥物研究。 多細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)體系: 組織,器官 或多種不同類型的細(xì)胞. 如混合培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞篩選抗炎藥。 模式生物: 整體的生物體內(nèi)篩選. 2) 綜合性作用的聯(lián)合篩選: 聯(lián)合用藥時,一種組份誘導(dǎo)對另一種組份的敏感性. 3) 配伍(比例)分析: 比較聯(lián)合用藥和組分單獨用藥時活性差別, 優(yōu)化各組分用量。如連續(xù)稀釋某一組分的配伍比例進(jìn)行劑量-效應(yīng)分析,找出

23、協(xié)同效應(yīng). .第23頁，共67頁。多靶點藥物設(shè)計 主要策略: 平衡藥物對多個靶點之間的效應(yīng)。 1) 連接配體: 用接頭將獨立的藥效基團連接起來. 但產(chǎn)生的多靶點分子往往較大,很難口服給藥和吸收。 2) 重疊配體: 各藥效團間重疊或高度整合, 產(chǎn)生的分子量較小。如: 基于血管緊張素1受體的配體和內(nèi)皮素A受體的配體所共有的聯(lián)芳核所設(shè)計的重疊配體有更好的抗高血壓活性。 3) 改善疾病耐藥性: 艾滋病靶點逆轉(zhuǎn)錄酶的一個氨基酸突變就可產(chǎn)生耐藥性.設(shè)計可對野生型和耐藥性突變體逆轉(zhuǎn)錄酶均有抑制作用的化合物。.第24頁，共67頁。七. 基于分子靶點的天然藥物開發(fā)優(yōu)勢: 1) 選材多樣性是新藥篩選關(guān)鍵,植物含天

24、然物種類多是實驗室無法完成的。2) 中醫(yī)強調(diào)整體性和協(xié)調(diào)性,中藥活性組分作用于多靶點共同發(fā)揮療效, 屬多靶點藥物治療。3) 中藥復(fù)方原料和成分復(fù)雜,用于多個靶點時比合成藥物有天然優(yōu)勢。4) 有些中藥單體通過多靶點起作用。如姜黃素有強抗腫瘤活性和高安全性,為最受關(guān)注的多靶點藥之一。它可影響多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管新生,臨床藥效評價進(jìn)行中. 問題: 1) 與合成藥比,中藥作用機制更復(fù)雜,尋找中藥靶點進(jìn)展困難。傳統(tǒng)的板藍(lán)根的作用靶點至今沒找到。2) 有專家認(rèn)為, 很多植物藥找不到靶點,可是作用于小分子無機鹽而被忽視.小分子靶點研究技術(shù)少,但可能給開發(fā)植物藥類靶點藥物打開一

25、扇大門。.第25頁，共67頁。八.重要疾病的靶點藥物靶點藥物應(yīng)用最多的是腫瘤。其次是艾滋病HIV, 阿爾茨海默病(Alzheimer),肝炎,前列腺增生及糖尿病等.問題: 抗癌藥多直接攻擊DNA或其合成,對腫瘤細(xì)胞缺乏特異性.針對特異靶標(biāo)分子研制特異性藥物是今后研發(fā)的方向。.第26頁，共67頁。1. 腫瘤分子靶向藥物1997 年美國FDA 批準(zhǔn)首個單抗藥物利妥昔單抗用于NHL.已有近20種分子靶向藥物上市,在研藥物100 余種。大致分以下幾類: 1) 大分子單克隆抗體. 如: 表皮生長因子(EGF)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)與腫瘤增殖,生長,浸潤,轉(zhuǎn)移等關(guān)系密切。2) 小分子化合物. 靶點

26、為代謝關(guān)鍵酶或酪氨酸激酶。3) 多靶點作用藥物。索拉非尼(05年上市): 口服小分子雙通道多激酶抑制劑,靶向腫瘤細(xì)胞及血管上的酪氨酸激酶。拉帕替尼(07年上市): 口服小分子酪氨酸激酶抑制劑,對EGFR雙重抑制。.第27頁，共67頁。重要的腫瘤藥物靶點1. 信號傳導(dǎo): 如酪氨酸激酶. 打仗時不打郵遞員2. 腫瘤生長因子: 如表皮和血管內(nèi)皮生長因子及其受體. 3. 代謝酶類: 如核酸代謝, 激素代謝,能量代謝等相關(guān)酶. 1) 核酸代謝相關(guān)酶類. 復(fù)制與(逆)轉(zhuǎn)錄及核苷酸代謝等酶. 拓樸異構(gòu)酶(DNA topoisomerase I): 參與DNA 復(fù)制。其抑制劑阻止復(fù)制和鏈重新組裝,引起DNA

