三分鐘了解4代基因測序技術

1、三分鐘了解4代基因測序技術基因檢測技術是近年來伴隨精準醫(yī)療概念的提出而迅速發(fā)展起來的一門科學技術，它可以從基因組機制上闡釋遺傳學、發(fā)育生物學、進化生物學等學科的經(jīng)典概念，在全基因組水平延伸了染色體高級構象、細胞異質性、功能模塊等新概念，為精準醫(yī)學開辟了應用性新領域。近年來，隨著分子水平的基因檢測技術平臺不斷發(fā)展和完善，基因檢測成為臨床診斷和硏究的熱點?；驒z測技術應用于遺傳病診斷、罕見病、產(chǎn)前篩查、臨床個體用藥以及腫瘤監(jiān)診斷療等領城的科硏成果也層出不窮。目前，應用較廣的基因檢測技術大致分三類：基因測序、以核酸擴增為基礎的PCR技術，以熒光雜交檢測為基礎的FISH技術。這三類技術溝通構成了基因檢

2、測基礎,大部分基因檢測項目都有賴于這三項基礎技術開展。與PCR和FISH技術相比，基因測序技術可直接讀取DNA分子的30億個堿基序列，具有高通量、數(shù)據(jù)量大的特點。此外，基因芯片技術應用范圍也較廣。技術分類檢測原理技術特點主翌應用領域PCR（聚合醐儲丈反應溫變成單慚低溫互補配劉誘合成諒易+便州；由于引徇二緊侔的存在蕓適成假陽性或假陰性，而不能進行高病基，細菌*ifi傳病題囚腫捲相關施因*肝蘇H性病肺釀染性挨病優(yōu)生優(yōu)高等檢測HSH（熒光原位雜交）定標記的己知順序垓議為採針與細胞或紹溟切片中核秫進行雜交.從而對待定核耐序進行佔確定量定位的過程靈敏薛軟高；成本較高杲瞬圖譜*満舟檢測二雜交測序方法.在-

3、塊墓片表囲定了序朝口知的杷核詩酸的探針,斥補匹配備定序列高通量；但不能擴增序列，口必須聯(lián)合仁號放大技術或占為靈敏陪的信號讀取枚器使用；易岀理假陽性藥物笛選，新藥開發(fā).疾疝K從U11液或肺液中分析測定垠丙全序列.預測福憲多種恢屈的可能性齋通Jt；認因氣訶茫果空面：斥宀墳粛析復雜9W基因檢測技術對比在本文中，小編匯總了4代基因測序技術并比較其優(yōu)缺點，以期幫助正在從事基因檢測工作或行業(yè)的您，了解這項技術的發(fā)展歷程?；蚪M學與基因檢測技術的概述基因組學是伴隨“人類基因組計劃”發(fā)展起來的一門新興學科，是新世紀科學的莫基學科，已成為生命科學發(fā)展的基礎性和引領性學科。20世紀50年代，Watson和Cric

4、k提出DNA雙螺旋結構后，人們對基因的遺傳學功能逐漸有所認識，并開始致力于DNA序列檢測的探索。1975年Sanger等發(fā)明了第一代測序技術并在1980年完成了人類歷史上第一個基因組序列-噬菌體X174的測序，它標志著人類正是進入基因組學時代。從1985年人類基因組計劃提出，到2001年人類基因組草圖完成，基因組學的硏究也從以全基因組測序轉向以基因功能鑒定為日標的后基因組時代?；驒z測技術經(jīng)過近70年的發(fā)，從第一代的雙脫氧鏈測序技術已經(jīng)發(fā)展到第四代固態(tài)納米測序技術。測序技術的發(fā)展使人們能夠方便準確地獲取大量的基因組信息，并將其應用于疾病的硏究，借此人們遜漸認識到基因變異與疾病發(fā)生發(fā)晨的關系。同

