5.7雙水相萃取解析課件

1、第七節(jié) 雙水相萃取萃取新技術(shù)之一、概述 雙水相萃取（Two-aqueous phase extraction）又稱水溶液兩相分配技術(shù)（Partion of two aqueous phase system）是近年來(lái)出現(xiàn)的引人注目、極有前途的新型分離技術(shù)。 其特點(diǎn)是能夠保留產(chǎn)物的活性，操作可連續(xù)化，能耗低，處理容量大。雙水相萃取現(xiàn)象最早是1896年由Beijerinck在瓊脂與可溶性淀粉或明膠混合時(shí)發(fā)現(xiàn)的，被稱為“聚合物的不相溶性”。20世紀(jì)60年代瑞典Lund大學(xué)的Albertsson P A及其同事們最先提出雙水相萃取技術(shù)并做了大量工作。1989年Diamond等推導(dǎo)出生物分子在雙水相體系中

2、的分配模型，但尚有局限。由于成本方面的原因，雙水相萃取技術(shù)上的優(yōu)勢(shì)被削弱，真正工業(yè)化的例子很少。70年代中期西德的Kula M R和Kroner K H等人首先將雙水相系統(tǒng)應(yīng)用于從細(xì)胞勻漿液中提取酶和蛋白質(zhì)，大大改善了胞內(nèi)酶的提取效果。二、雙水相體系的形成 典型的例子如在水溶液中的聚乙二醇（PEG）和葡聚糖（DEX），各溶質(zhì)均為低濃度時(shí)，可得到單相勻質(zhì)液體；當(dāng)溶質(zhì)濃度增加時(shí)，溶液變得渾濁，靜止形成雙液層：上層富集PEG，下層富集葡聚糖。 葡聚糖本質(zhì)上是一種幾乎不能形成偶極現(xiàn)象的球形分子，而PEG是一種具有共享電子對(duì)的高密度直鏈聚合物。各個(gè)聚合物分子都傾向于在其周圍有相同形狀、大小和極性的分子，

3、同時(shí)，由于不同類型分子間的斥力大于同它們的親水性有關(guān)的相互吸引力，因此聚合物發(fā)生分離，形成二個(gè)不同的相，這就是所謂的“聚合物不相溶性”。三、雙水相系統(tǒng)的重要特征兩相的黏度：萃取相在210mPa.s范圍內(nèi)，而發(fā)酵液勻漿相在10010000mPa.s 范圍內(nèi)。雙水相系統(tǒng)呈現(xiàn)出低的界面張力。四、雙水相體系的類型聚丙二醇聚乙二醇、聚乙烯醇、葡聚糖、羥丙基葡聚糖聚乙二醇聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖、聚蔗糖硫酸葡聚糖鈉鹽羧基甲基葡聚糖鈉鹽聚丙烯乙二醇甲基纖維素羧甲基葡聚糖鈉鹽羧甲基纖維素鈉鹽聚乙二醇磷酸鉀、硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鎂、酒石酸鉀鈉表1 幾種典型雙水相體系五、雙水相萃取的理論基礎(chǔ)相平衡關(guān)系圖1

4、 PEG/DEX體系相圖生物大分子在兩相中的分配仍服從分配定律。 物質(zhì)在兩相中的分配六、雙水相系統(tǒng)中物質(zhì)分配的影響因素系統(tǒng)聚合物組成系統(tǒng)物化性質(zhì)鹽及緩沖液溫度 當(dāng)兩種不同聚合物的溶液混合時(shí)，可能存在三種情況： 完全混溶性（勻相溶液）； 物理的不相溶性（相分離）； 復(fù)雜的凝聚（相分離）。 1、雙水相中聚合物組成的影響eg. 離子和非離子型聚合物都可使用在雙水相系統(tǒng)的構(gòu)成上，但當(dāng)這兩種聚合物是離子化合物并帶有相反電荷時(shí)，它們相互吸引并發(fā)生復(fù)雜的凝聚。圖2 200C聚乙二醇4000/葡聚糖系統(tǒng)雙節(jié)點(diǎn)曲線， 比較三種不同類型的葡聚糖 雖然葡聚糖T500和水解過(guò)的葡聚糖相對(duì)分子量在同一數(shù)量級(jí)，但二者的雙

5、節(jié)線離得遠(yuǎn)，這種差別是由于聚合度分布性效應(yīng)造成的。蛋白質(zhì)相對(duì)分子量葡聚糖組成葡聚糖40葡聚糖70葡聚糖220葡聚糖500葡聚糖2000細(xì)胞色素123840.18 0.140.150.170.21牛血清蛋白690000.180.230.310.340.41乳酸脫氫酶1400000.060.050.090.160.10過(guò)氧化氫酶2500000.110.230.400.791.15磷酸果糖 激酶8000000.010.010.010.020.03表2 葡聚糖分子對(duì)不同相對(duì)分子量蛋白質(zhì)分配系數(shù)的影響蛋白質(zhì)相對(duì)分子量體系的組成D-500（9%）/P-4000(7.1%)D-500（8%）/P-6000