27、雙鏈斷裂,腫瘤細(xì)胞死亡。靶點藥有喜樹堿、羥基喜樹堿、依立替康、拓?fù)涮婵怠⒇惵逄婵档?。核糖核苷酸還原酶: 四種NDP還原成dNDP,DNA合成與修復(fù),雙縮尿.腺苷脫氨酶: 維持腺苷水平,抗白血病,提高腺苷類藥物作用. 2) 激素代謝酶類. 芳香氨酶(Aromatase): 細(xì)胞色素P450與黃素蛋白組成的膜結(jié)合復(fù)合酶,為雄激素合成所必須的,也催化雄激素向雌激素轉(zhuǎn)化,是雌激素合成限速酶。乳癌治療的兩種主要選擇: (1) 雌激素及其受體拮抗劑; (2) 抑制芳香氨酶活性而切斷雌激素合成。.第28頁，共67頁。.第29頁，共67頁。.第30頁，共67頁。乳腺癌的治療1. 針對激素內(nèi)分泌治療: 絕大多數(shù)

28、乳腺癌是激素依賴性腫瘤。 1). 抗雌激素類: 三苯氧胺(競爭結(jié)合雌激素受體), 氟維司群(阻滯雌激素受體). 2). 芳香化酶抑制劑: 抑制雄激素向雌激素轉(zhuǎn)化,如CYP19已成功應(yīng)用.3). 孕激素類(多靶點): 抑制促黃體生成素和雌激素產(chǎn)生;與孕激素受體競爭結(jié)合4). 促性腺激素釋放激素類似物: 減少雌激素產(chǎn)生,常用藥有g(shù)oserelin等。2. 針對癌相關(guān)基因及其產(chǎn)物的靶分子治療1) 腫瘤生長因子及其受體靶向: 生長因子及受體的單抗和酪氨酸激酶抑制劑 2) 腫瘤血管生成分子靶向: Avastin單抗,抑血管生成的Endostar和Thalidomide3. 其它靶分子治療: 法尼基轉(zhuǎn)移酶

29、抑制劑阻斷Ras介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)多靶點的小分子酪氨酸激酶抑制劑sunitinib抑制磷酸肌醇-3-激酶和癌細(xì)胞生長的雷帕霉素胰島素樣生長因子-1(IGF-1)及其受體或磷酸化的拮抗和抑制劑凋亡抑制物的抑制劑與腫瘤侵襲有關(guān)的磷脂依賴的絲氨酸/蘇氨酸酶PKC-抑制劑.第31頁，共67頁。良性前列腺增生(BPH)藥物作用靶點老年男性常見病臨床藥物主要針對2個較成熟靶點:1) 5-還原酶: 前列腺是雄激素依賴器官,雄激素代謝異?？蓪?dǎo)致BPH。作用最強的雄激素二氫睪酮由該酶催化而成。該酶為治療BPH 的關(guān)鍵靶點. 已有數(shù)種酶抑制劑用于BPH治療。2) 腎上腺素受體: 前列腺增生引起膀胱出口梗阻,導(dǎo)致膀胱甚

30、至腎功能損害。其治療原則是先盡快減輕或解除梗阻,保護(hù)膀胱和腎功能。其抑制劑為治療BPH及下尿路癥首選藥。新靶點: 1). 磷酸二酯酶5: 特異性裂解胞內(nèi)第二信使cGMP。最初是治療心絞痛和高血壓的靶點藥,其抑制劑后來成為治療男性功能障礙一線藥;也能治療前列腺增生伴下尿路癥狀。如西地那菲Viagra。2). 糖酵解酶: 前列腺能量代謝很獨特,其上皮中積聚大量檸檬酸和鋅,高濃度鋅抑制/阻斷三羧酸循環(huán)。只能依賴于糖酵解獲取能量。糖酵解酶抑制劑可治療BPH。3). 芳香化酶: 雌激素在前列腺增生發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。男性體內(nèi)雌激素主要由雄激素轉(zhuǎn)化來,芳香化酶P450 是其關(guān)鍵和限速酶。其抑制劑有治療

