重金屬對(duì)微生物毒性效應(yīng)研究-供參考

1、武漢工業(yè)學(xué)院畢業(yè)論文論文題目：重金屬對(duì)微生物毒性效應(yīng)研究姓 名 學(xué) 號(hào) 院 系化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院 專 業(yè) 環(huán)境工程 指導(dǎo)教師 2010年5月15日目 錄中文摘要.英文摘要.1.前言.11.1 重金屬對(duì)微生物毒性研究現(xiàn)狀.11.2 本實(shí)驗(yàn)研究的目的和意義.32大腸桿菌、熒光假單胞菌和枯草芽孢桿菌的簡(jiǎn)介 .42.1 大腸桿菌的簡(jiǎn)介.42.2 熒光假單胞菌的簡(jiǎn)介.42.3 枯草芽孢桿菌的簡(jiǎn)介.53汞，鉻，鎘，鉛對(duì)大腸桿菌，熒光假單胞菌，枯草芽孢桿菌毒性的實(shí)驗(yàn)研究.73.1 細(xì)菌在重金屬污染下存活數(shù)量.73.1.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器.73.1.2 實(shí)驗(yàn)步驟.73.1.3 結(jié)果與分析.73.2 細(xì)菌在受到

2、重金屬污染后在細(xì)胞水平上的研究.93.2.1實(shí)驗(yàn)材料和儀器.93.2.2 實(shí)驗(yàn)步驟.93.2.3 結(jié)果與分析.103.3 單細(xì)胞凝膠實(shí)驗(yàn).123.3.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器.123.3.2 實(shí)驗(yàn)步驟.123.3.3 結(jié)果與分析.134微生物和重金屬相互作用的應(yīng)用范圍及發(fā)展前景.154.1 微生物和重金屬相互作用的應(yīng)用范圍.154.1.1 重金屬污染的微生物學(xué)評(píng)價(jià).154.1.2 微生物在環(huán)境保護(hù)中的應(yīng)用.154.2 重金屬和微生物相互作用的發(fā)展前景.16謝辭.17參考文獻(xiàn). 18摘 要微生物不僅種類繁多，數(shù)量極大，分布廣泛，而且具有繁殖迅速，個(gè)體微小，比表面積大，對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)等特點(diǎn)，因而成為人

3、類最寶貴、最具開發(fā)潛力的資源庫(kù)之一。作為分解者，微生物在地球生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)過(guò)程中起著“天然環(huán)境衛(wèi)士”的作用。眾所周知，重金屬不能被微生物降解并且對(duì)它們有毒害作用，本次實(shí)驗(yàn)是以四種常見的重金屬離子、對(duì)大腸桿菌、熒光假單胞菌、枯草芽孢桿菌三種細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程的毒性研究。實(shí)驗(yàn)由三個(gè)部分組成：將三種細(xì)菌在含有不同濃度的、的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通過(guò)計(jì)數(shù)的方法以確定每種金屬對(duì)大腸桿菌、熒光假單胞菌、枯草芽孢桿菌的最小致死濃度；在熒光鏡下觀察經(jīng)重金屬污染后的細(xì)胞形態(tài)與原細(xì)胞形態(tài)的區(qū)別，確定重金屬是否對(duì)細(xì)胞形態(tài)有影響；對(duì)經(jīng)重金屬污染的細(xì)菌DNA進(jìn)行單細(xì)胞凝膠實(shí)驗(yàn)，以確定重金屬是否對(duì)細(xì)菌的遺傳物質(zhì)產(chǎn)生損傷。實(shí)驗(yàn)結(jié)

4、果表明：重金屬離子對(duì)大腸桿菌、熒光假單胞菌、枯草芽孢桿菌三種細(xì)菌的最小致死濃度5、3、3；對(duì)大腸桿菌、熒光假單胞菌、枯草芽孢桿菌三種細(xì)菌的最小致死濃度為20、120、180；對(duì)大腸桿菌、熒光假單胞菌、枯草芽孢桿菌三種細(xì)菌的最小致死濃度為90、30、30；對(duì)大腸桿菌、熒光假單胞菌、枯草芽孢桿菌三種細(xì)菌的最小致死濃度為300、250、200。關(guān)鍵詞:重金屬，大腸桿菌，熒光假單胞菌，枯草芽孢桿菌，毒性AbstractThe microorganisms are not only widespread with a wide range and a great numbers; but also ha

5、ve characteristics of rapid propagation, a small individual, large surface area and a great adaptability to the environment and so on. So the microorganisms have become one of resources of the most valuable, the most potential for development. As a decomposer, microorganisms play the role of “Guardi

6、an of the natural enviroment”in the material cycle of terrestrial ecosystems.As is known to everyone, heavy metals cant be decomposed by microorganisms and have toxic effects on them. This experiment researched the toxicity of four common heavy metal ions: 、on the growth of Escherichia coli,Pseudomo

7、nas.fluorescens and Bacillus subtilis.The experiment consisted of three parts:determination of the most lethal concentration of each metal on the E.coli,P.fluorescens and B.subtilis by counting CFU method; observation of cell morphology after exposure to heavy metals by microscopy; detection of dama

8、ge of DNA by single cell gel electrophoresis.The results showed that the minimum lethal concentration of E.coli,P.fluorescens and B.subtilis were polluted by heavy metal ions is 5、3、3 ,respectively; the minimum lethal concentration of E.coli,P.fluorescens and B.subtilis were polluted by heavy metal

9、ions is 20、120、180 respectively; the minimum lethal concentration of E.coli,P.Fluorescens and B.subtilis were polluted by heavy metal ions is 90、30、50,respectively; the minimum lethal concentration of E.coli,P.Fluorescens and B.subtilis were polluted by heavy metal ions is 300、250、200， respectively.

