中國(guó)藥典無(wú)菌、微生物限度和細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法學(xué)驗(yàn)證內(nèi)容詳解

1、中國(guó)藥典無(wú)菌、微生物限度和細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法學(xué)驗(yàn)證內(nèi)容詳解主要內(nèi)容1、無(wú)菌檢查方法學(xué)驗(yàn)證關(guān)鍵點(diǎn)及常見(jiàn)問(wèn)題2、微生物限度檢查方法學(xué)驗(yàn)證關(guān)鍵點(diǎn)及常見(jiàn)問(wèn)題3、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法學(xué)驗(yàn)證關(guān)鍵點(diǎn)及常見(jiàn)問(wèn)題無(wú)菌檢查的方法學(xué)驗(yàn)證相關(guān)規(guī)定無(wú)菌檢查驗(yàn)證的關(guān)鍵點(diǎn)驗(yàn)證中常見(jiàn)的問(wèn)題 一、相關(guān)規(guī)定 藥品無(wú)菌和微生物限度檢查方法驗(yàn)證作為中國(guó)藥典2005年版增訂的一項(xiàng)重要內(nèi)容對(duì)促進(jìn)我國(guó)藥品微生物檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化是十分重要和必要的，執(zhí)行近一年以來(lái)的情況表明，方法驗(yàn)證是促使我國(guó)藥品無(wú)菌和微生物限度檢查方法更加合理、科學(xué)和嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹匾緩健＃?006年6月全國(guó)會(huì)議紀(jì)要） 中檢所和藥典會(huì)多次召開(kāi)會(huì)議肯定工作的成績(jī)、研討存在的問(wèn)題，希望各級(jí)

2、領(lǐng)導(dǎo)能給予高度重視，從各方面支持這項(xiàng)工作長(zhǎng)期持續(xù)發(fā)展。 實(shí)際工作中，藥品生產(chǎn)、研發(fā)企業(yè)和各級(jí)藥檢所在工作中都存在很多困難和問(wèn)題。關(guān)于執(zhí)行中國(guó)藥典2005年版微生物限度檢查法和無(wú)菌檢查法有關(guān)問(wèn)題的說(shuō)明國(guó)藥典發(fā)200598號(hào) 各藥品檢驗(yàn)所： 根據(jù)國(guó)食監(jiān)注2005234號(hào)“關(guān)于頒布和執(zhí)行中國(guó)藥典2005年版有關(guān)事宜的通知”規(guī)定，中國(guó)藥典7月1日起開(kāi)始執(zhí)行，各藥品檢驗(yàn)所在執(zhí)行“微生物限度檢查法”和“無(wú)菌檢查法”過(guò)程中遇到了一些問(wèn)題，為保證中國(guó)藥典2005年版的順利實(shí)施，現(xiàn)就有關(guān)問(wèn)題說(shuō)明如下：1“微生物限度檢查”和“無(wú)菌檢查”是藥品安全性檢查的重要項(xiàng)目。雖然近幾版中國(guó)藥典均收載有“微生物限度檢查法”和“

3、無(wú)菌檢查法”，但在如何保證檢驗(yàn)方法的科學(xué)性和檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性方面與國(guó)外藥典相比仍具有一定差距，其關(guān)鍵是中國(guó)藥典未強(qiáng)調(diào)對(duì)檢驗(yàn)方法進(jìn)行必要的方法驗(yàn)證。為此，藥典會(huì)設(shè)立專(zhuān)項(xiàng)科研課題，對(duì)2005年版中國(guó)藥典的“微生物限度檢查法”和“無(wú)菌檢查法”增加驗(yàn)證試驗(yàn)的必要性進(jìn)行研討。根據(jù)研究結(jié)果，2005年版中國(guó)藥典規(guī)定當(dāng)進(jìn)行藥品的“微生物限度檢查”或“無(wú)菌檢查”時(shí)應(yīng)進(jìn)行方法驗(yàn)證。驗(yàn)證的目的是為了確認(rèn)試驗(yàn)中供試品應(yīng)選擇藥典中所收載的何種供試液制備方法、何種測(cè)定方法及確定的檢測(cè)系統(tǒng)是否適用于該供試品的檢驗(yàn)，即只有通過(guò)方法驗(yàn)證，才能確定供試品的檢驗(yàn)條件和方法，保證“微生物限度檢查”或“無(wú)菌檢查”方法的科學(xué)性和檢驗(yàn)結(jié)

4、果的準(zhǔn)確性。 2不同企業(yè)生產(chǎn)的相同品種，特別是中成藥，因原料來(lái)源、工藝、輔料的不同，藥品可能表現(xiàn)出不同的抑菌特性；同一個(gè)企業(yè)生產(chǎn)的相同品種，因原料來(lái)源不同、工藝改變或不同實(shí)驗(yàn)室等原因，也可能導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的差異。因此，不同企業(yè)生產(chǎn)的相同品種進(jìn)行“微生物限度檢查”或“無(wú)菌檢查”時(shí)，其具體試驗(yàn)方法如沖洗量等不能簡(jiǎn)單照搬，需通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)核實(shí)該試驗(yàn)方法和檢測(cè)系統(tǒng)是否適宜。 3目前各藥檢所涉及的檢驗(yàn)工作可分為三類(lèi)：注冊(cè)檢驗(yàn)（包括進(jìn)口注冊(cè)和新藥注冊(cè)）、監(jiān)督抽驗(yàn)和進(jìn)口檢驗(yàn)?？紤]到各檢驗(yàn)性質(zhì)的差異，各口岸所在進(jìn)行進(jìn)口復(fù)核及進(jìn)口檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)請(qǐng)企業(yè)提供方法驗(yàn)證材料或詳細(xì)的SOP資料進(jìn)行審核；各口岸所完成復(fù)核時(shí)應(yīng)在修訂

5、的進(jìn)口注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)中明確“微生物限度檢查”或“無(wú)菌檢查”的關(guān)鍵操作點(diǎn)（如供試品的處理方法等）及試驗(yàn)方法（如平皿法、薄膜過(guò)濾法、直接接種法等），并在復(fù)核說(shuō)明中概述驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以方便以后的進(jìn)口檢驗(yàn)。對(duì)國(guó)內(nèi)新藥的注冊(cè)檢驗(yàn)，也應(yīng)請(qǐng)企業(yè)提供方法驗(yàn)證資料，如果企業(yè)提供不出方法學(xué)驗(yàn)證資料，根據(jù)藥品注冊(cè)管理辦法，應(yīng)在審核意見(jiàn)中明確指出“方法學(xué)未經(jīng)驗(yàn)證，無(wú)法檢驗(yàn)”，并建議企業(yè)重新建立“微生物限度檢查”或“無(wú)菌檢查”方法。監(jiān)督抽驗(yàn)藥品，由于2005年版以前歷版中國(guó)藥典未強(qiáng)調(diào)進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，故各藥檢所目前在進(jìn)行具體品種檢驗(yàn)時(shí)難度較大，故也應(yīng)請(qǐng)企業(yè)提供方法驗(yàn)證資料并進(jìn)行審核，未經(jīng)過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證的“微生物限度檢查”或“無(wú)菌

6、檢查”結(jié)果，決不能給出“符合2005年版中國(guó)藥典的規(guī)定”的結(jié)論。 國(guó)家藥典委員會(huì) 中國(guó)藥品生物制品檢定所二00五年十月十一日 驗(yàn)證的目的: 驗(yàn)證所采用的方法和條件是否適合于供試品的無(wú)菌檢查。 即確認(rèn)供試品在該檢驗(yàn)量、該檢驗(yàn)條件下無(wú)抑菌活性或其抑菌活性以被充分消除到可以忽略不計(jì)。 驗(yàn)證的意義：保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠及檢驗(yàn)方法的完整性。 二、無(wú)菌檢查驗(yàn)證的關(guān)鍵點(diǎn)驗(yàn)證的類(lèi)型前驗(yàn)證: 建立藥品的微生物限度檢查法和無(wú)菌檢查法時(shí)（當(dāng)建立藥品的無(wú)菌或微生物限度檢查法時(shí)，應(yīng)進(jìn)行方法的驗(yàn)證，以證明所采用的方法適合于該藥品的無(wú)菌檢查）。 再驗(yàn)證: 修訂的檢驗(yàn)方法;供試品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果