31、良性前列腺增生等激素依賴疾病。4). 生長因子: 一些肽類生長因子與前列腺增生有關(guān)。其抑制劑可治療BPH。5). 內(nèi)皮素: 強烈平滑肌收縮因子,可使前列腺平滑肌收縮,參與梗阻。其受體拮抗劑改善尿道梗阻.第32頁，共67頁。2. 艾滋病HIV1). 免疫預(yù)防和治療: 醫(yī)學(xué)史上,天花等傳染病的消滅依靠疫苗, 而不是抗病毒藥物。人們期待有效的抗HIV疫苗的誕生,但目前尚未取得突破性進(jìn)展. 2). HIV- 1 化療治療： 抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(antiretroviral therapy, ART) 是醫(yī)學(xué)史上發(fā)展最快的治療方法。96 年前稱“艾滋病雞尾酒”(AIDS cocktails)。96 年世界

32、艾滋病會議決定用HAART(highly active anti-retroviral therapy) 代替,它使AIDS 死亡率大大下降HAART指3 種或以上HIV 病毒酶抑制劑聯(lián)合應(yīng)用,常用1 種蛋白酶抑制劑與2 種核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NRTI) 聯(lián)合使用,或用1 種非核苷類的逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTI) 與2 種NRTI 聯(lián)合使用。但HAART 易產(chǎn)生抗藥性,對潛伏病毒不起作用等問題。3). 抗藥性. HIV非常容易產(chǎn)生抗藥性。其逆轉(zhuǎn)錄酶的“不忠實性”和缺乏“校正機制”,使每個基因組在1個復(fù)制周期就產(chǎn)生1個突變。突變是抗藥性產(chǎn)生的遺傳基礎(chǔ)。完全抑制病毒復(fù)制可使抗藥性產(chǎn)生的機會大大減

33、少。不恰當(dāng)治療,特別是部分抑制病毒,給病毒抗藥性形成提供選擇壓力,加速抗藥性的形成。中藥對藥物副作用的舒緩可增加用藥的持久性和藥物對病毒的抑制度,可望有助于解決抗藥性問題。此外,期待中藥成分的多樣性能產(chǎn)生多靶點作用。.第33頁，共67頁。4). HIV的潛伏是徹底清除HIV的最大障礙 “潛伏”(latency): 病毒以可逆的非復(fù)制狀態(tài)存在宿主體內(nèi),在宿主內(nèi)長期存在.HIV 感染者即使在長期無癥狀期,血漿中RNA拷貝都維持在104-105個/ml。低水平復(fù)制使病毒演變,形成新的免疫逃脫和抗藥株. HIV 潛伏庫衰減速度非常慢,1/2清除需44個月,清除含106的潛伏細(xì)胞庫要花費73年。HAAR

34、T可使血漿病毒降到50個/ml拷貝以下,并維持達(dá)6-7年,而潛伏庫絲毫沒有清除跡象。有患者治療后,血漿病毒降到50個/ml RNA 拷貝以下長達(dá)3 年,但一旦停藥,幾星期內(nèi)血漿病毒立即回升到治療前水平.HIV與其他病毒不同之處: 1) 逆轉(zhuǎn)錄病毒; 2) 感染的靶細(xì)胞為CD4+ HTL, 3) 潛伏細(xì)胞頻率太低,缺乏分離技術(shù)。目前沒有直接針對潛伏HIV 的藥物。當(dāng)前的策略是激活有潛伏HIV 的休止細(xì)胞,把它們從潛伏庫里“沖洗”出來。從南太平洋薩摩亞島植物中分離出的佛波醇酯(phorbol ester) 的物質(zhì)prostratin,在體內(nèi)能誘導(dǎo)休止的CD4+HTL 表達(dá)潛伏HIV,且不激發(fā)細(xì)胞增