10、Key words：heavy metal，E.coli,P.fluorescens,B.subtilis,toxicity1.前言1.1 重金屬對(duì)微生物毒性研究現(xiàn)狀重金屬污染指由 HYPERLINK /view/1208.htm t _blank 重金屬或其化合物造成的環(huán)境污染。主要由采礦、廢氣排放、污水灌溉和使用重金屬制品等人為因素所致。如日本的 HYPERLINK /view/42227.htm t _blank 水俁病和痛痛病分別由汞污染和鎘污染所引起。其危害程度取決于重金屬在環(huán)境、食品和生物體中存在的濃度和化學(xué)形態(tài)。重金屬污染是當(dāng)今世界三大水環(huán)境污染方式之一。重金屬污染物主要包括汞、

11、鉻、鉛、鋅、銅、鎳等，其種類、含量及其存在形態(tài)隨產(chǎn)生條件而異 。同時(shí)，重金屬元素中許多為生物體正常生長(zhǎng)所必需的元素，但大部分具有毒性且是致癌因子，過(guò)量排放到環(huán)境水體中容易破壞生態(tài)平衡，并通過(guò)食物鏈富集危害人類健康，因而水體的重金屬污染治理逐漸成為人們研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。重金屬一般以天然濃度廣泛存在于自然界中，但由于人類對(duì)重金屬的開采、冶煉、加工及商業(yè)制造活動(dòng)日益增多，造成不少重金屬如鉛、汞、鎘、鈷等進(jìn)入大氣、水、土壤中，引起嚴(yán)重的環(huán)境污染。以各種化學(xué)狀態(tài)或化學(xué)形態(tài)存在的重金屬，在進(jìn)入環(huán)境或生態(tài)系統(tǒng)后就會(huì)存留、積累和遷移，造成危害。如隨廢水排出的重金屬，即使?jié)舛刃?，也可在藻類和底泥中積累，被魚和貝的

12、體表吸附，產(chǎn)生食物鏈濃縮，從而造成公害。如日本的水俁病，就是因?yàn)闊龎A制造工業(yè)排放的廢水中含有汞，在經(jīng)生物作用變成有機(jī)汞后造成的；又如痛痛病，是由煉鋅工業(yè)和鎘電鍍工業(yè)所排放的鎘所致。汽車尾氣排放的鉛經(jīng)大氣擴(kuò)散等過(guò)程進(jìn)入環(huán)境中，造成目前地表鉛的濃度已有顯著提高，致使近代人體內(nèi)鉛的吸收量比原始人增加了約100倍，損害了人體健康。微生物不僅種類繁多，數(shù)量極多，分布廣泛，而且具有繁殖迅速，個(gè)體微小，比表面積大，對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)等特點(diǎn)，因而成為人類最寶貴、最具開發(fā)潛力的資源庫(kù)之一。作為分解者，微生物在地球生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)過(guò)程中起著“天然環(huán)境衛(wèi)士”的作用。它們幾乎能降解或轉(zhuǎn)化環(huán)境中存在的各種天然物質(zhì)，一旦

13、新的物質(zhì)出現(xiàn)，也能逐步通過(guò)自發(fā)或誘導(dǎo)產(chǎn)生新的酶系，具備新的代謝功能?？梢哉f(shuō)，只要找到合適的微生物并給予適宜的條件，所有的污染物都可以得到降解和轉(zhuǎn)化。眾所周知，重金屬不能被微生物降解并且對(duì)它們有毒害作用，但是微生物對(duì)重金屬又有一定的抗性和解毒作用，可以吸附和轉(zhuǎn)化重金屬。兩者間相互作用的研究可為濕法冶金、環(huán)境污染評(píng)價(jià)及生物凈化提供理論依據(jù)。近年來(lái)，正是基于微生物對(duì)重金屬的積累和解毒作用，以凈化有毒金屬污染或回收有經(jīng)濟(jì)價(jià)值重金屬為目的的生物處理技術(shù)日益成熟，微生物是現(xiàn)代工業(yè)發(fā)展的堅(jiān)強(qiáng)后盾。微生物巨大的環(huán)境保護(hù)功能(生態(tài)毒理評(píng)價(jià)和生物修復(fù))顯得越來(lái)越重要。因而研究重金屬對(duì)微生物的毒性效應(yīng)在環(huán)境工程中的

14、應(yīng)用將有著重大的意義，它是微生物應(yīng)用的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并為其應(yīng)用提供參考。已經(jīng)有很多的學(xué)者對(duì)重金屬對(duì)微生物的毒性進(jìn)行了研究。研究包括以下幾個(gè)主要方面：1)重金屬對(duì)微生物群體的影響重金屬污染能夠明顯影響土壤或水域中微生物群落，如降低微生物生物。降低活性細(xì)菌菌落的數(shù)量等等，同時(shí)重金屬污染亦能明顯影響微生物群落結(jié)構(gòu)，即微生物多樣性，已有研究表明微生物群落結(jié)構(gòu)的變化能較早地預(yù)測(cè)土壤或水域中養(yǎng)分及環(huán)境質(zhì)量的變化過(guò)程，被認(rèn)為是最具潛力的敏感性生物指標(biāo)。如王秀麗等以銅鋅冶煉廠附近的水稻土為例，研究了重金屬?gòu)?fù)合污染對(duì)土壤微生物群落的影響。結(jié)果表明，銅、鋅、鎘、鉛與微生物生物量碳、微生物生物量氮、微生物商、微生物

15、生物量氮/全氮均呈顯著負(fù)相關(guān)，重金屬污染均能降低細(xì)菌、真菌和放線菌的數(shù)量。用BILOG生態(tài)盤研究了重金屬污染對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)重金屬污染明顯影響了微生物群落結(jié)構(gòu)。2)重金屬對(duì)微生物個(gè)體的影響低濃度的重金屬可刺激微生物生長(zhǎng)，而高濃度的重金屬可抑制微生物的生長(zhǎng)繁殖，甚至導(dǎo)致微生物死亡。某些非生物學(xué)功能的金屬如Hg、Ag、Cd等在其濃度很低時(shí)即有高毒性。Hg的毒性主要表現(xiàn)為：抑制生物大分子如蛋白質(zhì)和核酸的合成，致突變效應(yīng)，停止細(xì)胞分裂，抑制生物氧化及運(yùn)動(dòng)性。Cd也具有致突變效應(yīng)，導(dǎo)致DNA鏈斷裂。Pb可造成細(xì)胞膜損傷，破壞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸。高濃度的Mn干擾細(xì)胞對(duì)的運(yùn)輸，過(guò)量的Ni抑制酵母乙醇

