李麗娜開題完稿

1、應用全基因組改組(giz)技術選育腸道益生菌的研究 學生(xu sheng)姓名：馬穎輝 指導教師：曹龍奎 教授 共十七頁 目 錄1. 研究(ynji)的目的和意義2. 國內(nèi)外研究動態(tài)(dngti)和趨勢 3. 試驗研究的主要內(nèi)容和方法 4. 試驗研究實施方案和進度 食品學院2009級研究生開題報告5. 試驗研究預期效果共十七頁1.枯草芽孢桿菌(gnjn)研究意義食品學院2009級研究生開題(ki t)報告2.全基因組改組研究的意義 一.研究的目的和意義生長快、營養(yǎng)簡單，能產(chǎn)生耐熱抗逆的芽抱，這也有利于生防菌劑的生產(chǎn)、劑型加工及在環(huán)境中的存活、定殖與繁殖，而且批量生產(chǎn)工藝簡單，成本也較低，施用

2、方便，儲存期長，是一種理想的生防微生物。 全基因組改組是近年來興起的微生物遺傳育種和菌種改良的一項新技術。該項技術通過微生物多個正突變體遞進融合進行基因組隨機重組，快速篩選所需表型有重大改進的菌株。共十七頁二.國內(nèi)外研究(ynji)動態(tài)和趨勢1.國內(nèi)研究(ynji)概況 2.國外研究概況2007年胡雪萍等在比較納豆芽孢桿菌營養(yǎng)體和芽孢之間的生物學特性時發(fā)現(xiàn),芽孢對溫度、酸堿度、鹽和模擬胃腸道環(huán)境等不利環(huán)境的耐受性均明顯強于營養(yǎng)體,可在模擬胃腸道環(huán)境中生長萌發(fā)。日本學者用NTG誘變處理鏈霉菌U121的孢子,獲得突變菌株的基因組庫,然后通過三輪的基因組改組,獲得的菌株產(chǎn)HCA能力比原始出發(fā)菌株產(chǎn)量

3、高5倍以上,三角瓶培養(yǎng)顯示細胞生長速度也獲得了大幅提高。食品學院2009級研究生開題報告共十七頁三試驗(shyn)研究的主要內(nèi)容和方法主要內(nèi)容食品(shpn)學院2009級研究生開題報告1、枯草芽孢桿菌生長條件的確定。2、菌株產(chǎn)酶活性的測定。3、菌株紫外線誘變，選育高產(chǎn)酶菌株。4、菌株全基因組改組技術的研究。共十七頁三試驗研究的主要內(nèi)容(nirng)和方法食品學院2009級研究生開題(ki t)報告 3.1 枯草芽孢桿菌生長條件的研究 種子液制備250mL錐形瓶分裝50mL基礎LB種子培養(yǎng)基接種后，在37，160rpm的條件下震蕩培養(yǎng)12h。以滅菌的基礎種子培養(yǎng)基作為空白對照，測定菌液的OD6

4、00，作為培養(yǎng)條件優(yōu)化的種子液 。 菌種生長培養(yǎng)液配制及測定將種齡為12h的種子培養(yǎng)液按5%接種于裝有6mL基礎種子培養(yǎng)基的試管中。已接種的試管分別在各單因素條件下振蕩培養(yǎng)，每隔兩小時取樣，測定OD600，達到菌種的最大生長量為止。以時間為橫坐標，以OD600為縱坐標，繪制菌種生長曲線，使菌種在短時間內(nèi)達到較大生長量者為最適生長條件。共十七頁Title吸水率溫度(wnd)pH搖床轉(zhuǎn)速(zhun s)接種量裝液量種齡實驗方法食品學院2009級研究生開題報告共十七頁食品學院(xuyun)2009級研究生開題報告實驗(shyn)方法3.2 菌種產(chǎn)酶活性測定 3.2.1 蛋白酶活性測定 3.2.2 淀

5、粉酶活性測定 3.2.3 纖維素酶活性測定3.2.4 脂肪酶活性測定共十七頁食品學院(xuyun)2009級研究生開題報告實驗(shyn)方法3.3紫外線誘變出發(fā)菌株斜面 洗下孢子 過濾除菌絲 制成孢子懸浮液 紫外線誘變 轉(zhuǎn)無菌管02h 后培養(yǎng) 稀釋涂平板 暗培養(yǎng)24h 初篩復篩 高產(chǎn)酶菌株 生化鑒定 遺傳穩(wěn)定性 共十七頁食品(shpn)學院2009級研究生開題報告實驗(shyn)方法3.3紫外線誘變1.紫外燈照射時間對誘變的影響 時間(s)2030405060708090100110對照菌落個數(shù)2.篩選步驟 UV第一輪：一株出發(fā)菌株 選出200株單菌落初篩 選出60株復篩選出五株 UV第二輪

