動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性監(jiān)測計(jì)劃(共26頁)

1、 HYPERLINK 食品伙伴網(wǎng)PAGE PAGE 2附件(fjin)12011年動(dòng)物源細(xì)菌(xjn)耐藥性監(jiān)測計(jì)劃表1. 采樣(ci yn)與細(xì)菌的分離檢測單位樣品來源采樣地要求采樣部位細(xì)菌數(shù)要求中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所選5-8個(gè)省市養(yǎng)殖場或屠宰場或奶牛場10-20個(gè)泄殖腔拭子或動(dòng)物組織，牛奶大腸桿菌500株，沙門氏菌50株，金葡菌30株，彎曲桿菌50株遼寧獸藥飼料蓄產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心本省或相鄰省市養(yǎng)殖場或屠宰場或奶牛場6-15個(gè)泄殖腔拭子或動(dòng)物組織，牛奶大腸桿菌300株，沙門氏菌或金葡菌30株 上海獸藥監(jiān)察所本省或相鄰省市養(yǎng)殖場或屠宰場或奶牛場6-15個(gè)泄殖腔拭子或動(dòng)物組織，牛奶大腸桿菌300

2、株，沙門氏菌或金葡菌30株四川省獸藥監(jiān)察所本省或相鄰省市養(yǎng)殖場或屠宰場或奶牛場6-15個(gè)泄殖腔拭子或動(dòng)物組織，牛奶大腸桿菌300株，沙門氏菌或金葡菌30株廣東省獸藥與飼料監(jiān)察總所本省或相鄰省市養(yǎng)殖場或屠宰場或奶牛場6-15個(gè)泄殖腔拭子或動(dòng)物組織，牛奶大腸桿菌300株，沙門氏菌或金葡菌30株中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心本省或相鄰省市養(yǎng)殖場或屠宰場或奶牛場10-15個(gè)泄殖腔拭子或動(dòng)物組織，牛奶大腸桿菌300株，沙門氏菌或金葡菌30株，彎曲桿菌50株注：1. 同一養(yǎng)殖場采樣時(shí)，應(yīng)對不同飼養(yǎng)階段的動(dòng)物分別采樣，對雞的采樣應(yīng)當(dāng)為雛雞和成雞，對豬的采樣應(yīng)當(dāng)為仔豬和架子豬，每一階段的動(dòng)物采樣30-50份。2.

3、 采樣與細(xì)菌的分離。采樣和分離方法按附件2、附件4進(jìn)行；采樣的動(dòng)物種類、動(dòng)物場和數(shù)量、分離細(xì)菌數(shù)量要求見表1。3. 細(xì)菌鑒定。分別對分離株按附件2進(jìn)行大腸桿菌、沙門氏菌和金葡菌鑒定。必要時(shí)進(jìn)行血清學(xué)測定。4. 細(xì)菌的耐藥性測定。分別對分離的每種菌株按附件3要求對14種藥物做耐藥性測定。PAGE PAGE 29附件(fjin)22011年度動(dòng)物(dngw)源耐藥性監(jiān)測的采樣、檢測技術(shù)要點(diǎn)一、采樣(ci yn)1. 采樣地點(diǎn)選擇中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所在全國范圍內(nèi)選取7個(gè)左右省市的16個(gè)左右養(yǎng)殖場；中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心選取3個(gè)左右省市的12個(gè)左右養(yǎng)殖場；遼寧、上海、成都、廣東和青島五省市耐藥性監(jiān)測

4、實(shí)驗(yàn)室在本省市（或周圍地區(qū)）選擇雞場6個(gè)、豬場5個(gè)（規(guī)模化養(yǎng)殖場和小型養(yǎng)殖場各占一半）。本年度大腸桿菌的耐藥性監(jiān)測采樣要求在各實(shí)驗(yàn)室在前幾年耐藥性監(jiān)測基礎(chǔ)上，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)選擇56個(gè)養(yǎng)殖場，定點(diǎn)、定季度跟蹤采樣監(jiān)測。2. 采樣類型利用棉花拭子采泄殖腔（禽）和肛門（豬、牛）作大腸桿菌、沙門氏菌和彎曲桿菌分離，或從孵化后期死亡雞胚采樣分離沙門氏菌。選擇奶牛場1-2個(gè)，采取新鮮牛奶分離金黃色葡萄球菌，根據(jù)養(yǎng)殖場規(guī)模，每個(gè)場采樣30-50份。3. 病原檢測種類本年度動(dòng)物源細(xì)菌檢測種類包括前幾年監(jiān)測的大腸桿菌、沙門氏菌、葡萄球菌和本年度新增加的彎曲桿菌。病原菌沙門氏菌和金黃色葡萄球菌可根據(jù)各地采樣、細(xì)菌分