6、(6%)D-500（8%）/P-20000(6%)D-500（8%）/P-40000(6%)細(xì)胞色素123840.170.170.130.12牛血清蛋白690000.520.340.140.11乳酸脫氫酶1400000.130.080.050.03過(guò)氧化氫酶2500000.820.380.160.10表3 PEG分子對(duì)不同相對(duì)分子量蛋白質(zhì)分配系數(shù)的影響 由表2、表3可見(jiàn)，蛋白質(zhì)的分配系數(shù)隨著葡聚糖相對(duì)分子量的增加而增加，隨著PEG相對(duì)分子量的增加而降低。 葡聚糖也可由其他多糖代替，可得到類似的結(jié)果，如右圖所示。 圖4 200C聚乙二醇/羥丙基淀粉和聚乙二醇/葡聚糖系統(tǒng)的相圖2、雙水相系統(tǒng)物理化

7、學(xué)性質(zhì)的影響 雙水相系統(tǒng)的性質(zhì)主要取決于下列物理參數(shù)：密度（）和兩相間密度差、黏度（）和兩相間黏度差、表面張力（）。PEG/質(zhì)量分?jǐn)?shù)%Dextran/質(zhì)量分?jǐn)?shù)%界面寬度/質(zhì)量分?jǐn)?shù)%VT/VB/(Kg/m3) /(mPa.s) g/(mPa.s) /(mN/m)6.05.86.21.5184.1430.3*10-26.56.110.51.4323.61000.12*10-28.07.619.81.7644.33.32.0*10-29.08.524.81.9794.43644.1*10-2表4 聚乙二醇4000/葡聚糖PL500系統(tǒng)的物理化學(xué)常數(shù)eg. PEG-(NH4)2SO4雙水相系統(tǒng)萃取糖化

8、酶 (NH4)2SO4濃度固定不變時(shí)，增加PEG400的濃度有利于酶在上相的分配，當(dāng)PEG400濃度在2527%時(shí)，分配系數(shù)高達(dá)47.3，濃度過(guò)高則不利于酶的分配。 PEG400濃度固定為26%時(shí)，增加(NH4)2SO4濃度，糖化酶的分配系數(shù)也增大。 (NH4)2SO4的最適濃度為16%。酵母菌存在下肺炎克雷氏菌存在下圖5 細(xì)胞物質(zhì)濃度對(duì)酶分配的影響3、鹽和緩沖液的影響 水溶液中存在的離子會(huì)影響溶質(zhì)在兩相間的分配。因?yàn)殛庩?yáng)離子的不均勻分配會(huì)產(chǎn)生相界面電位，影響蛋白質(zhì)、核酸等荷電大分子的分配。通常增加鹽濃度可提高酶的分配系數(shù)。圖6 聚乙二醇4000/硫酸銨系統(tǒng)中，支鏈淀粉酶的分配系數(shù)與硫酸銨總濃

9、度的關(guān)系 eg. 在PEG-DEX系統(tǒng)中加入NaClO4或KI，能增加上相對(duì)帶正電物質(zhì)的親和效應(yīng)，并迫使帶負(fù)電物質(zhì)進(jìn)入下相；若加入Li3PO4，則與上述效應(yīng)剛好相反。 因此，只要設(shè)法改變界面電位，就能控制蛋白質(zhì)等荷電大分子轉(zhuǎn)入某一相。圖7 聚乙二醇葡聚糖系統(tǒng)中支鏈淀粉酶的分配與pH值的關(guān)系4、溫度的影響 溫度的變化雖然影響液相物理性質(zhì)的變化，從而影響溶質(zhì)在兩相間的分配，但總的來(lái)說(shuō)，影響不敏感。圖8 不同溫度下葡聚糖500/聚乙二醇6000/水系統(tǒng)相圖七、雙水相系統(tǒng)的應(yīng)用食品工業(yè)生物行業(yè)表5 雙水相萃取在生物分離中的應(yīng)用酶的提取和純化 菌體酶雙水相組成細(xì)胞濃度/%分配系數(shù)收率/%Candida