16、脫氫酶的活性。Hosfall總結(jié)出金屬陽(yáng)離子的毒性順序：AgHgCuCdNiCoZn，并指出這種順序可因生物種類不同而略有差異。金屬的毒性還與其自身的化學(xué)性質(zhì)和金屬硫化物的不溶性順序有關(guān)。事實(shí)上，兩者的順序非常相似，即HgAgCuPbCdZn。金屬的毒性還與其價(jià)態(tài)或配基有關(guān)。Hg相對(duì)于Hg而言毒性要大，而有機(jī)汞如甲基汞的毒性是無(wú)機(jī)汞的100多倍。As的毒性比As高200多倍，Cr毒性也高于Cr。3)重金屬對(duì)微生物的毒性機(jī)理重金屬對(duì)活的微生物作用分兩個(gè)階段進(jìn)行，第一是伴隨著離子結(jié)合和電勢(shì)增加的生化吸附，第二是離子被吸附在隨著電荷減少而發(fā)生陰性改變的細(xì)胞表面。重金屬對(duì)微生物的最重要毒性作用是使帶有

17、機(jī)能基因硫氫基的酶的失活。許多重金屬表現(xiàn)出對(duì)其他生物配位體如磷酸、嘌嶺、嘧啶和核酸的強(qiáng)烈親和力，有的還可以作為抗代謝物，或成為與細(xì)胞膜結(jié)合的物質(zhì)。現(xiàn)在隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，重金屬對(duì)微生物毒性機(jī)理的研究也已經(jīng)深入到了分子水平，而不只停留在細(xì)胞水平。關(guān)于重金屬生物中毒的分子機(jī)理，目前還未很好地弄清楚，但是從大量的生物毒性試驗(yàn)結(jié)果可以推測(cè)，毒性是由于重金屬與生物大分子作用造成的。金屬離子既可取代生物大分子活性點(diǎn)位上原有的金屬，也可以結(jié)合在該分子的其他位置。當(dāng)有毒金屬離子與生物大分子上的活性點(diǎn)位或非活性點(diǎn)位結(jié)合后，可以改變生物大分子正常的生理和代謝功能，使生物體表現(xiàn)為中毒現(xiàn)象甚至死亡。4)微生物對(duì)重金

18、屬抗性的研究當(dāng)重金屬超過(guò)一定濃度時(shí)，對(duì)微生物具有毒害作用，但是某些微生物可以通過(guò)生物解毒對(duì)重金屬毒性產(chǎn)生抗性。重金屬生物解毒是指微生物把抑制其正常生長(zhǎng)繁殖的有毒重金屬通過(guò)運(yùn)輸、結(jié)合與轉(zhuǎn)化等方式使細(xì)胞內(nèi)重金屬減少、毒性減弱并對(duì)重金屬毒性產(chǎn)生抗性的生理代謝過(guò)程。研究表明，不同類型的微生物具有不同的解毒抗性，如真核微生物，主要通過(guò)利用金屬硫蛋白(Metallothionein，MT)螯合體內(nèi)重金屬，以減少破壞性較大的活性游離態(tài)重金屬的存在；而原核微生物則通過(guò)減少重金屬的攝取，增加細(xì)胞內(nèi)重金屬的排放來(lái)控制胞內(nèi)金屬離子濃度。實(shí)驗(yàn)證明，白色鏈珠菌(Candida albicans)主要利用由Crdl基因編

19、碼的P1型ATP酶向體外運(yùn)輸銅，當(dāng)去除菌體內(nèi)所有Crdl時(shí)，C. albicans便喪失銅抗性。1.2 本實(shí)驗(yàn)研究的目的和意義重金屬的轉(zhuǎn)化、凈化一直是治理被污染環(huán)境的難點(diǎn)。近年來(lái)，對(duì)被重金屬污染的環(huán)境進(jìn)行生態(tài)恢復(fù)的思想和研究實(shí)踐有所加強(qiáng)。由于微生物種類多、數(shù)量大、分布廣、繁殖快、變異適應(yīng)力強(qiáng)，成為最受關(guān)注的生態(tài)恢復(fù)生物類群。目前，已有很多關(guān)于微生物吸附和富集重金屬離子、轉(zhuǎn)化重金屬化合物的報(bào)道，如假單胞菌和金色葡萄球菌固定銀、枯草桿菌固定金和硒、硫弧菌和檸檬酸菌固定多種金屬、綠藻固定多種金屬、氧化亞鐵鉤端螺旋桿菌氧化還原多種金屬化合物等，其中，綠藻對(duì)水溶液中的鎘、汞、鉛、鉻的去除率可達(dá)96以上。

20、但在重金屬對(duì)微生物的毒性效應(yīng)方面沒(méi)有系統(tǒng)的闡述。因此，本實(shí)驗(yàn)的研究可了解到汞，鉻，鎘，鉛工業(yè)廢物中常見的重金屬對(duì)微生物生長(zhǎng)過(guò)程中毒性效應(yīng)，具體闡明了重金屬對(duì)細(xì)菌群體數(shù)量、細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞遺傳物質(zhì)的影響，從而對(duì)重金屬對(duì)微生物毒性效應(yīng)研究及重金屬對(duì)環(huán)境污染的微生物學(xué)提供了一定的依據(jù)，同時(shí)為重金屬的生物處理技術(shù)也提供了基礎(chǔ)資料。2.大腸桿菌、熒光假單胞菌和枯草芽孢桿菌的簡(jiǎn)介2.1 大腸桿菌的簡(jiǎn)介大腸桿菌(Escherichia coli， HYPERLINK /view/702098.htm t _blank E.coli)是腸桿菌科細(xì)菌的模式種(type species)。為革蘭氏陰性的直桿菌，周身

