生物化學與分子生物學八年制課件9

1、蛋白質的合成與加工Protein Synthesis and Processing第十八章1954年，Paul Zamecnik及其同事實驗證明體內蛋白質是由氨基酸合成的。1956年，他們發(fā)現了氨基酰-tRNA合成酶。1958年，M. B. Hoagland和Zamecnik又發(fā)現蛋白質生物合成需要可溶性RNA為中介。1961年，Howard Dintzis證明血紅蛋白肽鏈合成方向是從N-末端向C-末端進行。 19611966年間，Nirencerg、Matthaei和Khorana先后確定了64個遺傳密碼。19731976年，麥胚無細胞體系、兔網織無細胞體系分別建立，蛋白質合成的具體過程終于

2、揭曉。蛋白質的生物合成，即翻譯（translation）翻譯的過程就是將核酸中核苷酸序列編碼的遺傳信息，通過遺傳密碼破譯的方式解讀為蛋白質分子中20種氨基酸的排列順序 。蛋白質合成體系的組成Components Required for Protein Biosynthesis第一節(jié) 參與蛋白質生物合成的三種RNA：mRNA（messenger RNA, 信使RNA）rRNA（ribosomal RNA, 核糖核蛋白體RNA）tRNA（transfer RNA, 轉移RNA）輔助因子包括:起始因子(initiation factor, IF)延長因子(elongation factor, EF

3、)釋放因子（終止因子）(release factor, RF) 等 氨基酰-tRNA合成酶(aminoacyl-tRNA synthetase) 一、mRNA是蛋白質/多肽鏈合成的模板在遺傳信息傳遞過程中，DNA轉錄生成mRNA，mRNA作為蛋白質合成的直接模板，指導蛋白質多肽鏈的合成。 mRNA包括5-非翻譯區(qū)(5-untranslated region, 5-UTR)開放閱讀框架區(qū)(open reading frame, ORF)3-非翻譯區(qū)(3-untranslated region, 3-UTR)原核生物mRNA真核生物mRNA非翻譯區(qū)核蛋白體結合位點起始密碼子終止密碼子編碼序列PPP

4、53蛋白質PPPmG -53蛋白質AAA目 錄（一）mRNA含有64種密碼子mRNA分子上每3個核苷酸構建一個密碼子，編碼某一特定氨基酸或作為蛋白質合成的起始、終止信號，稱為三聯體密碼(triplet codon)，也稱遺傳密碼子(genetic codon)。起始密碼(initiation codon): AUG 終止密碼(termination codon): UAA、UAG、UGA 遺傳密碼表目 錄遺傳密碼具有通用性 (universal)（二）遺傳密碼具有幾個特性從原核生物生物（包括病毒、細菌等）、真核生物以及人類都共同使用同一套遺傳密碼。 已發(fā)現少數例外，如動物細胞的線粒體、植物細胞

5、的葉綠體。 密碼子具有方向性(direction)起始密碼子總是位于mRNA開放閱讀框架的5末端，終止密碼子位于3末端。 翻譯的方向是從5到3末端。 3. 遺傳密碼具有連續(xù)性(commaless) 密碼子按5 3方向每3個一組閱讀框架順序翻譯，無標點、不重疊，即連續(xù)性mRNA開放閱讀框架內發(fā)生一個或兩個堿基插入或缺失，可引起移碼突變(frameshift mutation)。翻譯的蛋白質氨基酸順序則發(fā)生改變。 4. 遺傳密碼具有簡并性(degeneracy)目 錄簡并性，即同一種氨基酸具有多個密碼子，或者多個密碼子代表一種氨基酸的現象。遺傳密碼中，除色氨酸和甲硫氨酸僅對應一個密碼子外，其余氨基

6、酸均有一個以上密碼子為其編碼。簡并性(degeneracy)目 錄5. 遺傳密碼具有擺動性（wobble）編碼同一氨基酸的不同密碼子互稱同義密碼子；同義密碼子之間的差異通常只在第3位堿基上，密碼子第3位堿基與tRNA反密碼子不嚴格遵守堿基配對規(guī)律，而是擺動堿基配對。 U擺動配對目 錄密碼子、反密碼子配對的擺動性tRNA反密碼子第1位堿基IUGACmRNA密碼子第3位堿基U、C、AA、 GU、CUG二、一種tRNA只能轉運一種氨基酸但一種氨基酸可由幾種tRNA轉運反密碼環(huán)氨基酸臂tRNA的三級結構示意圖三、rRNA與蛋白質組成核糖體 目 錄 蛋白質合成場所核糖體的組成目 錄原核生物核糖體 70