5、離情況任選其一進(jìn)行監(jiān)測，也可同時(shí)進(jìn)行。二、認(rèn)真做好飼料來源(liyun)和飼料藥物添加劑調(diào)查、采樣前動(dòng)物抗菌藥使用情況調(diào)查（預(yù)防用藥和治療用藥）和樣品統(tǒng)計(jì)，據(jù)實(shí)填寫采樣記錄表。三、大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌(p to qi jn)和彎曲菌的分離鑒定采用特殊培養(yǎng)基，定向做大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和彎曲菌分離，用生化試驗(yàn)、PCR技術(shù)或血清學(xué)方法對分離物進(jìn)行鑒定，盡早進(jìn)行彎曲桿菌分離鑒定技術(shù)培訓(xùn)。本年度要求每個(gè)省級實(shí)驗(yàn)室分離大腸桿菌不少(b sho)于300株（雞場200株，豬場分離100株），沙門氏菌或金黃色葡萄球菌不少于30株，彎曲桿菌不少于50株。中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所分離大腸桿

6、菌不少于500株（雞場300株，豬場分離200株），沙門氏菌不少于50株，金葡菌不少于30株，彎曲桿菌不少于100株。將分離到的菌株-20以下加甘油保護(hù)劑冷凍保存或其它合適方法保存。四、耐藥性測定用微量肉湯稀釋法（附件3），測定腸道菌、金黃色葡萄球菌對臨床13種常用抗菌藥物的耐藥性（注意腸道菌、金黃色葡萄球菌的測試藥物各有不同），彎曲桿菌統(tǒng)一送中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所指導(dǎo)耐藥性檢測。將測定結(jié)果正確填入耐藥性檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)表（附件6）。藥物種類、判斷標(biāo)準(zhǔn)及質(zhì)控菌株的質(zhì)控范圍見附件3，試驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控菌株由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所統(tǒng)一供應(yīng)。五、結(jié)果報(bào)送各地方動(dòng)物源耐藥性監(jiān)測實(shí)驗(yàn)室的采樣情況和耐藥性檢測結(jié)果，應(yīng)

7、填入采樣記錄表（附件5）和耐藥性檢測結(jié)果登計(jì)表（附件6）統(tǒng)一(tngy)報(bào)送中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析后上報(bào)農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局。結(jié)果的上報(bào)(shng bo)分電子版和紙質(zhì)2部分，電子版直接登陸“物源細(xì)菌(xjn)耐藥性數(shù)據(jù)庫”上報(bào)。紙質(zhì)結(jié)果的上報(bào)主要是監(jiān)測結(jié)果總結(jié)，要求統(tǒng)一格式、同一內(nèi)容。主要內(nèi)容分6部分闡述：（1）本年度任務(wù)簡述；（2）細(xì)菌分離情況；（3）耐藥性監(jiān)測情況；（4）耐藥性監(jiān)測結(jié)果分析；（5）存在問題；（6）改進(jìn)措施和建議。附件(fjin)3采樣(ci yn)記錄表采 樣 地：_ _ 養(yǎng) 殖 場：_ _ _ 采樣(ci yn)時(shí)間：_ _ 聯(lián)系人姓名、電話：_ _樣品來源 豬 日齡

8、_ 雞 日齡 _ 牛 日齡 _其他_日齡 _ 消化道 呼吸道 泌尿生殖道 肝膽 腦 淋巴結(jié) 關(guān)節(jié) 奶樣 皮膚 糞便 其他_ 采樣動(dòng)物健康狀況 養(yǎng)殖量 健康 發(fā)病及癥狀：_ _ 。采樣養(yǎng)殖場使用抗菌藥情況飼料來源、添加抗菌藥種類治療用抗菌藥種類樣品分離菌株 大腸桿菌 金黃色葡萄球菌 鏈球菌 沙門氏菌 空腸彎曲桿菌其他_菌株編號：注：菌株編號按照“菌種、來源-采樣地、采樣年月-菌株編號”的格式進(jìn)行。如EB-L0701-0001，其中：E（大腸桿菌）B（牛）L（魯）07（年）01（月）-0001（菌株編號）。菌種簡寫建議為：E（大腸桿菌）、S（沙門氏菌）、SA（金黃色葡萄球菌）、SC（鏈球菌）、C（