21、鞭毛運(yùn)動(dòng)或無(wú)運(yùn)動(dòng)，兼性厭氧，最適合生長(zhǎng)溫度為37。在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上的菌落為光滑型(S)、低凸起、濕潤(rùn)、灰白色、表面有光澤。邊緣整齊，在生理鹽水中易乳化；亦可為粗糙型(H)菌落，干燥，在生理鹽水中不易乳化；也可有中間型菌落；亦有黏液型菌落?；墚愷B(yǎng)菌，氧化酶陰性，能以乙酸鹽為唯一碳源，但不能利用檸檬酸鹽。大腸桿菌能發(fā)酵葡萄糖及其他糖類產(chǎn)生丙酮酸，并可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為乳酸、乙酸和甲酸，部分甲酸可被復(fù)合的解氫酶系統(tǒng)分解為等量的二氧化碳和氫氣。有的菌株不產(chǎn)氣，大多數(shù)菌株發(fā)酵乳糖，但可遲緩發(fā)酵或者不發(fā)酵，大腸桿菌存在于溫血?jiǎng)游锬c道下部。大腸桿菌為兩端大腸桿菌為兩端鈍圓的短桿菌，一般大小約0.5-0.8um3.0

22、um。因環(huán)境條件不同，有時(shí)個(gè)別菌體呈近似球狀，也有時(shí)出現(xiàn)長(zhǎng)絲狀。多單獨(dú)存在或成雙，但不形成長(zhǎng)鏈排列。約有5左右菌株具有周生鞭毛而能運(yùn)動(dòng)，但多數(shù)菌體只有1-4根，一般不超過(guò)10根，所以動(dòng)力較弱；多數(shù)菌株生長(zhǎng)有比鞭毛細(xì)、短、直且數(shù)量多的菌毛；有時(shí)菌株具有莢膜或微莢膜；不形成芽孢。對(duì)普通堿性染料著色良好，革蘭氏染色呈陰性。圖2-1 顯微鏡下的大腸桿菌2.2 熒光假單胞菌的簡(jiǎn)介1.菌落特性熒光假單胞菌（P.fluorescens）是假單胞菌屬（Pseudomonas）的一種，革蘭陰性桿菌，呈單個(gè)或成對(duì)排列，一端叢毛菌，運(yùn)動(dòng)活潑，偶見無(wú)鞭毛無(wú)動(dòng)力的菌株。專性需氧，營(yíng)養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上可生長(zhǎng)，在麥

23、康凱和SS平板上亦可生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度為25-30，大多數(shù)菌株在4生長(zhǎng)，37或42不生長(zhǎng)。約94%的菌株產(chǎn)生水溶性熒光素（青膿素），在紫外線（360nm）照射下呈黃綠色熒光，有些菌株產(chǎn)生藍(lán)色色素，不擴(kuò)散。氧化酶陽(yáng)性，氧化葡萄糖、木糖產(chǎn)酸，對(duì)麥芽糖多不分解，水解精氨酸，多能液化明膠，卵磷酯酶陽(yáng)性。圖2-2 高倍顯微鏡下的熒光假單胞菌2臨床意義熒光假單胞菌（P.fluorescens）存在于土壤和水等環(huán)境中，常與食物（雞蛋、血、牛乳等）腐爛有關(guān)，可作為咽部的正常菌群存在，是人類少見的條件致病菌，偶從泌尿道感染病人尿中分離出。由于具有嗜冷性，可在冰箱儲(chǔ)存血液中繁殖，若輸入含有此菌的血庫(kù)血液，可導(dǎo)致病

24、人不可逆性的休克而死亡。3微生物學(xué)檢驗(yàn)?zāi)颉⒎置谖锏扰R床標(biāo)本可直接接種在血平板上，血液標(biāo)本可先于20-30進(jìn)行增菌后再接種血平板分離。不能在35或37進(jìn)行培養(yǎng)，以免發(fā)生假陰性。本菌鞭毛3根以上，42不能生長(zhǎng)，不產(chǎn)生綠膿素，可以與銅綠假單胞菌相區(qū)別。本菌的最低鑒定特征有：?jiǎn)味吮廾?根以上，動(dòng)力陽(yáng)性；氧化分解葡萄糖，不分解麥芽糖，氧化酶陽(yáng)性，精氨酸水解陽(yáng)性，明膠液化陽(yáng)性。2.3 枯草芽孢桿菌的簡(jiǎn)介枯草桿菌（Bacillus subtilis，B.subtilis），芽孢桿菌屬的一種。單個(gè)細(xì)胞0.70.8m23m，著色均勻。無(wú)莢膜，周生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)。 圖2-3 顯微鏡下的枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌是革蘭

25、氏陽(yáng)性菌，芽孢0.60.9m1.01.5m，橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，常形成皺醭。需氧菌，可利用蛋白質(zhì)、多種糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。有的菌株是-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生產(chǎn)菌；有的菌株具有強(qiáng)烈降解核苷酸的酶系，故常作選育核苷生產(chǎn)菌的親株或制取5-核苷酸酶的菌種。在遺傳學(xué)研究中應(yīng)用廣泛，對(duì)此菌的嘌呤核苷酸的合成途徑與其調(diào)節(jié)機(jī)制研究較清楚。廣泛分布在土壤及腐敗的有機(jī)物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。最適合生長(zhǎng)溫度為37。3. 汞，鉻，鎘，鉛對(duì)大腸桿菌，熒光假單胞菌，枯草芽孢桿菌毒性的實(shí)驗(yàn)研究3.1 細(xì)菌在重金