7、時(shí) ;定期的方法驗(yàn)證（若藥品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變時(shí)，檢查方法應(yīng)重新驗(yàn)證） 。無(wú)菌檢查驗(yàn)證用菌株：金黃色葡萄萄球菌 (Staphylococcus aureus) CMCC(B) 26 003銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) CMCC(B) 10 104 *擬修訂為大腸埃希菌枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis) CMCC(B) 63 501生孢梭菌 (Clostridium sporogenes) CMCC(B) 64 941白色念珠菌 (Candida albicans) CMCC(F) 98 001黑曲霉 (Asperglllus nige

8、r) CMCC(F) 98 003菌種的要求： 傳代次數(shù)不得超過(guò)5代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。加菌量:100cfu。 驗(yàn)證時(shí)，按“供試品的無(wú)菌檢查”的規(guī)定及下列要求進(jìn)行操作。對(duì)每試驗(yàn)菌應(yīng)逐一進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證方法： 直接接種法 薄膜過(guò)濾法薄膜過(guò)濾法將規(guī)定量的供試品按薄膜過(guò)濾法過(guò)濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入小于100cfu的試驗(yàn)菌，過(guò)濾。取出濾膜接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基中，或?qū)⑴囵B(yǎng)基加至濾筒內(nèi)。另取一裝有同體積培養(yǎng)基的容器，加入等量試驗(yàn)菌，作為對(duì)照。按規(guī)定溫度培養(yǎng)35天。各試驗(yàn)菌同法操作。直接接種法取符

9、合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基8管，分別接入小于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各2管；取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的改良馬丁培養(yǎng)基4管，分別接入小于100cfu的白色念珠茵、黑曲霉各2管。其中1管接人規(guī)定量的供試品，另1管作為對(duì)照，按規(guī)定的溫度培養(yǎng)35天。結(jié)果判斷： 與對(duì)照管比較，如含供試品各容器中的試驗(yàn)菌均生長(zhǎng)良好，則供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下無(wú)抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計(jì)，照此檢查法和檢查條件進(jìn)行供試品的無(wú)菌檢查。 如含供試品的任一容器中微生物生長(zhǎng)微弱、緩慢或不生長(zhǎng)，則供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下有抑菌作用。消除供試品抑菌的

10、方法增加沖洗量增加培養(yǎng)基的用量使用中和劑或滅活劑： -內(nèi)酰胺酶、對(duì)氨基苯甲酸 更換濾膜品種注意：重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。方法學(xué)驗(yàn)證資料試驗(yàn)記錄總的要求：詳細(xì)、嚴(yán)謹(jǐn)、可操作性供試品信息檢驗(yàn)數(shù)量和檢驗(yàn)量：按照無(wú)菌檢查的量確定供試品處理、供試品溶液的制備檢驗(yàn)方法（選擇直接接種法說(shuō)明理由）實(shí)驗(yàn)用菌 代數(shù)、稀釋級(jí)、計(jì)數(shù)檢驗(yàn)條件：主要是沖洗條件（沖洗液、沖洗次數(shù)、量，必要時(shí)說(shuō)明濾膜材質(zhì)、儀器、泵速等條件）。需要中和、酶處理等特殊處理方法的需說(shuō)明逐日記錄各菌的生長(zhǎng)情況方法學(xué)驗(yàn)證資料試驗(yàn)結(jié)論采用的方法：薄膜過(guò)濾法/直接接種法關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)點(diǎn)：如沖洗條件、中和、酶處理等因素三、驗(yàn)證及資料中常見(jiàn)的問(wèn)題薄膜過(guò)濾法加菌的時(shí)機(jī)按規(guī)

11、定應(yīng)在最后一次沖洗液中加入陽(yáng)性菌液，而驗(yàn)證試驗(yàn)主要考慮濾膜/濾器殘留抗菌物質(zhì)對(duì)陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)的影響，可以與對(duì)照濾器比較而作出判斷，所以驗(yàn)證試驗(yàn)中加菌時(shí)機(jī)與方式只要與對(duì)照一致即可（中檢所講義）。薄膜過(guò)濾法濾膜材質(zhì)選擇普通濾膜有機(jī)膜低吸附濾膜1.根據(jù)供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質(zhì)。2.應(yīng)保證濾膜在過(guò)濾前后的完整性。3.采用全封閉過(guò)濾器注意觀察膜的狀態(tài)，某些油性供試品或采用蓖麻油等作為溶媒的供試品可以損傷普通濾膜。驗(yàn)證試驗(yàn)與無(wú)菌檢查培養(yǎng)觀察時(shí)間 驗(yàn)證試驗(yàn)：按規(guī)定的溫度培養(yǎng)35天 無(wú)菌檢查：陽(yáng)性對(duì)照培養(yǎng)4872h應(yīng)生長(zhǎng)良好 問(wèn)題：生長(zhǎng)緩慢的判斷標(biāo)準(zhǔn)？敏感菌株與陽(yáng)性對(duì)照菌 陽(yáng)性對(duì)照菌不是驗(yàn)證試驗(yàn)選定的敏

12、感菌株 問(wèn)題：降低了陽(yáng)性對(duì)照菌的意義，實(shí)際工作中抑制枯草芽孢桿菌的樣品很多（敏感菌株），但陽(yáng)性對(duì)照只能選擇金黃色葡萄球菌。關(guān)于大腸埃希菌的問(wèn)題供試品無(wú)菌檢查中規(guī)定“抗革蘭陰性菌為主的供試品以大腸埃希菌為對(duì)照菌”，但在方法學(xué)驗(yàn)證中所用菌株沒(méi)有大腸埃希菌。解決措施：抗革蘭陰性菌的抗菌藥物進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證時(shí)增加大腸埃希菌。即將修訂，將銅綠假單胞菌修訂為大腸埃希菌。修訂后按新方法執(zhí)行。問(wèn)題：方法選擇錯(cuò)誤薄膜過(guò)濾法和直接接種法如：一般供試品（無(wú)特殊說(shuō)明）采用直接接種法某廠家胸腺五肽注射液為普通注射劑，完全可以采用薄膜過(guò)濾法，生產(chǎn)單位進(jìn)行的無(wú)菌檢查驗(yàn)證法為直接接種法。也有的廠家把兩種方法的驗(yàn)證都寫(xiě)上，結(jié)論中

13、也沒(méi)有說(shuō)明采用那種方法。CP2005：無(wú)菌檢查法包括薄膜過(guò)濾法和直接接種法，只要供試品性狀允許，應(yīng)采用薄膜過(guò)濾法。修訂：改為薄膜過(guò)濾法重新進(jìn)行驗(yàn)證。檢驗(yàn)數(shù)量和檢驗(yàn)量進(jìn)行供試品無(wú)菌檢查時(shí)，所采用的檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)條件應(yīng)與驗(yàn)證的方法相同。結(jié)合無(wú)菌檢查檢驗(yàn)數(shù)量和檢驗(yàn)量確定驗(yàn)證時(shí)取樣量。如同時(shí)進(jìn)行無(wú)菌檢查一定要按照規(guī)定的檢驗(yàn)數(shù)量和檢驗(yàn)量取樣。生產(chǎn)單位進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證時(shí)檢驗(yàn)數(shù)量要按照表1 批出廠產(chǎn)品最少檢驗(yàn)數(shù)量。檢驗(yàn)量（每只樣品接入每種培養(yǎng)基的最少樣品量）同上市抽驗(yàn)品種。無(wú)菌檢查法中規(guī)定：只要供試品特性允許，應(yīng)將所有容器內(nèi)的全部?jī)?nèi)容物過(guò)濾。因此，驗(yàn)證試驗(yàn)中檢驗(yàn)量就多不就少，如10ml注射液，雖然每個(gè)濾膜每容

14、器取2ml也符合藥典規(guī)定，10支分配至3個(gè)或更多濾筒也可，但建議取15支分3個(gè)濾筒（貴重藥品和抗生素品種可靈活掌握，但不能低于最少量）。對(duì)檢驗(yàn)數(shù)量和檢驗(yàn)量的把握應(yīng)考慮便于實(shí)際操作，比如處理100ml/袋的樣品，取9袋樣品一次分配到一組三聯(lián)濾器，檢驗(yàn)數(shù)量大于藥典規(guī)定的6個(gè)，但檢驗(yàn)量似乎不符合藥典規(guī)定的每袋樣品取半量檢驗(yàn)的規(guī)定，僅為1/3，但根據(jù)藥典檢驗(yàn)量即為一次試驗(yàn)所用供試品總量（g或ml）的解釋?zhuān)@與先將6袋分配兩個(gè)濾筒，再將剩下3袋抽入一個(gè)濾筒作為樣定對(duì)照的方法一樣，卻更節(jié)省時(shí)間。（中檢所講義）問(wèn)題：沖洗條件、沖洗量的選擇有些廠家提供的驗(yàn)證資料中，對(duì)非抑菌性供試品也采用大量的沖洗，100ml