9、空腸彎曲桿菌）動(dòng)物簡寫建議為：B（牛）、P（豬）、C（雞）注：a為喂奶豬或保溫(bown)雞，b為保育豬或生長雞，c為育成豬或雞，d為種母豬或產(chǎn)蛋雞。附件(fjin)4耐藥性檢測(jin c)結(jié)果登計(jì)表（1）腸道菌耐藥性檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)表 養(yǎng)殖場： 檢測員： 年 月 日 菌株編號 氨芐西林阿莫西林/克拉維酸頭孢噻呋慶大霉素大觀霉素四環(huán)素多西環(huán)素氟苯尼考磺胺異惡唑復(fù)方新諾明恩諾沙星二氟沙星多粘菌素EAMA/CEFTGMSPTTEDOFFCSFSXTENRNORPME注：直接填寫檢測的MIC數(shù)值。（2）金葡菌耐藥性檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)表 養(yǎng)殖場： 檢測員： 年 月 日 菌株編號 青霉素氨芐西林阿莫西林/克拉維

10、酸頭孢西丁頭孢噻呋紅霉素磺胺異惡唑復(fù)方新諾明克林霉素替米考星恩諾沙星氧氟沙星萬古霉素pAMA/CCXEFTEMSFSXTCLITIL)ENRNORVA注：直接填寫檢測的MIC數(shù)值。附件(fjin)5動(dòng)物源細(xì)菌分離(fnl)和鑒定方法一、大腸桿菌、沙門氏菌(sh mn sh jn)的分離和鑒定1.范圍本方法規(guī)定了用于耐藥性測定的動(dòng)物源大腸桿菌和沙門氏菌的分離和鑒定方法。本方法適用于各種動(dòng)物及其組織中大腸桿菌和沙門氏菌的分離和鑒定。2.設(shè)備和材料2.1 冰箱：0-4和-20。2.2 恒溫培養(yǎng)箱：371和42。2.3 顯微鏡：10-100。2.4 采樣管。2.5 采樣棉拭子、剪子。2.6 滅菌試管。

11、2.7 平皿。2.8 自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀。2.9 API 20E試子條。2.3 恒溫?fù)u床2.4 凍存管3.培養(yǎng)基和試劑3.1 運(yùn)送(yn sn)培養(yǎng)基3.2 麥康凱瓊脂(qingzh)3.3 沙門氏菌顯色(xin s)瓊脂或XLT4瓊脂3.4 營養(yǎng)肉湯3.5 鑒定用大腸桿菌、沙門氏菌陽性血清3.6 四硫磺酸鹽增菌液（TTB）4.大腸桿菌和沙門氏菌分離和鑒定程序大腸桿菌和沙門氏菌的分離和鑒定程序見圖1動(dòng)物泄殖腔拭子用接種環(huán)接種于麥康凱瓊脂按1:10接種四硫磺酸鹽增菌液（TTB）4224h運(yùn)送培養(yǎng)基或營養(yǎng)肉湯發(fā)病動(dòng)物帶菌組織（做成勻液）挑取大腸桿菌可疑菌落純化氧化酶試驗(yàn)（陰性）沙門氏菌顯色培養(yǎng)基或XL

12、T4瓊脂挑取沙門氏菌可疑菌落純化API 20E試條自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀大腸桿菌沙門氏菌檢測invA基因確認(rèn)三糖鐵（TSI）和硫化物吲哚運(yùn)動(dòng)性培養(yǎng)基（SIM）鑒定沙門氏菌大腸桿菌圖1：大腸桿菌(d chn n jn)和沙門氏菌的分離和鑒定程序5.操作步驟5.1 采樣(ci yn) 到已選定的養(yǎng)殖場或屠宰場，用滅菌(mi jn)棉簽采動(dòng)物泄殖腔樣品，置入1-2ml肉湯或運(yùn)送培養(yǎng)基中0-4保存。采發(fā)病動(dòng)物組織時(shí)，用無菌操作取少量動(dòng)物組織至于滅菌試管內(nèi)，0-4保存，不超過48小時(shí)。5.2 大腸桿菌(d chn n jn)的分離5.2.1 取泄殖腔拭子樣品用接種棒直接接種于麥康凱瓊脂(qingzh)平面，動(dòng)物

13、組織樣品(yngpn)首先制成勻液，然后用接種棒接種于麥康凱瓊脂平面，37培養(yǎng)18-24小時(shí)。5.2.2 挑取粉紅色、邊緣光滑的大腸桿菌可疑菌落，用麥康凱培養(yǎng)基純化一代，然后接種于營養(yǎng)瓊脂平面37培養(yǎng)12-24小時(shí)，待進(jìn)一步細(xì)菌鑒定。5.3 沙門氏菌的分離5.3.1 將泄殖腔拭子或制成勻液的動(dòng)物組織樣品與增菌培養(yǎng)基按1:10的比例，接種于TTB增菌液中，42培養(yǎng)24小時(shí)。5.3.2 將增菌液搖勻，用接種環(huán)接種于沙門氏菌顯色培養(yǎng)基37培養(yǎng)22-24小時(shí)或XLT4瓊脂上42培養(yǎng)22-24小時(shí)。5.3.3 將沙門氏菌顯色培養(yǎng)基上紫色的沙門氏菌可疑菌落或XLT4瓊脂培養(yǎng)基上中央黑色邊沿透明的沙門氏菌可