26、屬污染下存活數(shù)量3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器實(shí)驗(yàn)材料：大腸桿菌DH5，熒光假單胞菌AB92001，枯草芽孢桿菌，由武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供；，分析純，北京益利化工公司；，分析純，貴州市銅仁化學(xué)試劑廠；，分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；，分析純，天津華東試劑廠；蛋白胨(LP0042),英國(guó)，OXOID；酵母粉(YEAST EXTRCT)，英國(guó)，OXOID；，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；瓊脂(Agar)，日本。實(shí)驗(yàn)器材：恒溫培養(yǎng)箱；高壓滅菌鍋；電子天平；超凈工作臺(tái)；培養(yǎng)皿；三角瓶；試管；酒精燈；涂棒。3.1.2 實(shí)驗(yàn)步驟用,的分析純，分別配置、的溶液1000mg/L，pH自然。配置LB液體

27、培養(yǎng)基(5g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L)800mL，分裝在8個(gè)三角瓶中(每個(gè)100mL)，再在每個(gè)三角瓶中加入1.1g瓊脂，然后放入高壓滅菌鍋中滅菌，滅菌完后，在其中7個(gè)三角瓶中加入經(jīng)稀釋后不同濃度的離子，混合均勻后，將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中(每種濃度倒3個(gè)平板，包括空白樣)，冷卻。將原菌種液用已滅菌的LB液體培養(yǎng)液稀釋倍，振蕩均勻后，分別取20L的菌液加入到每個(gè)培養(yǎng)皿中，涂抹均勻后，倒置放入恒溫箱中培養(yǎng)18小時(shí)(大腸桿菌37，熒光假單胞菌30，枯草芽孢桿菌37)。培養(yǎng)完成后，通過(guò)計(jì)數(shù)法，數(shù)出每個(gè)平板上的菌落數(shù)，與空白樣對(duì)比，計(jì)算出每種濃度金屬離子的致死率。將每種金屬對(duì)三種菌種重復(fù)以上

28、過(guò)程。3.1.3 結(jié)果與分析1實(shí)驗(yàn)結(jié)果：重金屬離子對(duì)三種細(xì)菌的致死率如表3-1所示：表3-1 重金屬對(duì)三種菌的致死率重金屬離子劑量(mg/L)對(duì)大腸桿菌的致死率（%）對(duì)熒光假單胞菌的致死率（%）對(duì)枯草芽孢桿菌的致死率（%）01.02.03.05.020.050.090.005.020.050.090.0120.0150.0180.005.020.030.040.0020.0029.666.777.8100100100100082.41001001001001001000011.129.663.300032.270.0100100100100100013.340.073.393.31001001

29、00025.971.110010000087.590.6100100100100100000045.684.490.61000093.893.896.90050.090.0120.0150.0180.0200.0250.0300.00011.125.944.468.989.71000013.352.277.890.5100100050.990.693.896.91001001002結(jié)果分析與討論由表3-1中數(shù)據(jù)可知：重金屬離子對(duì)大腸桿菌、熒光假單胞菌、枯草芽孢桿菌三種細(xì)菌的最小致死濃度5、3、3；對(duì)大腸桿菌、熒光假單胞菌、枯草芽孢桿菌三種細(xì)菌的最小致死濃度20、120、180；對(duì)大腸桿菌、熒光

30、假單胞菌、枯草芽孢桿菌三種細(xì)菌的最小致死濃度90、30、50；對(duì)大腸桿菌、熒光假單胞菌、枯草芽孢桿菌三種細(xì)菌的最小致死濃度300、250、200。通過(guò)上表，我們知道在重金屬離子、濃度相同時(shí)，它們對(duì)大腸桿菌的毒性強(qiáng)度依次為：；對(duì)熒光假單胞菌和枯草芽孢桿菌的毒性強(qiáng)度都依次為：。由此可見，對(duì)微生物的毒性最大。3.2 細(xì)菌在受到重金屬污染后在細(xì)胞水平上的研究細(xì)菌在受到重金屬污染后在細(xì)菌水平上的研究主要是通過(guò)比較三種細(xì)菌(大腸桿菌，熒光假單胞菌，枯草芽孢桿菌)在受重金屬污染前后細(xì)胞形態(tài)的改變來(lái)確定。根據(jù)表3-1中實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)微生物的毒性最大，故預(yù)選經(jīng)1mg/L的污染后的細(xì)菌作為研究對(duì)象，但由于本實(shí)驗(yàn)中用

31、到的培養(yǎng)基為L(zhǎng)B液體培養(yǎng)基，與上述固體培養(yǎng)基不同，在經(jīng)1mg/L的污染后的菌體全部死亡，故選擇經(jīng)50mg/mL的污染后的菌體作為本實(shí)驗(yàn)得研究對(duì)象。3.2.1實(shí)驗(yàn)材料和儀器實(shí)驗(yàn)材料：大腸桿菌DH5，熒光假單胞菌AB92001，枯草芽孢桿菌，由武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供；，分析純，貴州市銅仁化學(xué)試劑廠；蛋白胨(LP0042)，英國(guó)，OXOID；酵母粉(YEAST EXTRCT)，英國(guó)，OXOID；，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Goldview染色劑，鴻雨新生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)儀器：顯微鏡型號(hào)BGP33-IX71(olympus)；3.2.2 實(shí)驗(yàn)步驟將分離得到的三種細(xì)菌進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察，依據(jù)

32、參考文獻(xiàn)所述方法進(jìn)行。從平板上用牙簽挑單菌落進(jìn)行液體過(guò)夜培養(yǎng)，37，180rmp；從過(guò)夜培養(yǎng)的液體培養(yǎng)物中以1%的接種量轉(zhuǎn)接到新鮮培養(yǎng)基中，培養(yǎng)8h，37，180rmp；向其中加入，終濃度為50mg/mL，靜置處理12h；用移液器吸取1mL的上述處理液于1.5mL的EP管中，于4000rmp離心5min；倒上清后將細(xì)菌重新懸浮在pH7.5的PBS緩沖液中；用Goldview對(duì)細(xì)菌染色5min；制片并用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。3.2.3 結(jié)果與分析 1、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：在熒光顯微鏡下各菌體的細(xì)胞形態(tài)如下圖所示；圖3-1 熒光顯微鏡下未經(jīng)污染的 HYPERLINK /view/702098.htm t

