淺論家族性肌萎縮側(cè)索硬化癥研究中pGBKT7

1、淺論家族性肌萎縮側(cè)索硬化癥研究中 pGBKT7淺論家族性肌萎縮側(cè)索硬化癥研究中 pGBKT7【摘要】目的 構(gòu)建能在酵母菌AH109中表達(dá)的mSODIcDNA穿梭表達(dá)質(zhì)粒pGBKT7-mSOD1cDNA突變SOD用碼蛋白白蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。方法 通過(guò) PCRt以真核表達(dá)載pEGFP-mSOD1cD喃板，擴(kuò)增獲得了 120bp的mSODl因的 末端及DNA吉合域的片段，經(jīng)過(guò)Sal?、EcoR%(酶切后，基因重組的方法定向亞克 隆于酵母雙雜交載體pGBKT神，構(gòu)建形成pGBKT7-mSOD1核表達(dá)載體。結(jié)果 經(jīng) 轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒雙酶切，核甘酸測(cè)序，BALST：匕對(duì)鑒定表明構(gòu)建成功。結(jié)論 成功 構(gòu)

2、建穿梭質(zhì)粒pGBKT7-mSOD1cRNA深入研究突變的SOD1因編碼蛋白的蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)相互作用奠定了基礎(chǔ)。【關(guān)鍵詞】 酵母雙雜交載體 亞克隆 mSOD1cDNA pGBKT7 Abstract:Objective To Construct of pGBKT7 mSOD1 Yeast Two Hybrid Expression Vector in study of familial amyotrophic lateral sclerosis and to study Protein protein interactions of mutation SOD1 encode protein.

3、 Methods We got the mSOD1 fragment from pEGFP mSOD1 by polymer case reaction(PCR). After digestion by Sal?and EcoR?,mSOD1 fragment was subcoloned into Yeast Two Hybird expression vector pGBKT7. Results At last, pGBKT7 mSOD1 Yeast Two Hybrid expression vector was constructed and confirmed by Redigest

4、ion. Conclusion The construction of pGBKT7 mSOD1 is helpful to the studying of Protein protein interactions. Key words:Yeast Two Hybird;expression Vector; subclone; mSOD1CcDNA; pGBKT7 根據(jù)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase , SOD途金屬的不同，可將其分為 3種，分別為Cu,Zn-SOD Mn-SOD Fe-SOD哺乳類(lèi)動(dòng)物體內(nèi)，僅含有 Cu,Zn-SODW Mn-SOD分布在胞 漿中Cu

5、,Zn-SOD稱(chēng)為SOD1分布于線(xiàn)粒體中Mn-SOD稱(chēng)為SOD2分布于胞外 Cu,Zn-SO而為SOD3其中SOD促細(xì)胞中高水平表達(dá)的 SOD是SOD勺主要形 式,1, 。研究小組在對(duì)一個(gè)肌萎縮側(cè)索硬化癥家系致病基因的研究中發(fā)現(xiàn),2, ， SOD1第二號(hào)外顯子出現(xiàn)突變，測(cè)序分析證實(shí)第 2號(hào)外顯子編碼區(qū)插入了一個(gè)堿基 A,第 2外顯子的插入突變導(dǎo)致SOD假錄和翻譯時(shí)閱讀框改變，結(jié)果 SOD翻譯提前終 止，研究小組把這108個(gè)堿基對(duì)的cDNAg命名為mSODIcDNA,交GenBank獲得 的編號(hào)是EF14399Q本文報(bào)告載體pGBKT7-mSOD1cDN婕，為研究 mSOD1因突 變編碼蛋白的蛋

6、白質(zhì)- 蛋白質(zhì)相互作用奠定了基礎(chǔ)。材料與方法材料主要試劑 :限制性?xún)?nèi)切酶Sal?、EcoR2 Taq聚合酶購(gòu)自大連Takara公司。DNA!接試劑盒購(gòu)自美國(guó) MBI 公司，卡那霉素購(gòu)自上海華美公司，質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司。菌株和質(zhì)粒:pGBKT7購(gòu)自美國(guó)BD Clontech公司，pEGFP-mSOD1本課題組提供，大腸桿菌DH5x為燒傷研究所提供。根據(jù) mSOD1cDNA序列設(shè)計(jì)引物：pGBKT7-mSODE1c-oRIsense5-gacGAATTCATGGCGACG3AAG,p-GBKT7-mSOD1-SalIantisense:5 -gacGTCGACATGCTTCC