14、疑菌落接種于營養(yǎng)瓊脂平面37培養(yǎng)16-24小時(shí)，待進(jìn)一步細(xì)菌鑒定。5.4 大腸桿菌和沙門氏菌(sh mn sh jn)的鑒定（以下方法(fngf)可任選其一）5.4.1 API 20E試驗(yàn)(shyn)條鑒定將在營養(yǎng)瓊脂上培養(yǎng)24小時(shí)以內(nèi)的待鑒定細(xì)菌，首先進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)（附注1），應(yīng)為陰性。5.4 .1.2 將待檢細(xì)菌單個(gè)菌落，懸浮于5ml滅菌生理鹽水，用API 20E試子條按照使用說明書（附注2）操作，菌液和試劑滴加完畢后，37培養(yǎng)18-24小時(shí)，用細(xì)菌鑒定儀判讀結(jié)果。 將鑒定出的大腸桿菌和沙門氏菌結(jié)凍保存，待進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。5.4.2 其它方法 大腸桿菌的鑒定.1將在營養(yǎng)瓊脂上培養(yǎng)24小時(shí)以內(nèi)

15、的待鑒定細(xì)菌，首先進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)（附注1），應(yīng)為陰性。.2 將在營養(yǎng)瓊脂上培養(yǎng)24小時(shí)以內(nèi)的待鑒定細(xì)菌用穿刺法接種于三糖鐵（TSI）瓊脂中，37培養(yǎng)22-24小時(shí)，觀察結(jié)果應(yīng)表面黃色，H2S陰性，產(chǎn)氣。.3 將在營養(yǎng)瓊脂上培養(yǎng)24小時(shí)以內(nèi)的待鑒定細(xì)菌用穿刺法接種于硫化物吲哚運(yùn)動(dòng)性培養(yǎng)基（SIM），37培養(yǎng)22-24小時(shí)，觀察結(jié)果應(yīng)產(chǎn)氣，H2S陰性，運(yùn)動(dòng)或不運(yùn)動(dòng)，吲哚陽性。 沙門氏菌(sh mn sh jn)的鑒定：設(shè)計(jì)invA基因的引物，上游(shngyu)為5-GTG AAA TTA TCG CCA CGT TCG GGC AA-3，下游(xiyu)為5-TCA TCG CAC CGT CA

16、A AGG AAC C -3，反應(yīng)條件：95預(yù)變性5min，94C 30s, 64C 30s, 72C 30s for 30 cycles，得到擴(kuò)增長度為284 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物為沙門氏菌陽性。附注1：氧化酶試驗(yàn)1.原理：氧化酶又稱細(xì)胞色素氧化酶，是細(xì)胞色素氧化酶系統(tǒng)中的最終呼吸酶。此酶并不直接與氧化酶試劑起反應(yīng)，而是先使細(xì)胞色素C氧化，然后氧化型細(xì)胞色素C再使對苯二胺氧化，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。因此，本試驗(yàn)結(jié)果與細(xì)胞色素C的存在有關(guān)。2.方法：取潔凈濾紙條，沾取菌落少許，加氧化酶試劑（10g/L鹽酸四甲基對苯二胺水溶液或10g/L鹽酸二甲基對苯二胺水溶液）1滴，1min內(nèi)觀察結(jié)果。也可將試劑滴加到菌落

17、上進(jìn)行試驗(yàn)。3.結(jié)果判定：陽性者立即變粉紅色，510s內(nèi)呈深紫色。陰性為無色。4.注意事項(xiàng)： 試驗(yàn)時(shí)應(yīng)避免接觸含鐵物質(zhì)，以免出現(xiàn)假陽性。10g/L鹽酸四甲基對苯二胺或10g/L鹽酸四甲基對苯二胺水溶液為無色溶液，在空氣中易被氧化而失效，故應(yīng)經(jīng)常更換新試劑，并盛于棕色瓶中，若試劑已變成深藍(lán)色，應(yīng)棄去不用。附注2：API 20E使用說明書1.試子條的準(zhǔn)備：將5ml蒸餾水或軟化水注入培養(yǎng)盒底部的蜂窩小凹中，造成一個(gè)濕盒。2.在盤的長邊寫上菌株號，再將試條放入盒中。3.取新鮮菌落1個(gè)懸浮于0.85%的生理鹽水5ml中，按照要求用滴管滴加到試條中，CIT、VP、GEL試驗(yàn)滴滿管部和杯部，其它試驗(yàn)僅滴滿管