15、/次*10次/膜，增加了出現(xiàn)誤差的機(jī)會(huì)。1. 對(duì)膜的損傷2. 檢驗(yàn)方法繁瑣，大大增加檢驗(yàn)人員的工作量（檢驗(yàn)要按照已經(jīng)驗(yàn)證的方法進(jìn)行）3. 驗(yàn)證試驗(yàn)方法選擇總的原則是由易到難沖洗不一定為100ml/次，可少量多次，如50ml/次，注意充分振搖。對(duì)于抑菌性較強(qiáng)的供試品，可以先用適宜的稀釋液稀釋后再過(guò)濾，以減少膜的吸附, 減少?zèng)_洗量。如：抗生素品種取規(guī)定量，混合至含適量稀釋液（如500ml等)的無(wú)菌容器中，然后再過(guò)濾。對(duì)于抑菌性較強(qiáng)的注射用無(wú)菌粉末或固體原料，一定要充分溶解、混合均勻。抗菌藥可以根據(jù)其抗菌譜選擇敏感菌先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，找到合適的條件再進(jìn)行其他菌的實(shí)驗(yàn)。采用開(kāi)放式薄膜過(guò)濾器：濾膜分成幾份與

16、取樣量、沖洗條件的選擇有關(guān)，建議盡量與無(wú)菌檢查法一致（最常見(jiàn)為3等分）。問(wèn)題：方法描述不夠詳細(xì)，沒(méi)有可操作性如：某產(chǎn)品驗(yàn)證資料內(nèi)容“將規(guī)定量的供試品按薄膜過(guò)濾法過(guò)濾，沖洗，在最后一次沖洗液中加入小于100CFU的試驗(yàn)菌，過(guò)濾。取出濾膜接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)集中，或?qū)⑴囵B(yǎng)基加至濾筒中”。驗(yàn)證的目的是為了“照此檢查法和檢查條件進(jìn)行供試品的無(wú)菌檢查”，方法確立后，以后該產(chǎn)品就可以采用該方法進(jìn)行檢驗(yàn)。修訂：應(yīng)記錄取樣量、（稀釋方法）、沖洗液、沖洗量（沖洗條件）等。無(wú)菌檢查方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)例2006年6月山東省藥品檢驗(yàn)所36吡拉西坦氯化鈉注射液規(guī)格：100ml:吡20g與氯1. 方法選擇：薄膜過(guò)濾法2.

17、確定檢品取樣量（講義中按上市抽驗(yàn)品種的檢驗(yàn)數(shù)量為例）規(guī)定：每支樣品接入每管培養(yǎng)基的最少樣品量：半量，最少檢驗(yàn)數(shù)量：6確定：每菌（6*1/2）瓶 3聯(lián)過(guò)濾器9瓶、2聯(lián)過(guò)濾器6瓶3. 實(shí)驗(yàn)條件選擇 沖洗：無(wú) 菌名 代數(shù) 稀釋級(jí) 計(jì)數(shù)結(jié)果銅綠假單胞菌 3 10-6 85枯草芽孢桿菌 3 10-7 65金黃色葡萄球菌 3 10-6 92生孢梭菌 3 10-6 75白色念珠菌 3 10-6 67黑曲霉菌 3 10-4 55結(jié)果觀察12345金葡陽(yáng)性對(duì)照+供試品+綠膿陽(yáng)性對(duì)照+供試品+生孢陽(yáng)性對(duì)照+供試品+枯草陽(yáng)性對(duì)照+供試品+白念陽(yáng)性對(duì)照-+供試品-+黑曲陽(yáng)性對(duì)照-+供試品-+結(jié)論說(shuō)明本品在該檢驗(yàn)條件下

18、無(wú)抑菌作用，或抑菌作用可以忽略不計(jì)。本品可以采用薄膜過(guò)濾法（不沖洗）進(jìn)行無(wú)菌檢查。陽(yáng)性對(duì)照菌選用金黃色葡萄球菌。維生素C注射液規(guī)格：5ml:1g確定樣品量：根據(jù)供試品的規(guī)格和檢驗(yàn)?zāi)康拿恐悠方尤朊抗芘囵B(yǎng)基的最少樣品量：2ml最少檢驗(yàn)數(shù)量：10每菌（10*2ml）（建議全部?jī)?nèi)容物濾過(guò)）3聯(lián)過(guò)濾器15支、2聯(lián)過(guò)濾器10支方法選擇：薄膜過(guò)濾法沖洗：無(wú)（或稍加沖洗）結(jié)果觀察12345金葡陽(yáng)性對(duì)照+供試品+綠膿陽(yáng)性對(duì)照+供試品+生孢陽(yáng)性對(duì)照+供試品+枯草陽(yáng)性對(duì)照+供試品-+白念陽(yáng)性對(duì)照-+供試品-+黑曲陽(yáng)性對(duì)照-+供試品-+結(jié)論說(shuō)明本品在該檢驗(yàn)條件下無(wú)抑菌作用，或抑菌作用可以忽略不計(jì)。本品可以采用薄膜過(guò)

19、濾法（不沖洗）進(jìn)行無(wú)菌檢查。陽(yáng)性對(duì)照菌選用金黃色葡萄球菌。我們進(jìn)行的其他廠家的維生素C注射液（2ml:1g）存在抑菌作用。注射用XXXX規(guī)格：20mg取樣量：每菌 10 瓶 3聯(lián)過(guò)濾器30瓶 2聯(lián)過(guò)濾器20瓶沖洗：無(wú)12345d金葡陽(yáng)性對(duì)照+供試品+銅綠陽(yáng)性對(duì)照+供試品+生孢陽(yáng)性對(duì)照+供試品-枯草陽(yáng)性對(duì)照+供試品+白念陽(yáng)性對(duì)照-+供試品-+黑曲陽(yáng)性對(duì)照-+供試品-+結(jié)論說(shuō)明本品在該檢驗(yàn)條件下對(duì)枯草芽孢桿菌有抑制作用。需采用進(jìn)一步處理（加大沖洗量）以消除抑菌性單獨(dú)進(jìn)行枯草芽孢桿菌其他菌可以不做：沖洗：200ml/膜（100ml*2)結(jié)果：12345d陽(yáng)性對(duì)照+供試品+結(jié)論說(shuō)明本品在該檢驗(yàn)條件下抑

20、菌作用可以消除。本品可以采用薄膜過(guò)濾法（細(xì)菌沖洗200ml/膜）進(jìn)行無(wú)菌檢查。敏感菌株為枯草芽孢桿菌。特殊情況眼用液體制劑：制劑通則中規(guī)定，眼用液體制劑微生物限度檢查法為“除另有規(guī)定外，按薄膜過(guò)濾法或直接接種法檢查，至少?gòu)?支供試品抽取規(guī)定量（每種培養(yǎng)基各接種2支，每支1ml），直接或處理后接種于硫乙醇流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基中。培養(yǎng)7天，不得有菌生長(zhǎng)。若有菌生長(zhǎng)，應(yīng)重新取2倍量供試品，分別依法復(fù)試，各管均不得有菌生長(zhǎng)?！毖塾靡后w制劑微生物限度檢查的方法驗(yàn)證同無(wú)菌檢查方法學(xué)驗(yàn)證。無(wú)菌檢查法擬增修訂內(nèi)容（征求意見(jiàn)稿）（僅供參考?。┒吭鲅a(bǔ)本附錄擬增修訂內(nèi)容 一、附錄 90 頁(yè)，無(wú)菌檢查法中的

21、“ 銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) CMCC(B) 10 104 ” 修訂為 “ 大腸埃希菌 ( Escherichia coli ) CMCC(B) 44 102 ” ； “ 銅綠假單胞菌 ” 修訂為 “ 大腸埃希菌 ” 二、附錄 90 頁(yè)，靈敏度檢查 菌液制備 第 10 行 “ （用管口帶有薄的無(wú)菌棉花或紗布能過(guò)濾菌絲的無(wú)菌毛細(xì)管） ” 訂正為 “ （用管口塞有適度疏松的無(wú)菌棉花或管口外包扎無(wú)菌紗布能過(guò)濾菌絲的無(wú)菌毛細(xì)管） ”三、附錄 90 頁(yè)，方法驗(yàn)證試驗(yàn) 1 第 1 5 行 “ 當(dāng)建立藥品的無(wú)菌檢查法時(shí)，應(yīng)進(jìn)行方法的驗(yàn)證，以證明所采用的方法適合于該藥品的