10、Boidinii過(guò)氧化氫酶PEG-粗Dex202.9581Saccharomgces Cerevisine已糖激酶PEG/鹽308.292Escherichia Coli天冬氨酸酶PEG1550/磷酸鉀鹽255.796表6 從破碎的細(xì)胞中萃取分離酶7細(xì)胞組織的分離 用三甲胺PEG/ Dextran 體系可分離含膽堿受體的細(xì)胞；病毒的純化： 用PEG/ NaDS 體系可對(duì)脊髓病毒和腺病毒進(jìn)行純化,回收率可達(dá)90%生長(zhǎng)激素的純化：用PEG/ 鹽體系可提純?nèi)说纳L(zhǎng)激素,回收率Y= 60%；干擾素的分離： 用PEG- 磷酸酯/ 鹽體系分離- 干擾素, Y= 97 %; 從重組大腸桿菌勻漿中提取- 干擾

11、素, Y= 99.15 % ,純度提高25 倍生物小分子物質(zhì)的分離： 雙水相體系萃取分離技術(shù)對(duì)青霉素G鈉鹽等生物小分子物質(zhì)的分離也可以取得理想效果；藥物的分離和提純： 如基因工程藥物、抗菌素、動(dòng)、植物藥物的提取，也可以利用該技術(shù)開(kāi)發(fā)我國(guó)傳統(tǒng)的中草藥； 在分析檢測(cè)中的應(yīng)用：液- 液分配層析(LL PC) 將一種聚合物連接在固體顆粒(支持物) 上，另一種聚合物的溶液作為流動(dòng)相，這種柱層析技術(shù)可分離蛋白質(zhì)、核酸以及細(xì)胞混合物。食品工業(yè)中用來(lái)從酸水解產(chǎn)物中提取風(fēng)味物質(zhì)： 二肽、氨基酸、核苷酸等八、雙水相萃取的工藝流程目的產(chǎn)物的萃取PEG的循環(huán)無(wú)機(jī)鹽的循環(huán)連續(xù)錯(cuò)流萃取回收酶的流程圖九、成相聚合物的回收膜

12、處理沉淀離子交換和吸附電泳或親和分配和雙水相萃取相結(jié)合蛋白質(zhì)分配在鹽相：鹽可用錯(cuò)流操作方式下，用超濾或滲析等膜過(guò)濾回收；蛋白質(zhì)積聚在PEG中：加入鹽使蛋白質(zhì)重新分配到鹽相中。PEG的分離同樣可用膜分離來(lái)實(shí)現(xiàn)。十、雙水相萃取技術(shù)的進(jìn)展1、廉價(jià)雙水相體系的開(kāi)發(fā)體系優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)PEG/DEX鹽濃度低，活性損失小價(jià)格貴，黏度大，分相困難PEG/鹽成本低，黏度小鹽濃度高，活性損失大，界面吸附多表6 兩種雙水相體系的比較 可見(jiàn)，高聚物-高聚物體系對(duì)活性物質(zhì)變性作用小，界面吸附少，但價(jià)格高。因而尋找廉價(jià)的高聚物-高聚物體系是雙水相萃取技術(shù)發(fā)展的一個(gè)重要方向。 目前比較成功的是用變性淀粉PPT代替昂貴的DEX。P

13、PT-PEG體系已被用于從發(fā)酵液中分離過(guò)氧化氫酶、 -半乳糖苷酶等。該體系具有很多優(yōu)點(diǎn)：比PEG-鹽體系穩(wěn)定，與PEG-DEX體系相圖相似；蛋白質(zhì)溶解度大；黏度??；價(jià)格便宜。2、雙水相萃取技術(shù)同其他分離技術(shù)結(jié)合 . 雙水相體系同生物轉(zhuǎn)化相結(jié)合圖10 利用雙水相體系將木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為乙醇流程利用葡萄糖和淀粉生產(chǎn)乙醇；利用葡萄糖生產(chǎn)丙酮丁醇；利用淀粉和纖維素水解生產(chǎn)葡萄糖；水解酪蛋白；發(fā)酵生產(chǎn)乳酸；將青霉素G轉(zhuǎn)化為氨基青霉烷酸等. 雙水相萃取技術(shù)同膜分離技術(shù)相合萃取物內(nèi)側(cè)流體外側(cè)流體分配系數(shù)內(nèi)側(cè)流速/cm.s外側(cè)流速/cm.s傳質(zhì)系數(shù)/cm/s細(xì)胞色素C磷酸鹽PEG0.1816.36.65.5*10-6肌紅蛋白 磷酸鹽PEG0.0094.05.07.5*10-7尿激酶磷酸鹽PEG0.6516.35.02.0*10-4表7 雙水相萃取同膜分離結(jié)合的例子 . 雙水相萃取同親和層析相結(jié)合 在PEG或DEX上接上一定的親和配基，這樣不但使體系具有雙水相處理量大的特點(diǎn)，而且具有親和層析專一性高的特點(diǎn)。親和配基親和雙水相親和層析收率%處理量u/ml染料濃度umol.m收率%處理量