33、_blank E.coli細(xì)胞形態(tài)圖3-2 熒光顯微鏡下經(jīng)污染后的 HYPERLINK /view/702098.htm t _blank E.coli細(xì)胞形態(tài)圖3-3 熒光顯微鏡下未經(jīng)污染的P.f.AB92001細(xì)胞形態(tài)圖3-4 熒光顯微鏡下經(jīng)污染后的P.f.AB92001細(xì)胞形態(tài)2結(jié)果分析與討論圖3-1和圖3-2分別為大腸桿菌受重金屬離子污染前后細(xì)胞的形態(tài)，由兩圖對(duì)比可知，在圖3-1和3-2中大腸桿菌都呈明顯的桿狀，但圖3-2中細(xì)胞相對(duì)來(lái)說(shuō)桿大并且粗壯，這可能是因?yàn)橹亟饘僖鸫竽c桿菌的細(xì)胞壁在不同程度上破裂，使得細(xì)胞膨脹導(dǎo)致而成的。圖3-3和3-4分別為熒光假單胞菌受重金屬離子污染前后細(xì)胞

34、的形態(tài)，由兩圖對(duì)比可知，圖中的熒光假單胞菌都也呈明顯的桿狀，但它們?cè)诖吮稊?shù)的顯微鏡下沒(méi)有明顯的差別，因此無(wú)法確定重金屬離子對(duì)其細(xì)胞形態(tài)是否有影響。對(duì)于枯草芽孢桿菌而言，因?yàn)槠潴w內(nèi)含有溶菌酶，在含有受重金屬污染菌體的培養(yǎng)基靜置處理時(shí)，由于其細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷，造成溶酶體破裂，溶菌酶被大量的釋放，枯草芽孢桿菌發(fā)生自溶，因此實(shí)驗(yàn)中無(wú)法用熒光顯微鏡觀察它在經(jīng)污染前后細(xì)胞的形態(tài)變化。3.3 單細(xì)胞凝膠實(shí)驗(yàn)單細(xì)胞凝膠電泳(single cell gel electrophoresis,SCGE)，又稱彗星實(shí)驗(yàn)，是一種在單細(xì)胞水平上進(jìn)行DNA損傷的檢測(cè)方法，具有簡(jiǎn)便、靈敏、樣品用量小等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于遺傳毒性檢

35、測(cè)、環(huán)境毒性檢測(cè)、分子流行病學(xué)和DNA損傷與修復(fù)等研究領(lǐng)域。本實(shí)驗(yàn)中，用單細(xì)胞凝膠實(shí)驗(yàn)來(lái)確定重金屬污染是否對(duì)菌體的遺產(chǎn)物質(zhì)產(chǎn)生損傷。本實(shí)驗(yàn)中是根據(jù)對(duì)菌體遺傳物質(zhì)的研究來(lái)確定重金屬污染時(shí)，是否對(duì)其遺傳物質(zhì)有所影響。根據(jù)實(shí)驗(yàn)二中的結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)只就大腸桿菌DH5和熒光假單胞菌AB92001進(jìn)行單細(xì)胞凝膠實(shí)驗(yàn)。3.3.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器實(shí)驗(yàn)材料：磷酸鹽緩沖液(PBS)；低熔點(diǎn)瓊脂糖，Pharmacia，丹麥；正常熔點(diǎn)瓊脂糖，Pharmacia，丹麥；(三羥甲基)氨基甲烷(Tris)，北京益力精細(xì)化學(xué)品有限公司；堿性裂解液（2.5mol/L NaCl；100mmol/L Na2EDTA；10mmol/L

36、 Tris；1%肌氨酸鈉），臨用前加10%DMAO，1%Triton X-100；電泳緩沖液（1mmol/L Na2EDTA；300mmol/L NaOH；Tris.Cl，pH=7.5）；溴化乙錠(EB)溶液母液：將EB配制成10 mg/mL，用鋁箔或黑紙包裹容器儲(chǔ)于室溫即可。實(shí)驗(yàn)儀器：移液管；電泳槽；電泳儀；微波爐；載玻片；蓋玻片；凝膠成像系統(tǒng)。3.3.2 實(shí)驗(yàn)步驟大腸桿菌DH5和熒光假單胞菌AB92001的活化。用100mL已滅菌的LB液體培養(yǎng)基，接入2mL的已活化的 HYPERLINK /view/702098.htm t _blank E.coli.DH5和p.f. AB92001，分

37、別置于37和30的搖床中培養(yǎng)12-18h；染毒。將活化的菌液稀釋10000倍后，去20L的菌液加入5mL含有50mg/mL的的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間。破壁。加人2mol/L的NaOH溶液，破壁40min，離心；制片 。第一層：滴加80L正常熔點(diǎn)瓊脂糖溶液，蓋上蓋玻片，盡量避免產(chǎn)生氣泡，然后放人冰箱內(nèi)或碎冰上4 1015 min待其凝固；第二層：取輕輕揭去第一層蓋玻片，將細(xì)胞懸液與低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠(37)按1:9的比例混合，在載玻片上滴加65L，蓋上蓋玻片，盡量避免產(chǎn)生氣泡，然后放人冰箱內(nèi)或碎冰上41015 min待其凝固；第三層：輕輕揭去蓋玻片，在載玻片滴加65L低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液，蓋上蓋