35、殖。待解決的問題: HIV潛伏記憶藏在那里? 有什么標(biāo)記性特征? 能否把它們分離? 能否證明細(xì)胞的基因組里存在HIV原病毒DNA? 能否激活原病毒使它成為能感染活化的CD4+HTL ? 能否在體外或小動物建立HIV 潛伏模型?HIV 研究受條件的局限性較大。.第34頁，共67頁。 (1) 三個病毒催化酶. 逆轉(zhuǎn)錄酶,整合酶和蛋白酶,為較理想的靶點。逆轉(zhuǎn)錄酶: 把病毒單鏈RNA變成原病毒雙鏈DNA,為主要的藥物靶點。核苷類(NRTI)與酶競爭而抑制酶活;非核苷類NNRTI與酶結(jié)合使其變構(gòu)而失活。以它為靶點的藥物最多,高效新藥不斷出現(xiàn)。整合酶: 把原病毒雙鏈DNA 整合到宿主基因組中,為抑制病毒復(fù)

36、制和阻止病毒潛伏的理想藥靶,因種種原因此類藥物目前還沒有上市。蛋白酶: 把長多肽鏈切成較小片段,成為有功能的成熟核蛋白,蛋白酶抑制劑抑制蛋白酶活性,也抑制了病毒的成熟。(2) 阻止融合的蛋白質(zhì). 與抑制復(fù)制比,阻止與宿主融合,從而阻止病毒進(jìn)入細(xì)胞,似乎更加“棋高一著”。病毒與宿主細(xì)胞融合抑制劑一直是抗艾滋藥物研究的重點。與病毒蛋白結(jié)合,阻止融合. 臨床上與抗逆轉(zhuǎn)錄藥物聯(lián)合用于對其他藥物無效患者。與宿主蛋白結(jié)合,阻斷融合. 細(xì)胞表面分子CD4及趨化因子受體CCR5和CXCR4是HIV進(jìn)入靶細(xì)胞的受體分子。針對這些分子的單克隆抗體及小分子物可能成為新藥。5). HIV- 1 感染藥物研發(fā)的新靶點.

37、 抗HIV藥物研發(fā)不僅促進(jìn)了藥物研發(fā)和研發(fā)速度,還改變了從藥物到藥靶的傳統(tǒng)研發(fā)模式,發(fā)展了從藥靶到藥物的現(xiàn)代研發(fā)模式: 根據(jù)HIV分子資料,確定逆轉(zhuǎn)錄酶、蛋白酶等為藥靶,基因工程表達(dá)藥靶蛋白,X線衍射等繪制晶體圖像,計算機分子建模,候選藥物設(shè)計和修飾,最后進(jìn)行藥理,藥物,臨床前及臨床研究。.第35頁，共67頁。3. 阿爾茨海默病阿爾茨海默病(Alzheimers disease,AD): 老年癡呆中首病之一, 以認(rèn)知障礙和記憶力損害為特征的慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。發(fā)病機制復(fù)雜,病因未完全闡明發(fā)病率: 65歲以上約10%, 85歲以上約47%。全球2600萬,我國700萬;無阻止,延緩或防止

38、發(fā)生和發(fā)展的藥。目前多用單靶向藥物，療效不佳。AD產(chǎn)生的原因: 乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶活性降低或膽堿攝取能力低下,引起神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)營養(yǎng)缺乏、功能受損等,導(dǎo)致神經(jīng)元系統(tǒng)功能衰退; 谷氨酸受體活性過高、活性氧水平過高、炎癥和病毒感染等,導(dǎo)致代謝通路受損、線粒體能量產(chǎn)生減少； -淀粉樣蛋白(-amyloid, A) 團塊聚集,在胞質(zhì)沉積后有很強的神經(jīng)毒性 由Tau蛋白(神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達(dá)的微管蛋白)異常磷酸化: 導(dǎo)致神經(jīng)纖維纏結(jié)、細(xì)胞核或線粒體DNA 突變、蛋白質(zhì)折疊錯誤,及RNA 或蛋白質(zhì)加工不正確等。.第36頁，共67頁。 1) 癥狀控制藥. 常用藥為乙酰膽堿酯酶抑制劑及其受體調(diào)節(jié)劑. 雖不能扭轉(zhuǎn)但能