18、部（注意滴加時(shí)小心，不能產(chǎn)生氣泡）。4.ADH、LDC、ODC、H2S、URE試驗(yàn)用礦物油覆蓋，以造成厭氣環(huán)境。蓋好盒蓋，于37培養(yǎng)(piyng)18-24小時(shí)。5.試條判讀：根據(jù)判讀表判讀所有(suyu)反應(yīng)（陽性或陰性），如果有3個(gè)或3個(gè)以上試驗(yàn)(shyn)為陽性，在報(bào)告單上記錄結(jié)果后，觀察還需要附加試劑的試驗(yàn)結(jié)果：TDA試驗(yàn)、IND試驗(yàn)、VP試驗(yàn)，然后判讀結(jié)果。如果陽性結(jié)果少于3個(gè)，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，再進(jìn)行判定。6.結(jié)果判定：每3個(gè)試驗(yàn)為1組，陽性按順序賦予1、2、4的數(shù)值，根據(jù)試子條上20個(gè)反應(yīng)可得到一個(gè)7位數(shù)的編碼（氧化酶反應(yīng)作為第21個(gè)反應(yīng)），根據(jù)數(shù)據(jù)庫（V4.1）得到鑒定結(jié)果。也

19、可將試子條直接插入計(jì)算機(jī)鑒定系統(tǒng)，直接得到結(jié)果。二、金黃色葡萄球菌的分離鑒定1.范圍本方法規(guī)定了用于耐藥性測定的動(dòng)物源金黃色葡萄球菌的分離和鑒定方法。本方法適用于牛奶和發(fā)病動(dòng)物組織中金黃色的分離和鑒定。2.設(shè)備和材料2.1 冰箱：0-4和-20。2.2 恒溫培養(yǎng)箱：371和42。2.3 顯微鏡：10-100。2.4 采樣管。2.5 滅菌試管。2.6 平皿。2.7 自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀。2.8 API STAPH試子條。2.9 恒溫(hngwn)搖床2.10 凍存管3.培養(yǎng)基和試劑(shj)3.1 BairdParker瓊脂(qingzh)3.2 營養(yǎng)肉湯3.3 營養(yǎng)瓊脂3.4 新鮮兔血漿3.5 0.

20、3%過氧化氫液4.金黃色葡萄球菌分離和鑒定程序金黃色葡萄球菌分離和鑒定程序見圖22000-3000 rpm,15 min棄上清BairdParker瓊脂灰色或黑小菌落，周圍淡色、透明營養(yǎng)瓊脂增菌API Staph拭條鑒定金葡菌牛奶血漿凝固酶試驗(yàn)?zāi)探鹌暇|酶試驗(yàn)陽性扁桃體、發(fā)病動(dòng)物組織圖2：金黃色葡萄球菌(p to qi jn)的分離和鑒定程序5.操作步驟5.1 采樣(ci yn)5.1.1 牛奶樣品(yngpn)：到已選定的奶牛養(yǎng)殖場，現(xiàn)場采牛奶2ml，置入滅菌小離心管中，0-4保存，不超過48小時(shí)。5.1.2 動(dòng)物組織樣品(yngpn)：無菌操作取發(fā)病動(dòng)物組織，0-4保存不超過(chogu

21、)48小時(shí)。5.2 金黃色葡萄球菌(p to qi jn)的分離5.2.1 分離培養(yǎng) 將采樣得到的牛奶樣品，以20003000 r/min離心15 min，棄上清，用滅菌接種環(huán)醮起沉淀劃線接種于BairdParker平皿，36培養(yǎng)24小時(shí)。 無菌操作將發(fā)病動(dòng)物組織直接劃線，接種于BairdParker平皿，36培養(yǎng)24小時(shí)。5.2.2 挑取圓形、光滑凸起、濕潤、直徑為23mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈的可疑菌落。用營養(yǎng)瓊脂純化一代，待進(jìn)一步細(xì)菌鑒定。5.3 金黃色葡萄球菌的鑒定（以下方法可任選其一）5.3.1 API staph試條鑒定將在營養(yǎng)瓊脂上培養(yǎng)

22、24小時(shí)以內(nèi)的待鑒定細(xì)菌，首先進(jìn)行觸酶試驗(yàn)（附注3），應(yīng)為陽性。 將待檢細(xì)菌單個(gè)菌落，懸浮于5ml滅菌生理鹽水，用API staph試子條按照使用說明書（附注4）操作，菌液和試劑滴加完畢后，37培養(yǎng)18-24小時(shí)，用細(xì)菌鑒定儀判讀結(jié)果。 將鑒定出的金黃色葡萄球菌結(jié)凍保存，待進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。5.3.2 血漿(xujing)凝固酶試驗(yàn)法將在營養(yǎng)瓊脂上培養(yǎng)(piyng)24小時(shí)以內(nèi)的待鑒定細(xì)菌，首先進(jìn)行觸酶試驗(yàn)（附注(fzh)3），應(yīng)為陽性。吸取14新鮮兔血漿0.5mL，放入小試管中，再加入培養(yǎng)24h的金黃色葡萄球菌肉湯培養(yǎng)物或生理鹽水懸液0.5mL（1個(gè)麥?zhǔn)蠁挝唬?，振蕩搖勻，放361溫箱或水浴內(nèi)，每