7、S Mt 2.7106 真核生物核糖體 80S Mt 4.2106核糖體在蛋白質合成中有主要作用： 核糖體兩亞基上具有結合mRNA的位點，還有與起始因子、延長因子、釋放因子及各種酶的結合位點；并且具有兩個tRNA結合的位點；A位點是氨基酰tRNA結合位點，P位點是肽酰tRNA結合位點。通過將mRNA、氨基酰-tRNA和相關的蛋白因子放置在正確的位置來調節(jié)蛋白質的合成。核糖體是合成蛋白質的場所。20種氨基酸（AA）酶及眾多蛋白因子，如氨基酰-tRNA合成酶、起始因子(initiation factor，IF) 、延長因子（elongation factor，EF）、釋放因子（release fa

8、ctor，RF）。 ATP、GTP無機離子四、蛋白質合成體系還需要其他輔助因子大腸桿菌蛋白質合成的5個階段所需化合物1氨基酸的活化20種氨基酸20種氨基酰-tRNA合成酶32種（或多于32種）tRNAATP、Mg2+2起始mRNAN-甲酰甲硫氨酰-tRNAfmermRNA上的起始密碼子（AUG）30S核糖體亞基50S核糖體亞基起始因子（IF-1, IF-2, IF-3）GTP、Mg2+3延長具有功能的70S核糖體（起始復合物）密碼子特異的氨基酰-tRNA延長因子（EF-Tu, EF-Ts, EF-G）GTP、Mg2+4終止與釋放mRNA上的終止密碼釋放因子（RF-1, RF-2, RF-3）5

9、折疊和翻譯后的加工特異酶、輔助因子、除去起始殘基和信號肽所需的化合物，水解過程，末端殘基的修飾，磷酸、甲基、羧基、碳水化合物或輔基結合到蛋白質上階段必需化合物1氨基酸的活化20種氨基酸20種氨基酰-tRNA合成酶32種（或多于32種）tRNAATP、Mg2+2起始mRNAN-甲酰甲硫氨酰-tRNAmRNA上的起始密碼子（AUG）30S核糖體亞基50S核糖體亞基起始因子（IF-1, IF-2, IF-3）GTP、Mg2+3延長具有功能的70S核糖體（起始復合物）密碼子特異的氨基酰-tRNA延長因子（EF-Tu, EF-Ts, EF-G）GTP、Mg2+4終止與釋放mRNA上的終止密碼釋放因子（R

10、F-1, RF-2, RF-3）5折疊和翻譯后的加工特異酶、輔助因子、除去起始殘基和信號肽所需的化合物，水解過程，末端殘基的修飾，磷酸、甲基、羧基、碳水化合物或輔基結合到蛋白質上階段必需化合物蛋白質的合成過程Protein Synthesis Process 第二節(jié)氨基酸的活化肽鏈合成的起始(initiation)肽鏈的延長(elongation)肽鏈合成的終止(termination )及釋放整個翻譯過程可分為4個階段 ：翻譯過程從開放閱讀框架的5-AUG開始向3閱讀，按mRNA上三聯體密碼的順序指導蛋白質從N端向C端合成，直至終止密碼。 氨基酸 + tRNA氨基酰- tRNAATP AMP

11、PPi氨基酰-tRNA合成酶（一）氨基酰-tRNA合成酶催化氨基酸與tRNA的連接一、氨基酸活化成氨基酰-tRNA氨基酰-tRNA合成酶(aminoacyl-tRNA synthetase)第一步反應:氨基酸 ATP-E 氨基酰-AMP-E PPi 目 錄第二步反應:氨基酰-AMP-E tRNA 氨基酰-tRNA AMP E目 錄（型）氨基酰-tRNA合成酶對底物氨基酸和tRNA都有高度特異性。氨基酰-tRNA合成酶具有校正活性(editing activity)，即酯酶的活性 。氨基酰-tRNA的表示方法：Ser-tRNASerMet-tRNAMet （二）氨基酰-tRNA合成酶具有校讀作用

12、二、起始階段形成翻譯起始復合物指在起始因子的作用下，mRNA和起始氨基酰-tRNA分別與核糖體結合而形成翻譯起始復合物 (translational initiation complex)。原核生物中有3種起始因子(initiation factor，IF) ：IF-1、 IF-2、 IF-3真核生物起始因子被稱作eIF (eukaryotic initiation factor) eIF-1、-2、-3、-4、-5和-6 翻譯的起始因子真核起始因子功能eIF-1 多功能因子，參與多個翻譯步驟eIF-2 促進起始Met-tRNAMet與核糖體40S小亞基結合eIF-2B 又稱鳥苷酸交換因子，將