5、時，基因檢測技術也越來越多地被應用于疾病的臨床診斷和治療。第一代測序技術早在1954年，Whitfeld就已經(jīng)報道使用層析法測定了多聚核糖核苷酸的序列。第一代測序技術的標志是Sanger于1977年發(fā)明的DNA雙脫氧核苷酸末端終止測序法，以及Maxam和Gilbert于同年發(fā)明的DNA化學降解測序法。其中，Sanger法的核心原理是:由于dNTP的2和3都不含羥基，在DNA的合成過程中不能形成磷酸二酯鍵，因此可以用來中斷DNA合成反應。在4個DNA合成反應體系中分別加入一定比例帶有放射性同位素標記的ddNTP（分別為:ddATP、dCTP、dGTP和drP），通過凝膠電泳和放射自顯影后可以根據(jù)

6、電泳帶的位置確定待測分子的DNA序列。Sanger測序工作流程Sanger測序技術操作快速、簡單，因此被廣泛應用。20世紀80年代末，熒光標記技術憑借著更加安全簡便的特性，逐步取代同位素標記技術，由此也誕生了自動化測序技術。由于可以用不同熒光標記4種dNTP，使得最后產(chǎn)物的電泳分離過程可以在一個泳道內實現(xiàn)，用激光對ddNTP上的熒光標記進行激發(fā)，然后檢測不同波長的信號，通過計算機處理信號后可獲得堿基序列，很好地解決了原技術中不同泳道遷移率存在差異的問題。自動化儀測序大大提高了測序效率，如ABI3730和AmershamMEGABACE測序儀分別可以在一次運行中分析96個或384個樣本。第代測序

7、儀在人類基因組計劃DNA測序的后期階段起到了關鍵的作用，使人類基因組計劃比原計劃提前兩年完成。雙脫氧鏈末端終止法的優(yōu)點:（1）可用于未知或已知突變的檢測，更容易實行;（2）假條帶的出現(xiàn)減少，結果更加清楚;（3）讀取的長度也較長；（4）因為摻入了同位素標記的三磷酸，末端終止法可以測更小序列的核苷酸鏈；（5）基本適用于所有的突變類型，準確率幾乎100%，在單基因病的基因診斷和產(chǎn)前診斷中仍廣泛。使用雙脫氧末端終止法的缺點：（1）離不開PCR擴增，且只能分析單個的DNA片段，通量小，不能進行基因組層面的分析；（2）自動化程度低，檢測速度慢，對于某些需要快速檢測的疾病不適合；（3）雙脫氧鏈末終止法成本高

8、，不適用于大規(guī)模測序。第二代測序技術（NGS）當前最具代表性的第二代測序平臺包括:瑞土羅氏公司（Roche）的454測序儀、美國Illumina公司的Solexa基因組測序儀、美國ABI公司的SOLID測序儀等。第二代測序技術的原理是邊合成邊測序，即依照第一代Sanger測序技術的原理，通過測序儀器捕捉新?lián)饺说哪┒藷晒鈽擞泚泶_定DNA序列組成。鑒于Illumina的NGS技術已經(jīng)成為市場主流，因此接下來將詳細介紹Illumina的Solexa測序技術的。IlluminaSolexa測序流程Solexa測序工作流程Solexa測序核心技術是DNA簇和可逆終止化學反應。測序前先將模板樣品DNA片段

9、打碎形成100200bp的片段，然后在這些片段兩端加上特定的測序接頭。而Solexa高通量測序芯片表面附著一層單鏈引物，兩端連有接頭的單鏈DNA片段通過與芯片表面的引物堿基互補結合，經(jīng)PCR擴增成為雙鏈。至此DNA的一端就被錨定在測序芯片上，而另一端則隨機和附近的引物互補結合，從而也被固定住，形成橋式結構。這樣經(jīng)過反復30輪擴增循環(huán)后，每個DNA片段得到約1000倍擴増，形成單克隆DNA簇。然后摻入經(jīng)過改造的DNA聚合酶和帶有4種熒光標記的DNTP。這些dNTP就是“可逆終止子”，其3羥基端帶有可化學切割的部分，每個循環(huán)只允許摻入1個堿基用激光掃描測序芯片表面，賣取聚合上去的相關核苷酸種類。隨