23、半小時(shí)觀察一次，觀察6h。同時(shí)以已知陽性和陰性葡萄球菌株及肉湯作為對照。 如呈現(xiàn)凝固，即將試管傾斜或倒置時(shí)，呈現(xiàn)凝塊者，判為陽性結(jié)果。附注3：觸酶試驗(yàn)用接種環(huán)挑取新鮮待檢菌的純化菌落置于潔凈載玻片上，滴加3%過氧化氫溶液1 滴，觀察結(jié)果。滴加3%過氧化氫溶液后立即產(chǎn)生氣泡的為陽性。附注4：API staph試子條按照使用說明書1.試子條的準(zhǔn)備：將5ml蒸餾水或軟化水注入培養(yǎng)盒底部的蜂窩小凹中，造成一個(gè)濕盒。2.在盤的長邊寫上菌株號(不記在蓋上，以免錯(cuò)放)，再將試條放入盒中。3.取在血瓊脂或營養(yǎng)瓊脂上培養(yǎng)18-24小時(shí)的新鮮純化、經(jīng)觸酶試驗(yàn)陽性的菌落，懸浮于0.85%的生理鹽水5ml中，使其濃度

24、等于0.5麥?zhǔn)蠁挝?，按照要求用滴管滴加到試條小管中，試驗(yàn)僅滴滿管部（注意滴加時(shí)小心，不能產(chǎn)生氣泡）。4.ADH、URE用礦物油滴加到杯部，以造成(zo chn)厭氣環(huán)境。蓋好盒蓋，于35-37培養(yǎng)(piyng)18-24小時(shí)。5.試條判讀：加入試劑，觀察(gunch)反應(yīng)： VP測定、NIT測定、PAL測定按照要求滴加試劑后進(jìn)行判讀陰性或陽性。 6.根據(jù)判讀表判讀所有反應(yīng)（陽性或陰性）。7.結(jié)果判定：每3個(gè)試驗(yàn)為1組，陽性按順序賦予1、2、4的數(shù)值，根據(jù)試子條上20個(gè)反應(yīng)可得到一個(gè)7位數(shù)的編碼（觸酶反應(yīng)作為第21個(gè)反應(yīng)），根據(jù)數(shù)據(jù)庫（V4.1）得到鑒定結(jié)果。也可將試子條直接插入計(jì)算機(jī)鑒定系統(tǒng)，

25、直接得到結(jié)果。附件6抗菌藥敏感性試驗(yàn)操作方法和判斷標(biāo)準(zhǔn)一、抗菌藥物敏感性試驗(yàn)（微量肉湯稀釋法）操作方法1目的本操作方法用來規(guī)范微量肉湯稀釋法測定腸道桿菌最小抑菌濃度（MIC）的操作，并統(tǒng)一判定標(biāo)準(zhǔn)。2適用范圍本標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程適用于按照微量肉湯稀釋法進(jìn)行腸道桿菌和金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度的測定（耐甲氧西林金黃色葡萄球菌除外）。3職責(zé) 進(jìn)行該試驗(yàn)的檢驗(yàn)員應(yīng)當(dāng)按照本標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行。4試驗(yàn)依據(jù)與原理微量肉湯稀釋法測定細(xì)菌最小抑菌濃度是定量檢測某一抗生素對細(xì)菌體外活性的一種標(biāo)準(zhǔn)方法。試驗(yàn)在制成一系列各種濃度的抗生素肉湯溶液中分別加入等量的一定濃度的菌液，過夜培養(yǎng)后，判讀最小抑菌濃度（MIC）。5材料、

26、儀器與試劑的準(zhǔn)備及基本要求5.1 材料和儀器5.1.1 操作室：操作室內(nèi)設(shè)有能達(dá)到空氣消毒的紫外燈。實(shí)驗(yàn)(shyn)前后應(yīng)用75%乙醇溶液擦拭(csh)操作臺面及可能(knng)污染的死角，開啟紫外燈殺菌1小時(shí)。5.1.2 旋渦混合振蕩器：可調(diào)速5.1.3 恒溫培養(yǎng)箱：3525.1.4 滅菌試管、容量瓶、刻度吸管等。5.1.5 園底96孔板、接種針或接種環(huán)（鎳鉻絲或一次性無菌塑料制品）。5.1.6 無菌衣、褲、帽、口罩：用牛皮紙包嚴(yán)，滅菌備用或用一次性的無菌物品代替。5.1.7 8頭或12頭移液器、吸頭等5.2 試劑與培養(yǎng)基5.2.1 75%乙醇溶液5.2.2 無菌0.9%氯化鈉溶液5.2.3