13、eIF-2上的GDP交換成GTP eIF-3 首先與40S小亞基結合的因子，并能加速后續(xù)步驟eIF-4A 具有RNA解旋酶的活性，能解除mRNA 5端的發(fā)夾結構，使其與40S小亞基結合。是eIF-4F的組成成分eIF-4B 與mRNA結合，對mRNA進行掃描并定位第一個AUGeIF-4E 結合mRNA的帽子結構，是eIF4F的組成成分eIF-4G 一種接頭蛋白，能與eIF-4E、eIF-3和poly A結合蛋白結合將40 S的小亞基富集至mRNA，而刺激翻譯。是eIF4F的組成成分eIF-5 促進上述起始因子從40S小亞基脫落，以便40S小亞基與60S大亞基結合形成80S起始復合物eIF-6

14、促進無活性的80S核糖體解聚生成40S小亞基和60S大亞基原核起始因子功能IF-1 防止tRNA過早地結合到A位IF-2 促進fMet-tRNAfMet結合到30S小亞基IF-3 結合30S小亞基，防止它過早地與50S大亞基結合，并提高P 位對fMet-tRNAfMet的特異性真核起始因子功能eIF-1 多功能因子，參與多個翻譯步驟eIF-2 促進起始Met-tRNAMet與核糖體40S小亞基結合eIF-2B 又稱鳥苷酸交換因子，將eIF-2上的GDPGTP eIF-3 首先與40S小亞基結合的因子，并能加速后續(xù)步驟eIF-4A 具有RNA解旋酶的活性，能解除mRNA 5端的發(fā)夾結構，使其與4

15、0S小亞基結合。是的組成成分eIF-4B 與mRNA結合，對mRNA進行掃描并定位第一個AUGeIF-4E 結合mRNA的帽子結構，是的組成成分eIF-4G 一種接頭蛋白，能與、eIF-3和poly A結合蛋白結合將40 S的小亞基富集至mRNA，而刺激翻譯。是eIF4F的組成成分eIF-5 促進上述起始因子從40S小亞基脫落，以便40S小亞基與60S大亞基結合形成80S起始復合物eIF-6 促進無活性的80S核糖體解聚生成40S小亞基和60S大亞基原核起始因子功能IF-1 防止tRNA過早地結合到A位IF-2 促進fMet-tRNAfMet結合到30S小亞基IF-3 結合30S小亞基，防止它

16、過早地與50S大亞基結合，并提高P 位對fMet-tRNAfMet的特異性（一）原核生物在起始因子參與下組裝翻譯起始復合物 1原核生物翻譯起始形成70S起始復合物IF-1、IF-3結合解聚的核糖體30S小亞基 ；mRNA結合核糖體30S小亞基；在IF-1的作用下， fMet-tRNA結合mRNA的起始密碼子； 50S核糖體大亞基參入復合物。原核生物： fMet-tRNAifMet真核生物： Met-tRNAiMet肽鏈合成的起始氨基酰-tRNA:IF-3IF-1（1）IF-3、IF-1結合解聚的30S核糖體小亞基 目 錄AUG53IF-3IF-1（2）mRNA結合核糖體30S小亞基 目 錄S-

17、D序列（Shine-Dalgarno sequence）又稱核糖體結合位點（ribosomal binding site, RBS） IF-3IF-1IF-2GTP（3）在IF-1的作用下， fMet-tRNA結合mRNA的 起始密碼子 AUG53目 錄IF-3IF-1IF-2GTPGDPPi(4) 利用IF-2具有GTP酶的活性，催化GTP水解，起始因子釋放，50S大亞基與30S小亞基結合，形成70S起始復合物，fMet-tRNAfMet位于核糖體上的P（peptidyl）位。AUG53目 錄IF-3IF-1AUG53IF-2GTPIF-2-GTPGDPPi目 錄（二）真核細胞蛋白質合成起始

18、機制與 原核相似但更復雜 真核細胞的蛋白質合成過程中需要更多的蛋白質因子，步驟更為復雜，但基本過程與原核細胞中相似。 1 . 真核生物的核糖體為80S 2 . 真核生物的起始氨基酸是甲硫氨酸，而不是N-甲酰甲硫氨酸。3. AUG是真核生物中起始密碼子，mRNA 的5末端AUG一般就是起始位點4 . 真核較原核有更多的起始因子（用 elf表示），而且相互作用更復雜 真核生物翻譯起始復合物形成過程Met40S60SMetMet40S60SmRNAeIF-3elF-2-GTPGDP+Pi各種elF釋放elF-5ATPADP+PielF4E, elF4G, elF4A, elF4B,PABMetMet