22、無(wú)菌檢查。若該藥品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變時(shí)，檢查方法應(yīng)重新驗(yàn)證。驗(yàn)證時(shí)，按“供試品的無(wú)菌檢查”的規(guī)定及下列要求進(jìn)行操作，對(duì)每一試驗(yàn)菌應(yīng)逐一進(jìn)行驗(yàn)證。 ” 增修訂為 供試品的無(wú)菌檢查應(yīng)采用驗(yàn)證的方法，無(wú)菌檢查 方法 的驗(yàn)證是確認(rèn)供試品在所采用的無(wú)菌檢查方法和檢驗(yàn)條件下無(wú)抑菌作用 , 以保證所污染的微生物能充分檢出。若藥品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變時(shí)，檢查方法應(yīng)重新驗(yàn)證。 驗(yàn)證時(shí)，按 “ 供試品無(wú)菌檢查 ” 的規(guī)定及下列要求進(jìn)行。 方法 驗(yàn)證試驗(yàn)的試驗(yàn)菌為大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、 生孢梭菌 、白色念珠菌和黑曲霉。上市產(chǎn)品監(jiān)督檢驗(yàn)進(jìn)行方法驗(yàn)證時(shí)試驗(yàn)菌至少應(yīng)選用金黃色葡萄球菌（

23、抗革蘭陰性菌為主的供試品 選用大腸埃希菌）、 生孢梭菌 和白色念珠菌。對(duì)每一試驗(yàn)菌應(yīng)逐一進(jìn)行驗(yàn)證。2 薄膜過(guò)濾法 第 1 行 “ 將規(guī)定量的供試品按薄膜過(guò)濾法過(guò)濾， ” 訂正為 “ 取每種培養(yǎng)基規(guī)定的供試品接種量按薄膜過(guò)濾法過(guò)濾， ” 3 直接接種法 第 5 行 “ 。其中 1 管接入規(guī)定量的供試品， ” 訂正為 “ 。其中 1 管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定的供試品， ” 四、附錄 91 頁(yè)，供試品的無(wú)菌檢查 陽(yáng)性對(duì)照 第 6 行 刪除 “ （ 大腸 埃希 菌 的 菌液制備 同 培養(yǎng)基的靈敏度檢查中的金黃色葡萄球菌 ） ” 五、附錄 91 頁(yè)，薄膜過(guò)濾法 水溶液供試品 第 6 行 “ ，取出濾膜，將其

24、剪成 3 等份， ” 訂正為 “ ，取出濾膜，將其分成 3 等份， ” 六、附錄 93 頁(yè)，表 2 第 9 行 “100V 500 ” 訂正為 “100V 500 ” 第 10 行 “V 500 ” 訂正為 “ V 500 ” 一部附錄增補(bǔ)本擬修訂內(nèi)容 附錄 68 頁(yè)，無(wú)菌檢查法中的“銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) CMCC(B) 10 104 ” 修訂為“大腸埃希菌 (Escherichia coli) CMCC(B) 44 102 ”；“銅綠假單胞菌”修訂為“大腸埃希菌” 附錄 68 頁(yè)，靈敏度檢查 菌液制備 第 10 行 “（用管口帶有薄的無(wú)菌棉花或紗布能

25、過(guò)濾菌絲的無(wú)菌毛細(xì)管）”訂正為“（用管口塞有適度疏松的無(wú)菌棉花或管口外包扎無(wú)菌紗布能過(guò)濾菌絲的無(wú)菌毛細(xì)管）” 附錄 68 頁(yè)，方法驗(yàn)證試驗(yàn) 1 、 第 1 5 行 當(dāng)建立藥品的無(wú)菌檢查法時(shí)，應(yīng)進(jìn)行方法的驗(yàn)證，以證明所采用的方法適合于該藥品的無(wú)菌檢查。若藥品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變時(shí)，檢查方法應(yīng)重新驗(yàn)證。驗(yàn)證時(shí)，按“供試品的無(wú)菌檢查”的規(guī)定及下列要求進(jìn)行操作，對(duì)每一試驗(yàn)菌應(yīng)逐一進(jìn)行驗(yàn)證。 ” 增修訂為 “供試品的無(wú)菌檢查應(yīng)采用驗(yàn)證的方法，無(wú)菌檢查方法的驗(yàn)證是確認(rèn)供試品在所采用的無(wú)菌檢查方法和檢驗(yàn)條件下無(wú)抑菌作用 , 以保證所污染的微生物能充分檢出。若藥品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變時(shí)，檢查方法應(yīng)

26、重新驗(yàn)證。驗(yàn)證時(shí)，按“供試品無(wú)菌檢查”的規(guī)定及下列要求進(jìn)行。 方法驗(yàn)證試驗(yàn)的試驗(yàn)菌為大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌和黑曲霉。上市產(chǎn)品監(jiān)督檢驗(yàn)進(jìn)行方法驗(yàn)證時(shí)的試驗(yàn)菌至少應(yīng)選用金黃色葡萄球菌、生孢梭菌和白色念珠菌。對(duì)每一試驗(yàn)菌應(yīng)逐一進(jìn)行驗(yàn)證。” 2 、薄膜過(guò)濾法 第 1 行 “將規(guī)定量的供試品按薄膜過(guò)濾法過(guò)濾，” 訂正為“取每種培養(yǎng)基規(guī)定的供試品接種量按薄膜過(guò)濾法過(guò)濾，” 3 、 直接接種法 第 5 行 “。其中 1 管接入規(guī)定量的供試品，” 訂正為“。其中 1 管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定的供試品，” 附錄 69 頁(yè)，薄膜過(guò)濾法 水溶液供試品 第 6 行“，取出濾膜，將其

27、剪成 3 等份， ” 訂正為“，取出濾膜，將其分成 3 等份， ” 附錄 69 頁(yè) 直接接種法 刪除“一次性使用含藥產(chǎn)品供試品 取規(guī)定量，接種于各管足以浸沒(méi)供試品的適量培養(yǎng)基中。” 附錄 70 頁(yè)，表 2 第 9 行 “ 100 V 500 ” 訂正為“ 100 V 500 ” 第 10 行 “ V 500 ” 訂正為“ V 500 ” 附錄 70 頁(yè)，表 3 刪除 第 7 行“一次性使用含藥產(chǎn)品 10 ” 第七屆全國(guó)藥品檢驗(yàn)所抗生素室主任工作會(huì)議暨全國(guó)藥品微生物檢驗(yàn)方法及標(biāo)準(zhǔn)研討會(huì)會(huì)議紀(jì)要（微生物檢驗(yàn)部分）為了進(jìn)一步理順?lè)椒?yàn)證和目前監(jiān)督抽驗(yàn)工作的關(guān)系，討論認(rèn)為應(yīng)對(duì)以建立科學(xué)合理的檢驗(yàn)方法為

28、目的的方法驗(yàn)證試驗(yàn)和對(duì)監(jiān)督抽驗(yàn)工作中所采用抽驗(yàn)方法的有效性的確認(rèn)實(shí)驗(yàn)加以區(qū)分，具體有如下三點(diǎn)：1. 對(duì)于注冊(cè)檢驗(yàn)，如果沒(méi)有合理的檢驗(yàn)方法，應(yīng)嚴(yán)格按照藥典要求，通過(guò)完整的驗(yàn)證試驗(yàn)建立標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法及SOP，所建立的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法中應(yīng)確定具體的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)菌檢查中的薄膜過(guò)濾法和直接接種法，微生物限度檢查中的平皿法和薄膜過(guò)濾法。標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法中應(yīng)有關(guān)鍵的實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)，如無(wú)菌檢查薄膜過(guò)濾法的沖洗條件；微生物限度檢查平皿法的供試品稀釋程度（皿、皿應(yīng)注明）。對(duì)有抗菌作用的樣品應(yīng)通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)確定一株敏感菌株，以供采納該檢驗(yàn)方法時(shí)進(jìn)行方法的確認(rèn)使用。2. 對(duì)注冊(cè)檢驗(yàn)中已有驗(yàn)證資料的方法進(jìn)行復(fù)核時(shí)，應(yīng)根據(jù)企業(yè)提供材料的