27、 新潔爾滅（1:1000）溶液5.2.4 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基5.2.5 水解酪蛋白肉湯（Mueller-Hinton broth Medium，MH肉湯，含20-25 mg鈣/ L，10-12.5mg鎂/L） 10mg/mL Ca2+ 和Mg2+的配制Ca2+的配制：3.68g CaCl22H2O加入100mL三蒸水中，含量為10mg Ca+/mL，0.22m濾膜過濾除菌后置于4冰箱保存?zhèn)溆?。Mg2+的配制：8.36g MgCl26H2O加入100mL三蒸水中，含量為10mg Mg+/mL，0.22m濾膜過濾除菌后置于4冰箱保存?zhèn)溆谩?使用時(shí)加入適量的Ca2+和Mg2+到MH肉湯中，使MH肉湯中C

28、a2+和Mg2+的含量分別為20-25 mg Ca2+/ L和10-12.5mg Mg2+/L。5.2.7 抗菌藥物：一般采用標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌?.3 質(zhì)控菌種5.3.1 腸道菌質(zhì)控菌株：大腸桿菌(d chn n jn)ATCC 25922。5.3.2 金葡菌質(zhì)控菌株：金黃色葡萄球菌(p to qi jn)ATCC 29213。5.4 抗菌藥物貯備(zhbi)液的制備5.4.1抗菌藥物的稱量計(jì)算公式：W(mg)=式中：W稱取抗菌藥物的重量； V制備抗菌藥物的溶液體積； C1制備抗菌藥物的溶液濃度； C2抗菌藥物的含量。5.4.2 加入一定量的溶劑稀釋至一定濃度。貯備液的濃度至少應(yīng)為1280g/ml

29、，或最高測試濃度的10倍以上。5.4.3 將抗菌藥物貯備液分裝于無菌小瓶中，最好置-70以下保存，有效期為半年。注意不能反復(fù)凍融。臨用前從冰箱中取出，使融解并與室溫一致。5.5 0.5麥?zhǔn)蠁挝唬∕cFarland）標(biāo)準(zhǔn)比濁液或比濁計(jì)藥敏試驗(yàn)菌懸液的濁度，以BaSO4濁度液為標(biāo)準(zhǔn)，相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)蠁挝唬∕cFarland），按如下方法配制：5.5.1 取0.048mol/L的氯化鋇溶液（1.175%w/v，BaCl22H2O）0.5ml，加至99.5ml0.18mol/L的硫酸溶液（1%v/v）中，不斷攪拌使成混懸液。5.5.2 用1cm光路的吸收池，在625nm下測定6.2.1的溶液，0.5標(biāo)

30、準(zhǔn)麥?zhǔn)蠁挝?Mcfarland standard)的吸收度應(yīng)為0.080.10。5.5.3 取46ml硫酸鋇混懸液，置與稀釋菌懸液相同規(guī)格的具塞試管中，密封，室溫避光保存。5.5.4 臨用前將標(biāo)準(zhǔn)比濁液在漩渦震蕩器上混合均勻，如出現(xiàn)大顆粒，則需重新配制。放置后硫酸鋇標(biāo)準(zhǔn)比濁液的濁度會(huì)產(chǎn)生變化(binhu)，因此應(yīng)每月進(jìn)行更換。6 測定(cdng)步驟6.1 分離(fnl)單菌落將質(zhì)控菌株和測試菌株分別用四分劃線法轉(zhuǎn)種于營養(yǎng)瓊脂平面，置37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以得到單個(gè)純菌落。6.2 抗生素工作溶液的制備將抗菌藥物貯備液用MH肉湯稀釋至一定的工作濃度后，按2倍稀釋法進(jìn)一步稀釋至一系列所需濃度(一般10

31、個(gè)濃度梯度)，然后按順序用排槍點(diǎn)入96孔板中，每塊板橫向10個(gè)稀釋度，每孔0.1ml，設(shè)陰性和陽性對照，可測8個(gè)細(xì)菌。6.3 菌液制備6.3.1 生長法 用接種環(huán)挑取營養(yǎng)瓊脂斜面上的35個(gè)質(zhì)控菌或供試菌單個(gè)純菌落，加入無菌45ml肉湯（如胰酶消化大豆肉湯）的試管中。 置3537培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，一般為26小時(shí)，使培養(yǎng)后的菌液濃度達(dá)到或超過0.5標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)蠁挝弧?將培養(yǎng)好的菌液與比濁液管置比色卡上對著光源比較，適當(dāng)情況下可用無菌生理鹽水或肉湯稀釋菌懸液，使兩者濁度一致，即菌懸液的濃度為0.5標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)蠁挝?，在該濃度下質(zhì)控菌株ATCC 25922的菌液濃度為12108CFU。也可采用分光光度計(jì)測定并調(diào)節(jié)菌