7、CCACACCTTC ATCT物由上海生工生物科技有限公司合成。1.儀器設(shè)備 :臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科儀廠(chǎng)生產(chǎn)），PCROZ（美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)），電泳儀（ 美國(guó) Bio-Rad 公司生產(chǎn) ） ，手提紫外燈（美國(guó) Upland 公司生產(chǎn) ） ，凝膠成像儀系統(tǒng)Gel Doc2017（ 美國(guó) Bio-Rad 公司生產(chǎn) ）方法PCR 反應(yīng) :以 pEGFP-mSOD1cDNA（板，無(wú)核酸酶去離子水 36.5 仙 L, 10X PCR buffer （mg2+ free）5 仙 L,dNTP（2.5mM）4 仙 L,Mgcl2（25mM）3 L,上游引物 0.5 仙 L,下游 引物0.5仙L,

8、模板1仙L,Taq酶（5u/叱L）0.5炫L,總反應(yīng)體系50。擴(kuò)增條件： 94?預(yù)變性5min,緊跟30個(gè)循環(huán)，每一個(gè)循環(huán)94?變性30s,55?復(fù)性30s, 72?延伸 30s, 最后 72?延伸10min 補(bǔ)齊末端。PCR 產(chǎn)物電泳及低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠回收和純化 :取PCRK應(yīng)物5經(jīng)0.8%脂糖凝膠電泳，結(jié)果擴(kuò)增出一條約 120bp的片段。取余下的PCRT物45仙L行1.5%低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳，回收并純化 120bp的mSOD1cDNA段，再次5 叱L經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳，并測(cè)序。mSOD1酵母雙雜交表達(dá)載體 pGBKT7-mSOD1cDN:分別以EcoRW口 Sal?雙酶切pGBKT

9、TF口 mSOD回收純化酶切片段及線(xiàn)性化載 體，在T4DNA1接酶的作用下連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞Ecoli.DH5 a,將pGBKT7-mSOD1cDNA的細(xì)胞接種于卡那霉素選擇培養(yǎng)基上，37?培養(yǎng)12,16h ,挑出陽(yáng)性菌落搖菌，采用小質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，以EcoR體口 Sal?雙酶切鑒定。載體 pGBKT7-mSOD1cDN府和 BLAST比對(duì)。2結(jié)果2.1 mSODIcDNAt段的擴(kuò)增 以含有mSODIcDNA段的真核表達(dá)載體 pEGFP-mSODl模板，擴(kuò)增mSODIcDNA段，長(zhǎng)度120bp,如圖1所示。圖2為膠回收驗(yàn)證回收效果，從電泳圖看膠回收效果滿(mǎn)意。mSODI PCR

10、物測(cè)序結(jié)果2.2.1 mSODI PCR產(chǎn)物測(cè)序的序列結(jié)果：GAATTCatggcgacgaaggccgtgtgcgtgctgaagggcgacggcccagtgcagggcatcatcaattt cgagcagaaggaaagtaatggaccagatgaaggtgtggggaagcatGTCGAC 2.2.2 mSOD1 PCR 產(chǎn) 物測(cè)序的序列（圖3,見(jiàn)封2）測(cè)序圖各峰整齊，無(wú)重疊，該 PCRT物測(cè)序結(jié)果滿(mǎn) 意和可信。mSOD1cDN醉母雙雜交載體的亞克隆 將經(jīng)EcoRW口 Sal?雙酶切的 mSOD1cDNA線(xiàn)性化的pGBKT71接，轉(zhuǎn)化，提質(zhì)粒，酶切結(jié)果如圖4、5。將構(gòu)建的載體命名為

11、 pGBKT7-mSOD1cDNA.4 載體 pGBKT7-mSOD1cDNA的測(cè)序和BLAST比對(duì)結(jié)果2.4.1 載體pGBKT7-mSOD1cDNA序序歹結(jié)果：CGAGCCGCCATCATGGAGGAGCAGAAGCTGATCTCAGAGGAGGACCTGCATATGGCCATGGAG ATTCATGGCGACGAAGGCCGTGTGCGTGCTGAAGGGCGACGGCCCAGTGCAGGGCATCATCAATTT GAAGGAAAGTAATGGACCAGATGAAGGTGTGGGGAAGCATGTCGACCTGCAGCGGCCGCATAACTA ccccttggggcctctaaacg