29、情況，結(jié)合藥檢所掌握的情況，通過(guò)分析判斷、適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)驗(yàn)證等，保證驗(yàn)證資料中檢驗(yàn)方法的合理、可靠和科學(xué)。3. 對(duì)于目前比較突出的已上市品種的監(jiān)督抽驗(yàn)問(wèn)題，原則上應(yīng)向被抽驗(yàn)品種的生產(chǎn)單位索取方法驗(yàn)證資料，如資料中已確定有敏感菌株，可以該菌株為陽(yáng)性對(duì)照確認(rèn)或調(diào)整檢驗(yàn)方法。如果沒(méi)有及時(shí)獲得驗(yàn)證資料，或者驗(yàn)證資料中沒(méi)有確定敏感菌株，抗生素及抗菌品種可根據(jù)其抗菌譜確立一株敏感菌株進(jìn)行方法確認(rèn)試驗(yàn)，其他品種可從藥典驗(yàn)證菌株中選取一到兩株菌快速確立檢驗(yàn)方法，一般細(xì)菌選擇枯草芽孢桿菌或金黃色葡萄球菌，真菌選擇白色念珠菌，或其他有可靠依據(jù)的敏感菌株，方法確認(rèn)實(shí)驗(yàn)可和檢驗(yàn)同步進(jìn)行。概述微生物檢查驗(yàn)證的關(guān)鍵點(diǎn)驗(yàn)證中常

30、見(jiàn)的問(wèn)題微生物限度檢查的方法學(xué)驗(yàn)證2006年6月山東省藥品檢驗(yàn)所65內(nèi)容1.概述2.樣品前處理方法及驗(yàn)證3.菌落計(jì)數(shù)方法及驗(yàn)證4.控制菌檢查方法驗(yàn)證5.總結(jié)并舉例一、概述微生物限度檢查法驗(yàn)證的目的：確認(rèn)所采用的方法是否適合于供試品的微生物限度檢查。驗(yàn)證的內(nèi)容：包括準(zhǔn)確性(回收率)、專(zhuān)屬性。驗(yàn)證的類(lèi)型：前驗(yàn)證(建立微生物限度檢查法時(shí)的驗(yàn)證)和再驗(yàn)證(修訂檢驗(yàn)方法后、供試品組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)、定期的方法驗(yàn)證)。頤和制藥根據(jù)檢查方法的不同分為： 細(xì)菌、霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證和控制菌檢查法的驗(yàn)證。驗(yàn)證的意義：保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠及檢驗(yàn)方法的完整性?？傮w思路與程序某些供試

31、品含有抗微生物物質(zhì)，使供試品中的活微生物的生長(zhǎng)被抑制，不能按常規(guī)方法檢驗(yàn)，必須以適當(dāng)?shù)姆椒ㄏ蛞种乒┰嚻分锌刮⑸镂镔|(zhì)的活性后，活微生物才能生長(zhǎng)，得以檢出。通過(guò)消除或抑制供試品中抗微生物物質(zhì)的活性來(lái)檢測(cè)微生物的方法，應(yīng)通過(guò)驗(yàn)證，以確定所用檢測(cè)方法測(cè)定結(jié)果的可信度。需要驗(yàn)證的環(huán)節(jié)驗(yàn)證實(shí)際上伴隨著整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的每一個(gè)環(huán)節(jié)均應(yīng)有合理的證明（驗(yàn)證），保證其對(duì)結(jié)果判斷沒(méi)有影響。前處理方法直接影響后續(xù)步驟的效果和重現(xiàn)性，應(yīng)在驗(yàn)證的范圍內(nèi)。已有標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程（SOP）和充足實(shí)驗(yàn)證明的前處理方法可以直接采用，但出現(xiàn)疑問(wèn)應(yīng)進(jìn)一步研究提高。 供試品中抗菌活性的去除是當(dāng)前驗(yàn)證工作的重點(diǎn)供試品中抗菌活性的去除

32、稀釋法降低供試品的相對(duì)濃度薄膜法利用體積差異分離中和法利用化學(xué)（生物）專(zhuān)屬性滅活離心法利用沉降系數(shù)差異分離 各方法組合運(yùn)用，會(huì)達(dá)到更好效果！驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 樣品：首先應(yīng)是合格的樣品。本底微生物太多可以先滅活，但不應(yīng)因此影響藥效。注意 針對(duì)抽驗(yàn)品種本底微生物太高情況，如我們沒(méi)條件進(jìn)行滅活處理，可對(duì)檢品適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行驗(yàn)證。（經(jīng)請(qǐng)示專(zhuān)業(yè)委員會(huì)認(rèn)可）檢驗(yàn)量 指供試品一次檢驗(yàn)的用量。一般為10g 或 10ml; 化學(xué)藥膜劑為100cm2。貴重或微量包裝的藥品可酌減（不得少于3g）。檢查沙門(mén)菌的供試品其檢驗(yàn)量改為10g或10ml。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)按檢驗(yàn)量執(zhí)行。 微生物限度檢查樣品前處理 制劑形式多樣，決定前處理各異

33、液體供試品固體、半固體或粘稠液體供試品非水溶性供試品其他液體供試品取供試品10ml，加無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，混勻，作為供試液。油劑可先加入適量的無(wú)菌聚山梨酯80使供試品分散均勻，然后再加無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml。可溶性液體制劑可用混合的供試品原液作為供試液。固體、半固體或粘稠液體供試品取供試品10g，加無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，用勻漿儀或其它有效方法混勻，作為供試液。(常規(guī)方法）必要時(shí)加適量的無(wú)菌聚山梨酯80，并置水浴適當(dāng)加溫使供試品分散均勻。 非水溶性供試品方法一 2000版已有方法 （乳化法）方法二2005版新增方法 （萃取法）軟膏、乳膏劑 先將已備

34、妥滅菌的含司盤(pán)80 5g、單硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯80 10g的混合物融化，待冷至45時(shí)，加入供試品5g（或5ml），立即用玻璃棒攪拌均勻，分次少量慢慢加入45的無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液80ml，邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為1：20供試液。油劑 取供試品10ml，加入無(wú)菌聚山梨酯80 58ml，搖勻，再加入無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml。 栓劑 稱(chēng)取供試品10g，加適量無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，置45水浴保溫10min，使溶，加入無(wú)菌聚山梨酯80 58ml，振搖使之乳化，再加無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，搖勻。 眼膏劑 取供試品10g，加至20ml無(wú)菌十四烷酸異丙酯，必

35、要時(shí)可增加十四烷酸異丙酯的用量，充分振搖，使供試品溶解。然后加入無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml，振搖510min，靜置，待油水明顯分層，取其水層作為供試液。 非水溶性膜劑 化學(xué)藥膜劑一般取樣量為100cm2，置滅菌錐形瓶中，加入適量的無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，于45水浴保溫，浸泡，振搖，以供試品浸液作為供試液。中藥膜劑取50 cm2，剪碎，加入適量的無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（通常1 cm2加1ml或2ml），浸泡，振搖，以供試品浸液作為供試液。 腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品取供試品10g，腸溶制劑加無(wú)菌磷酸鹽緩沖液至100ml，結(jié)腸溶制劑加無(wú)菌磷酸鹽緩沖液至100ml，置45水浴中，振搖，使溶解

36、，作為供試液。 氣霧劑、噴霧劑供試品取規(guī)定量供試品，置冰箱冰凍室內(nèi)約1h，取出，速消毒供試品容器的開(kāi)啟部位周?chē)?，用無(wú)菌鋼錐在容器上消毒部位鉆一小孔，在室溫輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)容器，使拋射劑緩緩全部釋出。用無(wú)菌注射器吸出全部藥液，加至適量的無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（若含非水溶性成分，加適量的無(wú)菌聚山梨酯80）中，混勻，取相當(dāng)于10g或10ml的供試品，再稀釋成1：10的供試液。 茶劑取供試品10g，置滅菌錐形瓶中，加入稀釋劑100ml，振搖23min，以滅菌紗布過(guò)濾（如為袋泡茶，可直接取2袋，以稱(chēng)樣結(jié)果按1：10加稀釋劑，浸泡30min）。注意：以上供試品如吸水膨脹，或黏度過(guò)高，可增加稀釋級(jí)的量，制成1：2

37、01：100供試液制備供試液所用的乳化劑、分散劑、中和劑及其用量應(yīng)驗(yàn)證，在該檢驗(yàn)條件無(wú)抗菌作用。目標(biāo)是使不便于取樣的供試品分散均勻！ 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證定量回收率測(cè)定實(shí)驗(yàn) 在建立供試品的細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)方法或原法的檢驗(yàn)條件有改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，應(yīng)對(duì)檢查法的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證時(shí)做規(guī)定菌的回收試驗(yàn)，以判斷供試品是否具有抗菌活性的實(shí)驗(yàn)方法。驗(yàn)證用菌株 細(xì)菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證用菌株： 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證 白色念珠菌、黑曲霉取培養(yǎng)物用無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液稀釋成含 50100cfu/ml的菌液。 要求驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)應(yīng)獨(dú)立平行進(jìn)行3次，分別計(jì)