32、液濁度。6.3.2 直接制備菌液法該法較生長法簡便，用接種環(huán)挑取瓊脂平板上培養(yǎng)1618小時(shí)的35個(gè)單菌落，用無菌生理鹽水或M-H肉湯稀釋至0.5麥?zhǔn)蠁挝弧?.3.3 將調(diào)節(jié)(tioji)至0.5麥?zhǔn)蠁挝?dnwi)的菌液用M-H肉湯或生理鹽水(shnglynshu)稀釋100倍，約5X105-106CFU/ml濃度。6.3.4 取5X105-106CFU/ml濃度的菌液0.1ml分別加入含系列抗菌藥物溶液的板中, 混勻，試管中最終抗菌藥物的濃度為原稀釋濃度的一半。6.4 培養(yǎng)將加有菌液和抗菌藥物的板，置35培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1620小時(shí)。6.5 結(jié)果測定取出培養(yǎng)后的板，觀察結(jié)果，以無菌生長的最低抗菌

33、藥物溶液的濃度為最低抑菌濃度（MIC）。6.6 結(jié)果判斷在質(zhì)控菌株的最低抑菌濃度符合規(guī)定范圍（附注1和2）的前提下，按判斷標(biāo)準(zhǔn)（附注1和2）判斷被檢菌株的敏感性敏感，中度敏感或耐藥。對于只給出敏感判斷標(biāo)準(zhǔn)的藥物，只報(bào)告其是否敏感即可。7注意事項(xiàng)7.1 冷凍或凍干菌株應(yīng)培養(yǎng)兩代后才可用于測定。7.2 調(diào)整好濁度的菌液應(yīng)于15分鐘內(nèi)稀釋至工作濃度。7.3 M-H肉湯的質(zhì)量對試驗(yàn)結(jié)果的影響7.3.1 M-H肉湯是常規(guī)藥敏試驗(yàn)中的最佳培養(yǎng)基，含磺胺，甲氧芐啶和四環(huán)素抑制劑較少，能滿足大多數(shù)快速生長的需氧菌或兼性厭氧菌的營養(yǎng)需求。7.3.2 試驗(yàn)一般采用商品脫水培養(yǎng)基，臨用時(shí)按照使用說明書進(jìn)行配制，需注

34、意培養(yǎng)基的pH值應(yīng)為7.27.4。7.3.3 有些生產(chǎn)商能直接提供已調(diào)節(jié)陽離子濃度的M-H肉湯，否則需用原子吸收光譜儀測定。 7.3.4 新鮮配制的培養(yǎng)基，應(yīng)按規(guī)定的處方，對培養(yǎng)基的原材料要進(jìn)行挑選，所選用的化學(xué)試劑均應(yīng)為分析純。7.3.5 如分離的菌種不典型或試驗(yàn)結(jié)果前后不一致時(shí)，應(yīng)對菌種進(jìn)行重新鑒定(jindng)或重新進(jìn)行藥敏測定。 8. 名詞解釋8.1 敏感(mngn) (Susceptibillity, S)：表明該菌株所致感染可以用推薦的抗菌藥物劑量進(jìn)行治療(zhlio)，除非存在禁忌癥。8.2 中介(Intermediate, I)：用抗菌藥物MIC濃度治療菌株感染，可使血液和組

35、織中藥物濃度接近通?？蛇_(dá)到的水平，而抗生素治療的反應(yīng)率可能低于敏感株。意味著藥物生理濃度部位具有臨床效力（如尿液中的喹諾酮類和內(nèi)酰胺類）或可用高于正常劑量的藥物進(jìn)行治療（內(nèi)酰胺類）。該類還包括一個(gè)緩沖區(qū)，可防止微小的，未能控制的技術(shù)因素造成的結(jié)果解釋錯(cuò)誤，特別是對那些安全范圍窄的藥物。8.3 耐藥(Resistance, R)：指按常規(guī)劑量使用，抗生素通常達(dá)到的全身濃度不能抑制其生長的菌株，和/或某些抗菌藥物的抑菌圈直徑在耐藥機(jī)制范圍，且臨床治療效果不可靠。9參考文獻(xiàn)9.1 Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing;fifteenth Informational Supplement.Clinical and Laboratory Standards Institute.9.2 Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated from Animals；Ap