6、：五株出發(fā)菌株 540株初篩 選出60株復篩選出五株第三、四輪同第一輪直至選出較優(yōu)菌株共十七頁食品學院2009級研究生開題(ki t)報告實驗(shyn)方法3.4 全基因組改組技術出發(fā)菌株斜面 洗下孢子 過濾處菌絲 制成孢子懸浮液 預處理 酶解 稀釋涂平板 初篩 復篩 高產(chǎn)酶菌株 生化鑒定 遺傳穩(wěn)定性3.4.1原生質(zhì)體制備共十七頁24262830323436生成率再生率1%2%3%4%5%6%7%生成率再生率6h6.5h7h7.5h8h8.5h9h生成率再生率食品學院(xuyun)2009級研究生開題報告3.4.1 原生質(zhì)體制(tzh)備實驗方法1.酶解溫度對原生質(zhì)體制備的影響 2.酶濃度對

7、原生質(zhì)體制備的影響 3.酶解時間對原生質(zhì)體制備的影響 4.正交實驗確定原生質(zhì)體制備的最佳條件 （A）溫度（B）時間h（C）濃度%實驗1實驗2實驗3實驗4實驗5實驗6實驗7實驗8實驗9111222333123231312123312231共十七頁食品(shpn)學院2009級研究生開題報告實驗(shyn)方法3.4.2 原生質(zhì)體融合 取兩親株原生質(zhì)體懸浮液各lml混合，3500r/min離心15分鐘。棄去上清液，緩慢加入預熱1.8ml 10%PEG6000溶液和0.2ml的新生磷酸鈣溶液，融合30min，混合均勻.立即加入SMM終止反應，3500r/min離心10min去除融合液，SMM高滲緩沖

8、液離心洗滌兩次后，重懸于SMM液中，用SMM高滲透壓緩沖液稀釋10倍后，取0.1ml用夾層法培養(yǎng)于再生基本培養(yǎng)塊平板上，培養(yǎng)7天觀察記數(shù)取單親株及混合后不加PEG的原生質(zhì)體分別作對照試驗。 共十七頁3.3.4.1融合子的檢出 將PEG處理(chl)好的原生質(zhì)體作適當稀釋，先涂布在再生平板上，使親株及重組子都生長出菌落，然后用影印法復制到含抗性的培養(yǎng)基上，此后長出的菌落即為融合株。3.3.4.2融合子的鑒定 穩(wěn)定性鑒定 菌落特征比較 融合子與親本菌株的拮抗試驗 酶活性的測定實驗(shyn)方法3.3.4 融合子的檢出及鑒定實驗方法共十七頁四.試驗(shyn)研究實施方案和進度1.本課題的特點及創(chuàng)

9、新點2.研究計劃及預期(yq)進展食品學院2009級研究生開題報告五.試驗研究預期效果1.枯草芽孢桿菌培養(yǎng)條件的確定 2.確定酶活性測定方法 2010年4月2010年9月 相關的資料查找與準備工作。2010年10月2010年12月 菌株誘變，選育高產(chǎn)酶枯草押寶菌株。2011年1月2011年7月 全基因組改組技術的研究。2011年8月2012年3月 對實驗數(shù)據(jù)進行總結(jié)，擬寫畢業(yè)論文。1）從全基因整合構(gòu)建多益生功能菌株，將具有多種益生性狀整合到一個菌株，為開發(fā)性能穩(wěn)定的益生菌產(chǎn)品提供優(yōu)良菌株，將填補這一方面的空白；可保證在自然條件下產(chǎn)品的活菌數(shù)至少較市場上的同類產(chǎn)品提高10-100倍。2）確定不良條件下（冷凍、干燥脫水）對菌體致死、損傷、修復和保護機理共十七頁 敬請各位老師同學 提出(t ch)寶貴意見 謝謝！共十七頁內(nèi)容摘要應用全基因組改組技術選育腸道益生菌的研究。目 錄。1. 研究的目的和意義。3. 試驗研究的主要內(nèi)容和方法。4. 試驗研究實施方案和進度。5. 試驗研究預期效果。全基因組改組是近年來興起的微生物遺傳育種和菌種改良的一項新技術。3、菌株紫外線誘變，選育高產(chǎn)酶菌株。250mL錐形瓶分裝