38、算各次試驗(yàn)菌的回收率。具體方法1)試驗(yàn)組2)菌液組3)稀釋劑對(duì)照組4)供試品對(duì)照組平皿法計(jì)數(shù)時(shí)，取試驗(yàn)可能用的最低稀釋級(jí)供試液1ml和50100cfu試驗(yàn)菌，分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌數(shù)。薄膜過(guò)濾法計(jì)數(shù)時(shí)，取規(guī)定量試驗(yàn)可能用的最低稀釋級(jí)供試液，過(guò)濾，沖洗，應(yīng)在最后一次的沖洗液中加入50100cfu試驗(yàn)菌，過(guò)濾，按薄膜過(guò)濾法測(cè)定其菌數(shù)。測(cè)定所加的試驗(yàn)菌數(shù)若供試液制備需要分散、乳化，中和、離心或薄膜過(guò)濾等特殊處理時(shí)，應(yīng)增加稀釋劑對(duì)照組，以考察供試液制備過(guò)程中微生物受影響的程度。試驗(yàn)時(shí)，可用相應(yīng)的稀釋液替代供試品，加入試驗(yàn)菌，使最終菌濃度為每1m

39、l 供試液含50100cfu，按試驗(yàn)組的供試液制備方法和菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定其菌數(shù)。取規(guī)定量供試液，按菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定供試品本底菌數(shù)?；厥章实挠?jì)算 試驗(yàn)組的菌回收率 稀釋劑對(duì)照組的菌回收率 結(jié)果判斷指標(biāo) 在3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中，稀釋劑對(duì)照組的菌回收率應(yīng)均不低于70%。若試驗(yàn)組的菌回收率均不低于70%，按此該供試液制備方法和計(jì)數(shù)法測(cè)定供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)。若任一次試驗(yàn)中試驗(yàn)組的菌回收率低于70%，應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過(guò)濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新驗(yàn)證。常規(guī)法 供試液的常規(guī)制備方法： 10g(ml)樣品加氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml,

40、 制成1：10供試液常規(guī)菌落計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證過(guò)程試驗(yàn)組：取1：10供試液1ml和菌液1ml （50100cfu試驗(yàn)菌），分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌數(shù)。菌液組：取菌液1ml注入平皿中，傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌數(shù)。供試品對(duì)照組：取1：10供試液1ml注入平皿中，傾注瓊脂培養(yǎng)基，平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌數(shù)。結(jié)果判斷計(jì)算試驗(yàn)組的菌回收率，若三次平行試驗(yàn)各個(gè)試驗(yàn)菌的回收率均不低于70%，按常規(guī)法測(cè)定供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)。若任一次試驗(yàn)中試驗(yàn)組的菌回收率低于70%，應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄

41、膜過(guò)濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新驗(yàn)證。 培養(yǎng)基稀釋法取規(guī)定量的供試液，加至較大量的培養(yǎng)基中，使單位體積內(nèi)的供試品含量減少至不具抑菌作用。1ml供試液可等量分注多個(gè)平皿。培養(yǎng)基稀釋法適用于抑菌作用不強(qiáng)的制劑。在采用培養(yǎng)基稀釋法時(shí)，應(yīng)注意避免在注皿前菌液和供試液直接接觸實(shí)驗(yàn)組（皿；皿）每一平皿均應(yīng)加1ml菌液。以1ml供試液平均分注5個(gè)平皿的方法為例說(shuō)明培養(yǎng)基稀釋法方法驗(yàn)證的過(guò)程10g(ml)樣品加氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml, 制成1：10供試液供試液制備方法為常規(guī)法，無(wú)需進(jìn)行稀釋劑對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)組：1ml 1:10的供試液等量分注5皿，平行2ml，共1

42、0皿，每皿各加1ml 菌液。計(jì)算每皿平均菌數(shù)（A）供試品組（本底組）：1ml 1:10的供試液等量分注5皿，平行2ml，共10皿。計(jì)算每皿平均菌數(shù)（B）菌液組：每皿加入1ml菌液，平行2皿。計(jì)算每皿平均菌數(shù)（C）回收率：（A-B）/C*100結(jié)果判斷：計(jì)算試驗(yàn)組的菌回收率，若三次平行試驗(yàn)各個(gè)試驗(yàn)菌的回收率均不低于70%，按培養(yǎng)基稀釋法測(cè)定供試品的細(xì)菌數(shù)（或霉菌及酵母菌數(shù)）。若任一次試驗(yàn)中試驗(yàn)組的菌回收率低于70%，應(yīng)采用其他方法，如薄膜過(guò)濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新驗(yàn)證。離心沉淀集菌法 1：10供試液的制備：10g樣品加氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，混勻

43、，低速離心（500rpm離5分鐘）去渣，取上清10ml高速離心（3000rpm離20分鐘），離心后不要震搖離心管（一般用10 ml帶有刻度的離心管），用注射器或吸管（注意不要插到2ml刻度以下）吸取上面的8 ml棄去，再加 8ml稀釋液補(bǔ)充到10 ml，混勻。試驗(yàn)組：取1：10供試液1ml和菌液1ml （50100cfu試驗(yàn)菌），分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌數(shù)。菌液組：取菌液1ml注入平皿中，傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌數(shù)。供試品對(duì)照組：取1：10供試液1ml注入平皿中，傾注瓊脂培養(yǎng)基，平行制備2個(gè)平皿，按平皿

44、法測(cè)定其菌數(shù)。稀釋劑對(duì)照組： 取含菌稀釋液（含菌濃度為50100cfu /ml）代替供試品，經(jīng)過(guò)低速離心后轉(zhuǎn)移含菌稀釋液至另一離心管中，高速離心后，用與制備供試液相同的方法吸取離心管上層8ml液體，再加 8ml稀釋液補(bǔ)充到10 ml，混勻。取此液體1ml注入平皿中，傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌數(shù)。 要保證稀釋劑對(duì)照組的操作過(guò)程與實(shí)驗(yàn)組完全相同！不建議使用離心沉淀集菌法操作過(guò)程不小心極易造成菌體損失，使回收率降低。某些沉降系數(shù)低的細(xì)菌可能被漏檢，而驗(yàn)證試驗(yàn)無(wú)法對(duì)其驗(yàn)證。對(duì)某些抑菌性不強(qiáng)的樣品建議采用培養(yǎng)基稀釋法。薄膜過(guò)濾法供試品對(duì)照組：取規(guī)定量供試品，相當(dāng)于供試品

45、1g或1ml，如1：10供試液取10ml, 過(guò)濾，沖洗（確定沖洗量），取出濾膜，菌液面朝上貼在對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基上，按薄膜過(guò)濾法測(cè)定其菌數(shù)。試驗(yàn)組：過(guò)濾量，沖洗量同供試品對(duì)照組，在最后一次的沖洗液中加入50100cfu試驗(yàn)菌，過(guò)濾，按薄膜過(guò)濾法測(cè)定其菌數(shù)。菌液組：取菌液1ml注入平皿中，傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌數(shù)。稀釋劑對(duì)照組：稀釋液+1ml菌液混勻，過(guò)濾，沖洗（沖洗量及沖洗方法同試驗(yàn)組） ，取出濾膜，按薄膜過(guò)濾法測(cè)定其菌數(shù)。 注意：如回收率仍達(dá)不到70%，首先考慮增加沖洗量，少量多次沖洗，不局限于藥典所說(shuō)的每次沖洗100ml。可將待過(guò)濾的樣品稀釋至大量稀釋液中（如

46、: 500ml, 多少量需在驗(yàn)證資料中注明）再進(jìn)行過(guò)濾，這樣可以減少膜對(duì)樣品抑菌成分的吸附。沖洗速度不易過(guò)快，沖洗量不易過(guò)大。可與離心沉淀集菌法，中和法等方法聯(lián)用。 其他消除抑菌效果的方法-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素 -內(nèi)酰胺酶奎諾酮類(lèi)抗生素 4 當(dāng)最低稀釋級(jí)的供試液含有抑菌活性，且采用上述消除抑菌活性的方法后試驗(yàn)菌的回收率還無(wú)法達(dá)到計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證的要求時(shí)，根據(jù)供試品的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)和菌數(shù)報(bào)告規(guī)則，在不影響檢驗(yàn)結(jié)果判斷的前提下，可采用高一稀釋級(jí)的供試液重新進(jìn)行回收率的測(cè)定。若試驗(yàn)菌的回收率符合計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證的要求，那么，進(jìn)行供試品細(xì)菌計(jì)數(shù)或霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)時(shí)，應(yīng)以該稀釋級(jí)供試液作為最低稀釋級(jí)的供試液 （中國(guó)藥