19、-tRNAiMet43S前起始復合物48S前起始復合物80S翻譯起始復合物三、新生肽鏈通過核糖體循環(huán)而延長 肽鏈延長在核糖體上連續(xù)、循環(huán)式進行，稱為核糖體循環(huán)(ribosomal cycle)，每循環(huán)一次肽鏈延長一個氨基酸殘基，包括以下三步：進位(entrance)成肽(peptide bond formation)轉位(translocation)延伸過程所需蛋白因子稱為延長因子(elongation factor, EF)。原核生物：EF-T (EF-Tu, EF-Ts)EF-G真核生物：EF-1 、EF-2 AUG53翻譯起始復合物A位：氨基酰位(aminoacyl site)P位：肽酰

20、位(peptidyl site)目 錄又稱注冊(registration)指根據mRNA下一組遺傳密碼指導，使相應氨基酰-tRNA進入核糖體A位。 目 錄（一）氨基酰-tRNA在EF-Tu-GTP協助下進入A位（即進位） 延長因子EF-T催化進位（原核生物） 第二個氨基酰-tRNA在EF-Tu-GTP引導下進入核糖體的A位，伴隨GTP水解、Tu-GDP脫離tRNA, 而結合Ts和GTP，引導下一個氨基酰-tRNA進位。 TuTsGTPGDPAUG53TuTsGTP目 錄由肽基轉移酶催化肽鍵形成（二）P位氨基?；?肽?；cA位氨基酰- tRNA氨基形成肽鍵（即成肽） （三）在延長因子EF-G和G

21、TP參與下促進 核糖體沿mRNA移動/轉位 在原核生物，轉位依賴延長因子EF-G；在真核生物，則依賴GTP和EF-G的相應蛋白質EF-2。fMetAUG53fMetTuGTP目 錄進位轉位成肽 （四）核糖體在肽鏈延長階段有校讀作用 核糖體的校讀功能建立在正確的密碼子與反密碼子相互作用的基礎上。 四、肽鏈合成終止階段釋放新生的肽鏈肽鏈合成的終止包括終止密碼的識別，肽鏈從肽酰-tRNA中釋出，從核糖體分離出mRNA和大、小亞基拆開。 終止過程需要的蛋白因子稱為釋放因子 (release factor, RF)1. 識別終止密碼，如RF-1特異識別UAA、UAG；而RF-2可識別UAA、UGA。2.

22、 幫助完成合成的多肽從P位點的tRNA釋放。 釋放因子的功能：原核生物釋放因子：RF-1、RF-2、RF-3 真核生物釋放因子：eRF 原核生物肽鏈合成終止過程 UAG53RFCOO-目 錄多聚核蛋白體(polysome)：mRNA與多個核糖體的聚合物使蛋白質合成以高速度、高效率進行。目 錄電鏡下的多聚核糖體現象目 錄翻譯后的折疊和加工修飾Folding and PosttranslationalProcessing第三節(jié)從核糖體釋放出的新生多肽鏈不一定是具備生物活性的成熟蛋白質，必需經過各種翻譯后修飾、加工過程才轉變?yōu)橛谢钚缘某墒斓鞍?。主要包括：蛋白質折疊（protein folding）翻

23、譯后加工（post-translation processing） 一、新生肽鏈經歷翻譯后修飾（一）肽鏈N端和C端的切除和/或化學修飾細胞內的脫甲酰基酶或氨基肽酶可以去除N-甲?；-末端蛋氨酸或N-末端的一段肽鏈。 在真核細胞，50%的蛋白質在翻譯后，氨基末端的氨基發(fā)生乙?；?。 有些情況下，羧基末端的殘基也可被酶切除。 （二）水解加工包括多蛋白水解加工和內含肽的剪接1多蛋白水解加工可產生多種肽鏈一些蛋白質在合成之初是含有一系列頭尾相連的蛋白質的長多肽鏈。多肽鏈的水解將裂解釋放出各種蛋白質，釋放出的蛋白質可能具有完全不同的功能，這些蛋白質稱為多蛋白。 阿皮素原(POMC)的水解加工：NC信號