12、ggtcttgaggggttttttgcgcgcttgCAGccaa 2.4.2 pGBKT7-mSOD1cDNAU序結(jié)果圖譜：（圖6,見(jiàn)封2）把mSOD1cDNA建到載體pGBKTTh,測(cè)序圖峰值整齊，無(wú)重 疊。.3 BLAST 比對(duì)結(jié)果 經(jīng)過(guò) BLAST!匕又t mSOD1cDNAir與 pGBKT7f連。3 討論 酵母雙雜交技術(shù)是20 世紀(jì) 90 年代興起的一種研究蛋白質(zhì)- 蛋白質(zhì)相互作用的高新分子生物學(xué)技術(shù)，3,依據(jù)真核轉(zhuǎn)錄因子的DNAM和活性域分離的特性 將兩者分離，即將酵母的轉(zhuǎn)錄因子 GAL4分為GAL4BU口 GAL4AD將擬研究的靶蛋 自(prey)和釣餌蛋自(bait)分別與

13、GAL4AD GAL4BD吉合形成融合蛋白，只有GAL硼控的報(bào)告基因才能表達(dá)，酵母才能在選當(dāng)靶蛋白與誘餌蛋白相互作用 時(shí)，擇性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。該技術(shù)不僅用于驗(yàn)證己知蛋白之間的相互作用 , 亦可以自 酵母雙雜交庫(kù)中尋找與誘餌蛋白相結(jié)合的新的蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)新基因。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase , SOD足一種金屬酶，它可以使超氧 陰離子O2-歧化為過(guò)氧化氫和分子氧，故在維持生物體內(nèi)氧自由基的平衡方面起重 要作用。研究表明，基于其細(xì)胞定位，認(rèn)為SOD任要參與防御外周質(zhì)及來(lái)自外界環(huán) 境中的超氧化物對(duì)機(jī)體的毒害 ,4-5, 。肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral

14、 sclerosis , ALS)是一種以腦和脊髓 中大的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性為特征的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，5%,10%的患者有家族性。臨床表現(xiàn)為緩慢起病，進(jìn)行性發(fā)展，逐漸出現(xiàn)四肢肌肉的無(wú)力、萎縮，伴錐體束征等。臨床治療非常困難。目前己肯定編碼銅、鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn superoxidedismutase, Cu/Zn SOD)的SOD1S因突變可引起部分家族性 ALS的發(fā)病,6,。SOD1 基因突變類(lèi)型多達(dá)100 種以上 ,7, 。為了進(jìn)一步研究該家系的發(fā)病機(jī)理，本文利用PC曲術(shù)和分子克隆方法，把 mSOD1cDNA序列亞克隆到酵母雙雜交的表達(dá)載體 pGBKT升，目的是為下一步酵母雙雜交打下

15、基礎(chǔ)，也是深入研究突變的SOD編碼蛋白的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的關(guān)鍵步驟之一?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 ,1,FaraciFM,Didion SP.Vascular protection superoxide dismutase is forms in the vessel wall,J,.Arterioscler Thromb Vasc Biol， 2017,24(1):1367-1373. ,2, 史樹(shù)貴，李露撕，陳康寧，等. 一個(gè)肌萎縮側(cè)索硬化家系 SOD1基因突變的發(fā)現(xiàn),J,. 中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志， 2017,21(2):149-152. ,3,Nakamura T,Hamada F,Ishida

16、te T ， et al. Axin,an inhibitor of the Wntsignalling pathway,interacts with beta-catenin,GSK-3beta and APC and reduces the beta-catenin level,J,.GenesCells,1998,3(6):395. ,4,Narasipura SD,Auit JG,Behr MJ,etal.Characterization of Cu,Zn superoxide dismutase(SOD1) gene knock-out mutant of Crptococcus n

17、eogormans var.gattii:role in biology and virulence,J,.Mol Microbiol ， 2017,47(6):168-1694. ,5,Piddingto DL,FangFC,Laessig T,et al.Cu,Zn superoxide dismutase of Mycobacterium tuberculosis contributes to survival in activated macrophages that are generation an oxidation burst,J,.Infect Immun， 2017,69(8):4980-4987. ,6,Rosen DR,Siddique T ， Patterson D,et al.Mutationin Cu/Zn superoxide dismutase gene ara associa