47、典2006 增補(bǔ)本擬增訂內(nèi)容）控制菌檢查方法驗(yàn)證定性能否生長(zhǎng)、專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn)樣品給藥途徑和類(lèi)型決定何種控制菌檢查驗(yàn)證一般口服制劑驗(yàn)證大腸埃希菌外用制劑驗(yàn)證金葡和銅綠含藥材原粉；含豆豉、神曲等發(fā)酵成分的制劑的大腸菌群檢查驗(yàn)證 試驗(yàn)菌株按規(guī)定檢查的控制菌選擇相應(yīng)驗(yàn)證的菌株。大腸菌群檢查用大腸埃希菌梭菌檢查用生孢梭菌。菌種的要求：不得超過(guò)5代。菌液制備為10100cfu/ml。取規(guī)定量供試液及10100cfu試驗(yàn)菌加入增菌培養(yǎng)基中，依相應(yīng)控制菌檢查法進(jìn)行檢查。當(dāng)采用薄膜過(guò)濾法時(shí)，取規(guī)定量供試液，過(guò)濾，沖洗，試驗(yàn)菌應(yīng)加在最后一次沖洗液中，過(guò)濾后，注入培養(yǎng)基或取出濾膜接入增菌培養(yǎng)基中。設(shè)立陰性菌對(duì)照組是為了

48、驗(yàn)證該控制菌檢查方法的特異性，方法同試驗(yàn)組。陰性對(duì)照菌不得檢出。 控制菌陰性對(duì)照菌株大腸埃希菌金黃色葡萄球菌大腸菌群沙門(mén)菌金黃色葡萄球菌大腸埃希菌銅綠假單胞菌梭菌結(jié)果判斷 陰性菌對(duì)照組不得檢出陰性對(duì)照菌。若試驗(yàn)組檢出試驗(yàn)菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法進(jìn)行供試品的該控制菌檢查。試驗(yàn)組未檢出試驗(yàn)菌，應(yīng)采用稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過(guò)濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新驗(yàn)證。驗(yàn)證試驗(yàn)可與供試品的控制菌檢查同時(shí)進(jìn)行例1大腸菌群檢查法的驗(yàn)證試驗(yàn)組：取1：10供試液1ml及10100cfu大腸埃希菌加入乳糖膽鹽發(fā)酵管，361培養(yǎng)1824h。陰性菌對(duì)照組：取1：10供試液1

49、ml及10100cfu金黃色葡萄球菌加入乳糖膽鹽發(fā)酵管，361培養(yǎng)1824h。結(jié)果判斷：大腸菌群在乳糖膽鹽發(fā)酵管中生長(zhǎng)，表現(xiàn)為產(chǎn)酸產(chǎn)氣。產(chǎn)酸使培養(yǎng)基顏色發(fā)生改變，一般由紫色變?yōu)辄S色；產(chǎn)氣可在倒管中出現(xiàn)氣泡。如果陰性菌對(duì)照組發(fā)酵管未見(jiàn)產(chǎn)酸產(chǎn)氣，試驗(yàn)組發(fā)酵管產(chǎn)酸產(chǎn)氣，按此法進(jìn)行供試品的大腸菌群檢查。說(shuō)明進(jìn)行大腸菌群檢查時(shí)，應(yīng)取乳糖膽鹽發(fā)酵管3支，分別加入1：10供試液1ml，1:100供試液1ml，1：1000供試液1ml。而在進(jìn)行大腸菌群檢查法的驗(yàn)證時(shí)，無(wú)需對(duì)此3管的檢查一一驗(yàn)證，只驗(yàn)證加最低稀釋級(jí)供試液的發(fā)酵管的檢查即可。檢查實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的陽(yáng)性對(duì)照也只需加在加1：10供試液的發(fā)酵管中。大腸菌群檢

50、查為半定量試驗(yàn)，一般不建議使用離心沉淀集菌法。例2梭菌檢查法的驗(yàn)證1.常規(guī)法實(shí)驗(yàn)組：取1：10供試液10ml及10100cfu生孢梭菌加入100ml0.1%庖肉培養(yǎng)基，厭氧條件培養(yǎng)。當(dāng)實(shí)驗(yàn)管出現(xiàn)渾濁、產(chǎn)氣等現(xiàn)象后，取培養(yǎng)物涂布含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂平板上，厭氧條件培養(yǎng)。陰性菌對(duì)照組：取1：10供試液10ml及10100cfu大腸埃希菌加入100ml0.1%庖肉培養(yǎng)基，厭氧條件培養(yǎng)。當(dāng)實(shí)驗(yàn)管出現(xiàn)渾濁、產(chǎn)氣等現(xiàn)象后，取培養(yǎng)物涂布含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂平板上，厭氧條件培養(yǎng)。2.薄膜過(guò)濾法 實(shí)驗(yàn)組：取1：10供試液10ml薄膜過(guò)濾，沖洗，在最后一次沖洗液中加入10100cfu生孢梭菌，取出濾膜加入

51、100ml0.1%庖肉培養(yǎng)基中，厭氧條件培養(yǎng)。當(dāng)實(shí)驗(yàn)管出現(xiàn)渾濁、產(chǎn)氣等現(xiàn)象后，取培養(yǎng)物涂布含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂平板上，厭氧條件培養(yǎng)。陰性菌對(duì)照組：取1：10供試液10ml薄膜過(guò)濾，沖洗，在最后一次沖洗液中加入10100cfu大腸埃希菌，取出濾膜加入100ml0.1%庖肉培養(yǎng)基中，厭氧條件培養(yǎng)。當(dāng)實(shí)驗(yàn)管出現(xiàn)渾濁、產(chǎn)氣等現(xiàn)象后，取培養(yǎng)物涂布含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂平板上，厭氧條件培養(yǎng)。如陰性菌對(duì)照組培養(yǎng)管未出現(xiàn)渾濁、產(chǎn)氣等現(xiàn)象同時(shí)試驗(yàn)組培養(yǎng)管產(chǎn)生渾濁，可不進(jìn)行選擇性瓊脂培養(yǎng)直接判斷可用此供試液制備及梭菌檢查方法進(jìn)行本供試品的梭菌檢查 當(dāng)陰性對(duì)照組選擇性平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組選擇性平板上有菌落

52、生長(zhǎng)時(shí)，可判斷可用此供試液制備及梭菌檢查方法進(jìn)行本供試品的梭菌檢查。說(shuō)明：在進(jìn)行梭菌檢查實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)取供試液10ml 2份，其中1份置80保溫10分鐘后迅速冷卻。陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)方法同方法驗(yàn)證試驗(yàn)組，只做一份即可。如果2份供試液培養(yǎng)管在培養(yǎng)92h內(nèi)均無(wú)渾濁、產(chǎn)氣等現(xiàn)象，判供試品未檢出梭菌。總結(jié)一般的驗(yàn)證過(guò)程：第一步：常規(guī)法第二步：培養(yǎng)基稀釋法第三步：薄膜過(guò)濾法在計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證時(shí)先用常規(guī)法對(duì)5種實(shí)驗(yàn)菌進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，如果某個(gè)或某些菌的回收率達(dá)不到70%，繼續(xù)用它驗(yàn)證下一步的實(shí)驗(yàn)方法。直到它的回收率達(dá)到70%以上。這時(shí)再用5種菌進(jìn)行平行試驗(yàn)。菌種保藏方法各種微生物由于遺傳特性不同，因此適合采用的保藏方法也不一

53、樣。一種良好的有效保藏方法，首先應(yīng)能保持原菌種的優(yōu)良性狀長(zhǎng)期不變，同時(shí)還須考慮方法的通用性、操作的簡(jiǎn)便性和設(shè)備的普及性。 斜面低溫保藏法 石蠟油封藏法 砂土管保藏法 麩皮保藏法 甘油懸液保藏法 冷凍真空干燥保藏法 液氮超低溫保藏法（一）斜面低溫保藏法常用保藏法將菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，待菌種生長(zhǎng)完全后，置于4左右的冰箱中保藏，每隔一定時(shí)間（保藏期）再轉(zhuǎn)接至新的斜面培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)后繼續(xù)保藏，如此連續(xù)不斷。此法廣泛適用于各大類(lèi)微生物菌種的短期保藏.此法的主要保藏措施是低溫。一般可保存16個(gè)月左右。優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便易行，容易推廣，存活率高；缺點(diǎn)是菌株仍有一定程度的代謝活動(dòng)能力，保藏期短，傳代次數(shù)多，