39、控制癥狀.是重要藥物。乙酰膽堿酯酶也是昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的酶,用于農(nóng)殘檢測. 2) 癥狀改善藥: 以A為靶的抗AD藥為研究熱點。包括A形成和聚集抑制劑及清除劑。在研的有tarenflurbil(A免疫疫苗),tau聚集抑制劑亞甲藍(lán)等.3) 多靶點藥物. 開發(fā)中的藥物不僅調(diào)節(jié)乙酰膽堿,對多個AD 特征性病變 (如神經(jīng)元凋亡、A 沉積、tau 蛋白過磷酸化等) 和神經(jīng)營養(yǎng)或神經(jīng)再生也有作用。4) 中藥多靶向抗AD藥物: 姜黃素: 抗氧化和抗炎,高效阻止A 纏結(jié),還是很好的Cu2+等金屬離子螯合劑。對AD 有預(yù)防作用,長期食姜黃食物的印度農(nóng)民,65 歲以上AD 患率僅1%。石杉堿甲: 選擇性抑制乙

40、酰膽堿酯酶,有保護(hù)神經(jīng)線粒體等多重作用。含6 味中藥的新復(fù)方參烏膠囊及其有效成分二苯乙烯苷: 在多種擬AD 動物模型上對AD發(fā)病的多個靶點和環(huán)節(jié)起作用,有神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)作用.植物雌激素替代治療: 雌激素有抗AD 作用, 絕經(jīng)期開始進(jìn)行雌激素替代治療可減少AD 風(fēng)險。黃酮類植物雌激素(ER 激動劑松果菊苷,甘草苷,甘草素,染料木黃酮、染料木苷、大豆黃素、大豆黃苷、芒柄花素和牛尿酚)有神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)營養(yǎng)作用,一定程度上對抗谷氨酸和A 引起的海馬神經(jīng)元損傷.AD 靶向治療藥物.第37頁，共67頁。4. 糖尿病藥物作用靶點主要酶靶:-葡萄糖苷酶(小腸內(nèi)水解-1,4-糖苷鍵生成單糖):競爭性和可逆性

41、抑制劑. 葡萄糖激酶(GK): 葡萄糖-6-磷酸酶醛糖還原酶(AR)二肽肽激酶(DPP-) 蛋白激酶C(PKC)蛋白酪氨酸激酶(PTK)和蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP) 糖原合酶激酶3 (GSK-3)一氧化氮合酶(NOS)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)肉堿酯酰轉(zhuǎn)移酶、(CPT 、)過氧化物酶增殖激活受體(PPAR)糖代謝酶蛋白磷酸化酶.第38頁，共67頁。天然靶點藥物研究模式靶點(已知)確立篩選系統(tǒng)與檢測方法確立大量提取物的篩選(幾百種),可組合活性成分分離純化結(jié)構(gòu)解分析活性比較,找出作用強的幾中細(xì)胞,組織,動物實驗(可委托)臨床試驗酶活性測定.第39頁，共67頁。九. 天然藥物提取分離與新靶點藥物篩

42、選1. 天然藥物提取,分離與制備提取分離新方法: 柱層析提取法, 電泳提取法濃縮新方法: 樹脂濃縮法天然藥物制備: 蟲草素, 喜樹堿, 姜黃素, 二苯乙烯類, 河豚素, 中藥提取物基因工程生產(chǎn)藥用成分: 白藜蘆醇, 神秘果素(糖尿病輔助藥)和豆豉激酶(溶栓藥)的微生物與植物基因工程生產(chǎn) 2. 天然靶點藥物: 核苷酸代謝有關(guān)的靶點藥物篩選腺苷脫氨酶抑制劑: 篩選出4種有效的提取物,鑒定2種有效成分拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑: 喜樹堿的提取分離與結(jié)構(gòu)修飾、轉(zhuǎn)化 核糖核苷酸還原酶抑制劑: 篩選模型的構(gòu)建(基因克隆與基因工程菌表達(dá))通過靶點研究中藥有效成分.第40頁，共67頁。天然藥物制備方法提取濃縮分離,純化