38、玻片，然后放人冰箱內(nèi)或碎冰上41015 min待其凝固。裂解。去掉蓋玻片，將凝膠浸入冰冷的堿性裂解液內(nèi)（臨用前加10% DMAO，1%Triton X-100），4裂解1h。裂解完畢后用預(yù)冷的PBS液，連續(xù)漂洗3次。電泳。在穩(wěn)壓15 V下，通過(guò)調(diào)節(jié)電泳槽液面高度使電流達(dá)到300 mA，在小于15溫度下避光電泳20 min。染色。加5g/mL的溴化乙錠(EB)染液到膠體表面，避光染色1520 min，蒸餾水沖洗染色液，熒光顯微鏡鏡檢。3.3.3 結(jié)果與分析1、實(shí)驗(yàn)結(jié)果： HYPERLINK /view/702098.htm t _blank E.coli.DH5和P.f. AB92001在電泳操

39、作結(jié)束后，染色拍照結(jié)果如圖3-5和3-6所示。圖3-5 HYPERLINK /view/702098.htm t _blank E.coli.DH5的單細(xì)胞凝膠電泳圖像圖3-6 P.f. AB92001的單細(xì)胞凝膠電泳圖像2、結(jié)果分析與討論由于實(shí)驗(yàn)中菌液稀釋的倍數(shù)過(guò)大，致使在電泳時(shí)看到的細(xì)胞很少，并且受到拍照像素的限制，菌體DNA的損傷結(jié)果表現(xiàn)不是很明顯，但在圖中可以看得到明顯的亮團(tuán)，這說(shuō)明損傷的DNA確實(shí)在發(fā)生泳動(dòng)。由于時(shí)間和技術(shù)的限制，在這里只能做一個(gè)現(xiàn)象的描述，無(wú)法對(duì)其進(jìn)行定性定量的分析，希望以后的研究者能這方面做出更詳細(xì)的研究。4微生物和重金屬相互作用的應(yīng)用范圍及發(fā)展前景4.1 微生物

40、和重金屬相互作用的應(yīng)用范圍4.1.1重金屬污染的微生物學(xué)評(píng)價(jià)微生物法是環(huán)境介質(zhì)污染毒性研究的一種常用方法，微生物常被應(yīng)用于探討污染物不同暴露強(qiáng)度下,對(duì)生態(tài)系統(tǒng)在個(gè)體、群體和系統(tǒng)水平的結(jié)構(gòu)、功能的損傷。重金屬污染物的生態(tài)毒性診斷指標(biāo)體系的建立對(duì)環(huán)境監(jiān)測(cè)有重要意義，但只有通過(guò)微生物毒性試驗(yàn)、遺傳毒性試驗(yàn)(微核試驗(yàn)、致突變?cè)囼?yàn)、代謝研究和DNA加合物研究等),才可部分地實(shí)現(xiàn)環(huán)境健康質(zhì)量描述的指標(biāo)量化,為環(huán)境重金屬污染危害的預(yù)防及治理提供科學(xué)依據(jù)。Houba等認(rèn)為一些細(xì)菌能在高濃度Cd污染環(huán)境中生長(zhǎng)，其密度與環(huán)境毒性水平密切相關(guān)。張春桂等在研究高濃度重金屬污染水域中微生物生態(tài)時(shí)指出，微生物的類群與重金

41、屬的毒性對(duì)微生物富集重金屬有很大影響。在研究土壤重金屬對(duì)微生物的數(shù)量與群落效應(yīng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)重金屬在低濃度下有促進(jìn)作用，高濃度有抑制作用，并且不同類群的微生物敏感程度不同，通常是放線菌細(xì)菌真菌；另外，重金屬可導(dǎo)致土壤中高等真菌種群下降，瑞典的Natural研究發(fā)現(xiàn)對(duì)照土壤中(Cu100mg/L)有35種真菌，而中等污染土壤中(1000mg/L)有25種，高度污染土壤中(10000mg/L)只有13種4.1.2 微生物在環(huán)境保護(hù)中的作用礦物工程等工業(yè)廢物的微生物利用利用氧化亞鐵硫桿菌(Tf)對(duì)金屬硫化物的氧化作用來(lái)除去固體廢物中的硫化物，降低固體廢棄物對(duì)環(huán)境的污染。盡管小范圍的微生物吸附方法治理礦區(qū)廢

42、棄物已經(jīng)使用，但迄今為止微生物吸附主要作為治理廢水的方法而引起關(guān)注。為了減少甚至消除礦山廢棄物造成的污染，從礦山廢水中分離出來(lái)氧化鐵硫桿菌和氧化硫桿菌等菌體，利用硫化礦物在細(xì)菌作用下浸出的機(jī)理，控制硫酸還原菌，抑制重金屬的浸出來(lái)處理礦坑酸性廢水。另一方面，有目的地利用微生物具有吸附或沉積各種離子于其表面的親和力處理廢水，加速金屬的浸出，回收浸出液提取重金屬。再者，利用微生物細(xì)胞和其它材料制成的生物制品來(lái)消除廢水中有毒金屬離子。重金屬污染土壤的微生物修復(fù)技術(shù)微生物修復(fù)是土壤重金屬污染的重要整治手段之一。與土壤有機(jī)污染物的微生物修復(fù)相比，關(guān)于土壤重金屬污染的微生物修復(fù)研究和應(yīng)用較少，僅在最近幾年才

43、引起重視。重金屬污染的微生物修復(fù)包含兩方面的技術(shù)：生物吸附和生物氧化還原。前者是重金屬被活的或死的生物體所吸附的過(guò)程；后者則是利用微生物改變重金屬離子的氧化還原狀態(tài)來(lái)降低環(huán)境和水體中的重金屬水平。在有毒重金屬離子中，以污染的微生物修復(fù)研究較多。在好氣或厭氣條件下，已知有許多微生物催化還原為的反應(yīng)。許多研究還顯示有機(jī)污染物如芳香族化合物可以作為還原的電子供體。這一結(jié)果表明微生物可同時(shí)修復(fù)有機(jī)物和的污染。微生物還可以通過(guò)產(chǎn)生還原性產(chǎn)物如和硫化物間接促進(jìn)的還原。此外，重金屬污染土壤的微生物修復(fù)另一重要方面就是菌根的使用。菌根是植物根系和真菌形成的一種共生體。菌根與土壤的交互作用形成菌根系，它是由有生