54、菌種較容易發(fā)生變異和被污染。（二）石蠟油封藏法此法是在無(wú)菌條件下，將滅過(guò)菌并已蒸發(fā)掉水分的液體石蠟倒入培養(yǎng)成熟的菌種斜面（或半固體穿刺培養(yǎng)物）上，石蠟油層高出斜面頂端1cm，使培養(yǎng)物與空氣隔絕， 加硅膠塞并用固體石蠟封口后，垂直放在室溫或4冰箱內(nèi)保藏。此法的主要保藏措施是低溫、阻氧。一般可保存12年左右。（三）冷凍真空干燥保藏法又稱(chēng)冷凍干燥保藏法，簡(jiǎn)稱(chēng)凍干法。它通常是用保護(hù)劑制備擬保藏菌種的細(xì)胞懸液或孢子懸液于安瓿管中，再在低溫下快速將含菌樣凍結(jié)，并減壓抽真空，使水升華將樣品脫水干燥，形成完全干燥的固體菌塊。并在真空條件下立即熔封，造成無(wú)氧真空環(huán)境，最后置于低溫下，使微生物處于休眠狀態(tài)，而得以

55、長(zhǎng)期保藏。此法適用于各大類(lèi)微生物。此法的主要保藏措施是低溫、干燥、缺氧、有保護(hù)劑， 保藏期一般長(zhǎng)達(dá)515年，存活率高，變異率低，是目前 被廣泛采用的一種較理想的保藏方法。該法操作比較煩瑣，技術(shù)要求較高，且需要凍干機(jī)等設(shè) 備。（四）液氮超低溫保藏法簡(jiǎn)稱(chēng)液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亞砜等作為保護(hù)劑，在液氮超低溫（196）下保藏的方法。其主要原理是菌種細(xì)胞從常溫過(guò)渡到低溫，并在降到低溫之前，使細(xì)胞內(nèi)的自由水通過(guò)細(xì)胞膜外滲出來(lái)，以免膜內(nèi)因自由水凝結(jié)成冰晶而使細(xì)胞損傷。此法適用于各種微生物菌種的保藏。此法的主要保藏措施是超低溫、有保護(hù)劑，保藏期一般可達(dá)到15年以上，是目前公認(rèn)的最有效的菌種長(zhǎng)期

56、保藏技術(shù)之一。此法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便、高效，且可使用各種培養(yǎng)形式的微生物進(jìn)行保藏。其缺點(diǎn)是需購(gòu)置超低溫液氮設(shè)備，且液氮消耗較多，操作費(fèi)用較高。菌種的保藏條件及時(shí)間菌種培養(yǎng)基保存條件及時(shí)間大腸埃希菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基4 6 保存2 3個(gè)月金黃色葡萄球菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基4 6 保存2 3個(gè)月枯草芽孢桿營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基4 6 保存3 6個(gè)月銅綠假單胞菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基室溫沙門(mén)菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基4 6 保存2 3個(gè)月生孢梭菌硫乙醇酸鹽培基46 保存6個(gè)月以上白色念珠菌改良馬丁培養(yǎng)基4 6 保存4 6個(gè)月黑曲霉改良馬丁培養(yǎng)基4 6 保存4 個(gè)月2005版中國(guó)藥典細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)及方法建立2006年6月山東省藥品檢驗(yàn)所1

57、39細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)的方法學(xué)驗(yàn)證概述方法的建立與驗(yàn)證關(guān)鍵點(diǎn)驗(yàn)證中常見(jiàn)的問(wèn)題附：中外藥典細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法收載 及修訂情況 細(xì)菌內(nèi)毒素概述 前言 細(xì)菌內(nèi)毒素一、前言 自20世紀(jì)60年代鱟血凝集機(jī)制的發(fā)現(xiàn)和鱟實(shí)驗(yàn)方法的建立以來(lái)，引起了各國(guó)藥政管理部門(mén)的極大興趣，并使細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法在藥品的熱原限量控制中得到了廣泛的應(yīng)用和發(fā)展。尤其是與家兔熱原法相比，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法具有勞動(dòng)強(qiáng)度低，實(shí)驗(yàn)成本小等特點(diǎn)，還可以通過(guò)對(duì)原料、活性成分、滅菌水、容器、賦形劑和終產(chǎn)品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)，對(duì)生產(chǎn)過(guò)程進(jìn)行質(zhì)控，更明顯的特點(diǎn)是可以定量檢測(cè)藥品生產(chǎn)過(guò)程中可能污染的痕量?jī)?nèi)毒素，并且為區(qū)分干擾作用與內(nèi)毒素污染提供了極為重要的技

58、術(shù)手段。 二、細(xì)菌內(nèi)毒素 1 細(xì)菌內(nèi)毒素與熱原的關(guān)系 注射給藥過(guò)程中，偶爾會(huì)出現(xiàn)發(fā)熱、寒戰(zhàn)、頭痛、惡心、嘔吐等癥狀，嚴(yán)重的甚至昏迷、死亡，將這種藥物的不良反應(yīng)稱(chēng)之為熱原反應(yīng)，能引起上述熱原反應(yīng)的物質(zhì)被稱(chēng)之為熱原（Pyrogen）。 熱原與內(nèi)毒素的關(guān)系在學(xué)術(shù)上仍有爭(zhēng)論，但目前認(rèn)為，在GMP的條件下，內(nèi)毒素是主要的熱原物質(zhì)，可以說(shuō)無(wú)內(nèi)毒素就無(wú)熱原，控制細(xì)菌內(nèi)毒素就控制熱原物質(zhì)。 這也正是鱟試劑用于藥物生產(chǎn)過(guò)程或藥物成品熱原檢測(cè)的基礎(chǔ)。 過(guò)去一直認(rèn)為細(xì)菌內(nèi)毒素來(lái)源于革蘭陰性細(xì)菌，但最近發(fā)現(xiàn)存在革蘭陰性菌來(lái)源的不具有內(nèi)毒素毒性的革蘭陰性細(xì)菌脂多糖（LPS）結(jié)構(gòu)。因此，目前認(rèn)為所有內(nèi)毒素均為脂多糖，但非

59、所有的脂多糖均為內(nèi)毒素。2 鱟試劑反應(yīng)機(jī)制參與鱟血細(xì)胞凝集的成分是細(xì)菌內(nèi)毒素的C因子、B因子、G因子、凝固酶原和凝固蛋白原。G因子激活的鱟試劑激活旁路，鱟試劑中的G因子可以被真菌、酵母和藻類(lèi)細(xì)胞壁中另一類(lèi)細(xì)菌多糖-（1，3）-D-葡聚糖激活，因此鱟試劑同內(nèi)毒素的反應(yīng)不是特異的。LPS不能激活G因子旁路。但是，鱟試劑同葡聚糖的反應(yīng)與鱟試劑同內(nèi)毒素的反應(yīng)敏感性是不一致的。有實(shí)驗(yàn)表明不同的鱟試劑在檢測(cè)葡聚糖和內(nèi)毒素上存在很大的差異，鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)更靈敏。 盡管與鱟試劑反應(yīng)的物質(zhì)不完全是內(nèi)毒素， 但目前作為鱟實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)的兩個(gè)原則仍是：1、內(nèi)毒素活性與熱原性相關(guān)，家兔和鱟實(shí)驗(yàn)作為人類(lèi)發(fā)熱和炎癥反應(yīng)的

60、預(yù)測(cè)方法是相關(guān)的。2、在注射劑GMP生產(chǎn)環(huán)境下，不存在內(nèi)毒素也就意味著不存在主要的熱原物質(zhì)。盡管 存在少數(shù)例外，但依然可以使用。C因子活化的C因子內(nèi)毒素活化的B因子B因子凝固酶凝固酶原凝固蛋白（凝膠）凝固蛋白原(1,3)-D-葡聚糖或LAL-RM活化的G因子（旁路反應(yīng)）G因子抗LPS因子凝膠法鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)機(jī)理 復(fù)雜的酶促反應(yīng)過(guò)程3 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品我國(guó)內(nèi)毒素參考標(biāo)準(zhǔn)品無(wú)論是在賦形劑的選擇，還是標(biāo)定標(biāo)準(zhǔn)和方法的使用上均與國(guó)際參考標(biāo)準(zhǔn)品取得了一致。 4 鱟試劑凝膠反應(yīng)的特征 隨著鱟試劑反應(yīng)的進(jìn)行，凝固蛋白不斷增加，伴隨凝聚的形成，光密度也會(huì)增加。內(nèi)毒素的濃度決定了光密度增加的速率。凝膠形成