43、鑒定, 定性定量分析植物種類,器官,發(fā)育期,地點,前處理(固定,干燥,粉碎)等目標(biāo)物質(zhì): 種類,性質(zhì),含量,分布等提取方法,溶劑,提取時間,用量,溫度,次數(shù)等離心,沉淀,酸堿度,萃取,重溶,結(jié)晶,膜過濾等層析分離: 大孔樹脂,聚酰胺,離子交換,凝膠/分子篩, 硅膠等LC, HPLC,沉淀,結(jié)晶/重結(jié)晶UV, IR, HPLC, GC, MS, NMR,電泳,特殊化學(xué)反應(yīng),顏色反應(yīng)濃縮干燥生物材料產(chǎn)物.第41頁，共67頁。最新的提取方法柱層析提取法提取活性成分.第42頁，共67頁。原理和理論：提取 = 溶解 + 洗脫技術(shù)浸泡瀝濾動態(tài)逆流循環(huán)重力+層析洗脫分離.第43頁，共67頁。蟲草素的提取與分

44、離制備.第44頁，共67頁。Column chromatographic extraction and preparation of cordycepin fromCordyceps militariswaster mediumLarge amounts of solid medium containing cordycepin, used in the industrial production ofCordyceps militaristhrough solid fermentation, are discarded as waste and contaminate the environ

45、ment. Dr Hai-Hang Li and his team from the Guangdong Provincial Key Lab of Biotechnology for Plant Development at the South China Normal University in Guangzhou, China, have developed a new column chromatographic extraction (CCE) method for the extraction of cordycepin from this waste and a preparat

46、ion method for further separation and purification.The study, which was published in the Journal of Chromatography B 877 (22), 2135-2141(2009), formed part of a larger research project on “Technologies for Profitable Environmental Waste Treatments”, which included finding the values and usage of env

47、ironmental waste and developing technologies to use them profitably. “The key point for profitable treatment of waste is to develop a simple and useful technology or method, with high efficiency and low costs,” Dr Li explained. The new extraction method, based on chromatographic theory and practice,

48、 combined recent new technologies in the extraction field, such as mixing, dynamic, countercurrent and circulation. “The CCE method uses as little as four volumes of solvent to reach more than 97% extraction efficiency. This method has high extraction efficiency, uses a minimum volume and minimum co

49、ncentration of solvent, the preparation method is simple, highly efficient, energy-saving, environmentally friendly, and has been demonstrated to be effective for large preparations of cordycepin from waste with low equipment and operating costs. This work also expanded the application of chromatogr

50、aphic technology in natural chemical industry,” Li added. According to him, the new extraction method is being used for both quantitative analysis and large preparations of bioactive substances from biological wastes in agricultural, food and beverages and medical industries, as well as for the prep

51、aration of extracts of traditional Chinese medicines. For more information, contact the author on li_haihang英國Separation Science, 09年9月發(fā)表專題報道(英文版)China.第45頁，共67頁。英國09年專題報道本研究中文版.第46頁，共67頁。Merck公司高級藥物化學(xué)家發(fā)文贊揚本工作Cordyceps militaris By Heinz Sarter, Ph.D. Pharmaceutical Chemist, GermanyThe intention of

52、this article is to give an overview on recent developments in the field of Cordyceps militaris.First, I want to mention an excellent paper of He Ni,Xiao-Hong Zhou,Hai-Hang Li and Wen-Fang Huang: Column chromatographic extraction and preparation of cordycepin from Cordyceps militaris waster medium, p

53、ublished in Journal of Chromatography B,877 (2009), 2135-2141Cordyceps militaris can be a very good substitude for Cordyceps sinensis. Especially cordycepin can be isolated from Cordyceps militaris.Cordycepin is under clinical tests as therapeutic agent for treatment of TdT -positive acute lymphocyt

54、ic leukemia (granted by the FDA). Furthermore cordycepin has antibacterial, antifungal and antiviral properties.The current paper describes a column chromatographic extraction of cordycepin with a purity of more than 98%.第47頁，共67頁。蟲草素的柱層析與提取分離連續(xù)生產(chǎn)的工藝流程圖.第48頁，共67頁。中試生產(chǎn)產(chǎn)品及其分析結(jié)構(gòu).第49頁，共67頁。實驗室生產(chǎn)的高純度蟲草素產(chǎn)