44、命的真菌、植物和非生命的土壤形成的微生態(tài)系統(tǒng)。對(duì)菌根系的研究表明，根系的環(huán)境狀況直接影響重金屬在土壤植物系統(tǒng)中的遷移和轉(zhuǎn)化，而重金屬形態(tài)與金屬的遷移、轉(zhuǎn)化和生物有效性有著密切的關(guān)系。微生物與菌根對(duì)重金屬生物有效性的影響是多方面的，利用它們可提高植物提取修復(fù)的效率。4.2 重金屬與微生物相互作用的發(fā)展前景通過(guò)以上研究基礎(chǔ)，研究者可根據(jù)不同的側(cè)重點(diǎn)，對(duì)重金屬和微生物之間的相互作用及其應(yīng)用作更深入地研究和探討，以期待在以下幾個(gè)方面的研究，從而進(jìn)一步提高微生物在生活、生產(chǎn)中的利用價(jià)值，更好地發(fā)揮微生物“天然環(huán)境衛(wèi)士”的作用：發(fā)現(xiàn)更多微生物物種，深入地了解它們的生長(zhǎng)特性、結(jié)構(gòu)特征及遺傳特性，篩選出具有高

45、效專一吸附或降解重金屬能力的微生物菌株。加強(qiáng)極端微生物的研究，例如海洋微生物的研究利用，充分發(fā)揮它們?cè)诃h(huán)境保護(hù)中的作用。利用那些對(duì)重金屬不太敏感的微生物作為重金屬離子的吸附劑，并研究如何在廢水濃度和化學(xué)組分不穩(wěn)定情況下，維持微生物的吸附活性。加強(qiáng)土壤重金屬污染對(duì)微生物的毒性效應(yīng)研究，通過(guò)對(duì)周圍環(huán)境介質(zhì)的各種因素進(jìn)行調(diào)節(jié)，充分發(fā)揮微生物的凈化功能，同時(shí)也可將植物和微生物結(jié)合起來(lái)，實(shí)行生態(tài)修復(fù)。本實(shí)驗(yàn)中只就幾種重金屬離子對(duì)大腸桿菌，熒光假單胞菌，枯草芽孢桿菌的最小致死濃度有了確定，在以后可以系統(tǒng)地對(duì)龐大的微生物群體對(duì)各種重金屬的抗性進(jìn)行進(jìn)一步研究探索。本實(shí)驗(yàn)中的三種細(xì)菌均屬于帶有鞭毛性細(xì)菌，根據(jù)有

46、鞭毛的細(xì)菌可以在半固體培養(yǎng)基中游動(dòng)卻又不能任意游走的現(xiàn)象，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，判斷實(shí)驗(yàn)細(xì)菌是否有運(yùn)動(dòng)性。謝 辭即將結(jié)束四年大學(xué)的學(xué)習(xí)，我心中充滿激動(dòng)，同時(shí)也有點(diǎn)不舍，這四年的時(shí)間是我人生中十分重要的階段。在這四年里，我學(xué)習(xí)了豐富的專業(yè)知識(shí)，為即將投入的實(shí)際工作奠定了堅(jiān)定的基礎(chǔ)，在學(xué)習(xí)的過(guò)程中，我學(xué)會(huì)了如何更好地發(fā)現(xiàn)問(wèn)題、分析問(wèn)題和解決問(wèn)題，這在很大程度提高了我獨(dú)立工作和動(dòng)手的能力。回首這些成績(jī)的同時(shí)，我衷心的感謝在這四年中曾在學(xué)習(xí)、工作和生活中給予我很多支持幫助和指導(dǎo)的老師、身邊的同學(xué)們和我親愛的室友們，我的這些成績(jī)是和他們分不開的。首先，我要感謝我的論文指導(dǎo)老師梅運(yùn)軍老師，他指導(dǎo)我如何進(jìn)行科學(xué)

47、實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)中要注意的問(wèn)題，怎樣處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，怎樣寫作論文等等。其次，我要感謝給我們實(shí)驗(yàn)提供儀器和幫助的應(yīng)用微生物及生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室的劉軍老師和趙沁學(xué)姐，同時(shí)我還要感謝和我同一實(shí)驗(yàn)室的同學(xué)們?cè)趯?shí)驗(yàn)過(guò)程中給我的幫助和關(guān)心，以及我們環(huán)境實(shí)驗(yàn)室王文清老師。最后衷心感謝各位老師對(duì)本論文的評(píng)閱和指正。參考文獻(xiàn)1 王韜，李鑫鋼，杜啟云含重金屬離子廢水治理技術(shù)的研究進(jìn)展J化工環(huán)保，2008，28(4)：323-326.2 Srivastava N K，Majumder C BNovel biofiltration methods for the treatment of heavy metals from in

48、dustrial wastewater JJournal of Hazardous Materials，2008，151(1)：183 Chander K，Brookes PCIsthe dehydrogenase assayinvalid as amethod to estimat microbial activity in copper contaminated soi_1Soil Biol Bio，1991，23(i0) 909-915.4 Gong L P(龔利萍)，Zhang J Y(張甲耀)，Luo Y X(羅宇煊)The status in quoandpros Dect of applying microorganisms to environment protectionChongqing Environ Sci(重慶環(huán)境科學(xué))，2001，23(2)：7174.5 Todorow TS，Dimkov R，Koteva ZHEffect of lead contamination on the biological properties of alluvial meadow soilPochovoznanie Agrokhimiya，1987，22(5):33-40.6 陳素華，孫鐵珩，周啟星等微生物與重金屬問(wèn)的相互作用及其