24、肽KRKR103肽ACTH-LT-MSH-MSHEndophin2內含肽切除導致外顯肽連接 內含肽是蛋白質的內部片段，翻譯后很快被剪切，兩個外顯肽連接到一起。內含肽的長度一般在300 600個氨基酸之間。剪接是由內含肽自我催化的。1. 個別氨基酸可進行甲基化和乙?；揎?2. 蛋白質糖基化（glycosylation）修飾是一種 復雜的化學修飾 3. 某些蛋白質加入異戊二烯基團4. 結合蛋白質加入輔基5. 大多數蛋白質有二硫鍵的形成 （三）氨基酸殘基的化學修飾有多種形式二、折疊是肽鏈高級結構形成的過程第一種模式認為是按等級進行的 ：新生肽鏈隨著序列的不斷延伸按等級逐步折疊，產生正確的二級結構、

25、模序直至形成結構域和多肽鏈。 第二種模式：多肽鏈通過非極性殘基間疏水作用介導,自動折疊成 “熔球（molten globule)”的緊密結構。細胞內大多數天然蛋白質折疊需要一些輔助性蛋白。 （一）多肽鏈通過分步反應快速地進行折疊核糖體結合的分子伴侶： 觸發(fā)因子（trigger factor，TF） 新生鏈相關復合物（nascent chain-associated complex，NAC） 非核糖體結合的分子伴侶： 70kD/40kD熱休克蛋白（heat shock protein, Hsp）家族 60kD/10kD熱休克蛋白家族 蛋白質二硫鍵異構酶 肽酰脯氨酸異構酶1分子伴侶有核糖體結合和非

26、核糖體結合兩類（二）分子伴侶參與蛋白質折疊細胞內分子伴侶完成以下功能：封閉待折疊蛋白暴露的疏水區(qū)段； 創(chuàng)建一個隔離的環(huán)境，蛋白質可互不干擾在此折疊； 促進折疊和去聚合； 遇到應激，使已折疊的蛋白質去折疊。（1）熱休克蛋白70(Hsp70)的兩個主要功能域為折疊所必需還需要輔助因子Hsp40和Grp E非核糖體結合的分子伴侶 Hsp70反應循環(huán)（2）大腸桿菌的Gro EL屬于熱休克蛋白60（Hsp60）家族需要輔分子伴素10(cochaperonin 10) Gro ES的幫助（3） 二硫鍵異構酶催化鏈內或鏈間二硫鍵形成多肽鏈內或肽鏈之間二硫鍵的正確形成對穩(wěn)定分泌蛋白、膜蛋白等的天然構象十分重要

27、，這一過程主要在細胞內質網進行。 二硫鍵異構酶在內質網腔活性很高，可加速形成正確配對的二硫鍵 ，從而促進蛋白質折疊的全過程。（4） 脯氨酰順-反異構酶催化順反異構加速折疊多肽鏈中肽酰-脯氨酸間形成的肽鍵有順反兩種異構體，空間構象差別明顯。 脯氨酰順-反異構酶可促進上述順反兩種異構體之間的轉換。 脯氨酰順-反異構酶催化這種異構化的過程，可加速蛋白質的折疊。2.目前對大腸桿菌的蛋白質折疊過程了解較多（1） 折疊過程首先經歷Hsp70反應循環(huán)Hsp40結合未折疊蛋白Hsp70-ATP復合物Hsp70-ADP-未折疊蛋白復合物Grp E ADP釋放ATP結合Hsp70 ，釋出完成部分折疊的蛋白質Hsp

28、40- Hsp70-ATP-未折疊蛋白復合物ATPADP（2）部分折疊的蛋白質尚需經歷GroEGro ES 反應循環(huán)三、亞單位聚合形成多亞基蛋白質由一條以上肽鏈構成的蛋白質和帶有輔基的結合蛋白質，肽鏈之間或多肽鏈與輔基之間需要聚合，方可成為活性蛋白質。四、蛋白質合成后經靶向輸送到細胞特異區(qū)間 新合成的蛋白質/多肽鏈須經分選、靶向輸送到細胞特異區(qū)間或亞細胞器，在那里進行翻譯后加工或發(fā)揮作用。 大腸桿菌新合成的多肽，一些仍停留在胞漿之中，一部分則被送到質膜、外膜或質膜與外膜之間的空隙。有的也可分泌到胞外。 真核細胞中新合成的多肽被送往溶酶體、線粒體、葉綠體、細胞核等亞細胞器。所以新合成的多肽的輸送是有特異靶向的。 一部分核糖體以游離狀態(tài)停留在胞質中，它們只合