55、品.第50頁，共67頁。喜樹堿的柱層析循環(huán)與非循環(huán)提取的比較喜樹堿的超聲波輔助的浸泡提取.第51頁，共67頁。結(jié)晶后氯仿萃取后粗提液喜樹堿純品.第52頁，共67頁。兩種柱層析提取法獲得的茶提取物比較白色為水提取: 70oC, 超聲1h, 徑高比1:10, 流速為2BV/h,收集前20倍。30%乙醇提?。菏覝?，徑高比1:10，流速2BV/h，收集前12倍。提取液減壓濃縮，65oC真空干燥，得到固體粉末稱重。烘干后相對提取率 提取液中提取率 .第53頁，共67頁。聚酰胺柱茶多酚大孔樹脂咖啡因茶氨酸提取柱溶解吸脹超聲波等處理茶葉活性物提取分離工藝流程茶葉/粉碎/過篩水/水處理器95%食用酒精茶多酚咖

56、啡因濃縮干燥純化離子交換茶氨酸茶多糖.第54頁，共67頁。連續(xù)柱層析提取分離的產(chǎn)物茶多酚咖啡因茶氨酸EGCG.第55頁，共67頁。圖8. 柱層析循環(huán)提取、非循環(huán)提取和超聲提取姜黃素的比較柱層析提取法（白） 超聲提取法（條紋） 循環(huán)柱層析提取法（黑）07級本科畢業(yè)論文(詹佩茵).第56頁，共67頁。表1 不同提取液稀釋四倍后二苯乙烯苷的含量表3 不同提取液中蒽醌類含量對比何首烏提取液與有效成份研究07級本科畢業(yè)論文純化二苯乙烯苷二苯乙烯苷標(biāo)準(zhǔn)品40%乙醇提取液50%乙醇提取液水煮提取液甲醇提取液二苯乙烯苷 mg/ml0.38070.33180.03230.123140%乙醇提取80%乙醇提取水煮

57、法提取甲醇提取大黃素(mg/ml)5.785610-35.55610-3 3.4510-3大黃素甲醚mg/ml1.01310-42.56210-34.45810-4.第57頁，共67頁。微生物與植物基因工程生產(chǎn)藥用成分白藜蘆醇，變味蛋白，納豆激酶，多酚氧化酶等.第58頁，共67頁。樹脂吸液濃縮法.第59頁，共67頁。.第60頁，共67頁。濃縮3倍樹脂濃縮蛋白質(zhì)溶液表3.4 樹脂吸液法濃縮多糖提取液效果材料蟲草多糖蟲草多糖甘薯多糖甘薯多糖濃縮倍數(shù)1.03.081.03.23回收率92.23.991.34.691.85.787.84.2表3.5 樹脂濃縮蛋白提取液的效果材料蟲草蛋白蟲草蛋白甘薯蛋白

58、甘薯蛋白牛血清牛血清濃縮倍數(shù)1.03.01.03.01.03.0回收率95.00.790.04.791.86.790.95.496.80.895.20.8.第61頁，共67頁。圖3.29 濃縮前后溶液中蟲草素的HPLC檢測 蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品 蟲草提取液濃縮3倍濃縮前截留分子量500 截留分子量100 .第62頁，共67頁。圖 3.31 濃縮前后溶液中酪氨酸的HPLC檢測 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液 酪氨酸提取液濃縮3倍濃縮前截留500截留100.第63頁，共67頁。靶點藥物與藥物添加劑腺苷脫氨酶抑制劑的篩選與提取分離鑒定.第64頁，共67頁。圖9. 腺苷脫氨酶對蟲草素的降解.蟲草素, 蟲草素降解產(chǎn)物(3-脫

59、氧次黃苷)圖10. 腺苷脫氨酶對腺苷的降解. 腺苷, 腺苷降解產(chǎn)物(次黃苷)I, 腺苷降解產(chǎn)物(次黃苷)II. 圖11. 蟲草素+腺苷脫氨酶抑制劑處理癌細(xì)胞48小時后蟲草素含量. 黑柱為蟲草素純品(98%), 白柱和斜線柱為蟲草素+提取物處理. 圖12. HPLC測定癌細(xì)胞中蟲草素降解. A為蟲草素純品, B為蟲草素+提取物(蟲草素濃度均為25g/ml). .第65頁，共67頁。圖11. 蟲草素(98%,黑柱)與蟲草 + 活性提取物(斜線柱和白柱)癌細(xì)胞生長的影響.各處理中的蟲草素濃度相等. A: 24 hours, B: 48 hours, C: 72 hours.篩選出4種有活性的提取物分離鑒定了2種成分.第66