10、后將這些核苷酸化學切割，恢復3端黏性。繼續(xù)聚合核苷酸。如此循環(huán)，直至每條模板序列都被聚合成雙鏈。此過程中帶有熒光標記的dTP能夠釋放出相應的熒光，測序儀據(jù)此捕捉熒光信號，之后計算機可以將熒光信號轉化為不同顏色的測序峰圖，便可得知測序樣品的DNA序列較第一代測序技術而言，第二代測序技術的測量通量顯著提高，是目前市場上主流的測序技術。但邊合成邊測序的原理也為其帶來相應不足之處，測序讀長較短和需要模板擴増是兩個主要的弊端所在。第二代測序的讀長一般在700bp左右，為后續(xù)的序列拼接、組裝及注釋等生物信息學分析帶來了較大困難；由于PCR反應的靈敏性，導致擴增前后得到的DNA分子片段的數(shù)目有較大偏差，因此

11、在分析基因表達方面存在較大的弊端。在此基礎上，無需擴増、讀長更長的第三代測序技術便應運而生。NGS的優(yōu)勢：（1）高通量，高淮確性，高靈敏度；（2）自動化程度高；（3）成本低；（4）可用于未知物種，未知基因的檢測。第三代測序技術（單分子DNA測序）第三代測序技術基于單分子讀取技術，不需要PCR擴增，具有巨大的應用前景?，F(xiàn)有的第三代測序平臺包括美國HelicosBioscience公司的Heliscope遺傳分析系統(tǒng)和PacifficBiosciences公司的單分子實時測序系統(tǒng)(SMRT)。兩者均繼承了第二代測序技術的邊合成邊測序的原理，其中SMRT系統(tǒng)是基于零級波導(zeromodewaveg

12、uide，ZMW)的測序技術。ZMW是種直徑50100m、深約100mm的孑匕狀納米光電結構，當光線進人后呈指數(shù)衰減，僅靠近基底的部分被照亮。DNA聚合酶被固定在ZMW底部，加入模版、引物和4色熒光標記的dTP后進行DNA合成，只有參加反應的dNTP才能停留在ZMW底部，從而使dNTP的熒光信號被識別。第三代測序技術是計算機學、生物學、化學等多個學科領域硏究相結合的結晶，功能非常強大。其顯著特點是單分子測序，即不經(jīng)PCR，可直接進行邊合成邊測序。這不僅簡化了樣品處理過程，避免了擴增可能引入的錯配，而且不受A、T、G、C這4種堿基含量的影響，因此第三代測序技術能直接對RNA和甲基化DNA序列進行

13、測序。SMRT優(yōu)點：超長讀取；無需模板擴增；(3)運行時間短，讀取速度可達每秒10個堿基；(4)能夠直接檢測表觀修飾位點。第四代測測序技術(納米孔測序)目前，第二、三代測序技術均是基于光信號的測序技術，都需要昂貴的光學監(jiān)測系統(tǒng)，并依賴DNA聚合酶讀取堿基序列，大大地増加了測序的成本。因此開發(fā)不使用生物化學試劑，直接讀取DNA序列信息的新型測序方法，就成為第四代測序技術的主要思想。其中的代表當屬納米孔測序，如英國OxfordNanoporeTechnologies公司所開發(fā)的納米孔測序，是基于電信號的測序技術。它利用鑲嵌于脂質雙分子層中的經(jīng)過基因工程改造過的-溶血素蛋白作為納米孔道，孔內共價結合有分子接頭。由于A、T、G、C這4種堿基存在電荷差異，當DNA堿基通過納米孔時，從而短暫地影響流過納米孔的電流強度（4種堿基所影響的電流變化幅度各不相同），靈敏的電子設備檢測到這些變化從而鑒定所通過的堿基。雖然納米孔測序的優(yōu)點十分明顯，與前幾代技術相比在成本、速度方面