十大功勞體外抗H3N2型豬流感病毒的作用研究(共8頁)

1、 PAGE 12十大功勞(gng lo)體外抗H3N2型豬流感病毒的作用(zuyng)研究(ynji)摘要：采用水煎法提取十大功勞水煎液，測定其對(duì)MDCK細(xì)胞的最大安全濃度為0.977mg/ml。將最大安全濃度的十大功勞水煎液倍比稀釋，并通過三種不同的加藥方式，采用MTT法觀察十大功勞在MDCK細(xì)胞上對(duì)H3N2豬流感病毒的作用效果。結(jié)果表明十大功勞在對(duì)MDCK細(xì)胞的安全濃度范圍內(nèi)，對(duì)H3N2豬流感病毒沒有明顯的阻斷作用和抑制的作用。關(guān)鍵詞：十大功勞水煎液；H3N2型豬流感病毒；體外作用；MTT法Studies on the Activity of Mahonia Fortunei on H3N

2、2 Subtype SIV in VitroYANG Shu(Class 1 of Animal Medicine, Graduated in 2013)Abstract: In this experiment，Mahonia Fortunei decoction was extracted from Mahonia Fortunei by waterextraction and was added into MDCK cells to observe their effects on the MDCK cells proliferation.The maximum safe concentr

3、ation is 0.977mg/ml.Then,the Mahonia Fortunei decoction and H3N2 subtype swine influenza virus(SIV) was add into MDCK cells by the following three ways:adding medicine firstly,adding virus firstly and adding medicine and virus simultaneously to observe their anti-virus functions.MTT colorimetric ass

4、ay was used to detect the effects of the Mahonia Fortunei decoction.The results showed that in the safe concentration scope,Mahonia Fortunei does not have a good blocking and inhibitory action to SIV in vitro.Key words:Mahonia Fortunei decoction;H3N2 subtype SIV;Activity in vitro;MTT豬流感(swine influe

5、nza，SI)主要是由正黏病毒科甲型流感病毒引起的豬的一種急性、高度接觸性呼吸道傳染病，以突發(fā)、咳嗽、呼吸困難、衰竭、迅速康復(fù)或死亡為特征，各年齡、性別和品種的豬均能感染，發(fā)病率高，恢復(fù)緩慢，阻礙增重，降低肉料比，直接影響豬群健康狀態(tài)，是規(guī)?；B(yǎng)豬場普遍存在且難以根除的豬群發(fā)性疾病之一，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害極大。此外，SIV還可引起呼吸道細(xì)菌和病毒的繼發(fā)或混合感染，使疫情更為復(fù)雜，死亡率增高，由此引起的經(jīng)濟(jì)損失更無法估量1。豬群中一旦出現(xiàn)流感病例，即迅速傳播，發(fā)病率可達(dá)100，但病程很短，一般l3周可自行康復(fù)。目前豬流感病毒(SIV)血清亞型至少發(fā)現(xiàn)有H1N1、H1N2、H1N7、H3N1、H2N3、

6、H3N2、H3N6、H4N6、H5N1、H9N2等10種，廣泛流行于豬群中的主要有古典型豬H1N1、類禽型H1N1和類人型H3N2毒株。豬流感不但給養(yǎng)豬業(yè)帶來威脅，對(duì)人與其他動(dòng)物的健康也帶來難以預(yù)測的影響。十大功勞(gng lo)為小檗科 HYPERLINK /view/585715.htm t _blank 十大功勞(gng lo)屬植物(zhw)，全世界約有100多種。是一種常見的觀賞性植物，主要分布于西亞、東亞及中北美地區(qū)。在我國境內(nèi)約有50多種，主產(chǎn)于長江以南及臺(tái)灣各省。其中以闊葉十大功勞、細(xì)葉十大功勞和華南十大功勞比較常見。又名土黃連、刺黃芩。十大功勞在我國民間藥用已久，具有清熱燥濕

7、、瀉火解毒、暇陰益肺、兼補(bǔ)肝腎之功效2。該屬植物主要以根、莖、葉入藥，以根、莖入藥的稱為功勞木，以葉入藥的稱為功勞葉3。其中含有多種活性成分，主要是生物堿，迄今至少從該屬植物里分離了20多種生物堿，分別是小檗堿、巴馬亭、藥根堿、異漢防己堿甲素、氧化小檗堿、非洲防己胺、黃連素、小檗胺、異漢防己甲素、四氫藥根堿、黃皮樹堿、木蘭花堿、木蘭胺、黃小檗胺、異波爾定等。另外也含有一些非生物堿成分，如咖啡酸十六烷酯、丁香苷、2-羥基-3-甲基-4H-吡喃-4-酮、4-羥基-3,5二甲氧基苯甲酸、2,6-二甲氧基苯醌、3-羥基-4-甲氧基-苯甲酸、胡蘿卜苷和蔗糖等4。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究中，十大功勞具有抗菌5,6、

8、抗病毒7,8、抗腫瘤作用9,10,11并且具有抗炎抗增值活性12,13以及擴(kuò)張血管14等作用。在中醫(yī)的病因病理學(xué)說中，疫癘和六淫(風(fēng)、寒、暑、濕、燥、火)同屬于外感致病因素，多從體表、口、鼻、肺經(jīng)等侵襲機(jī)體，初期表現(xiàn)為肺衛(wèi)證侯。遵循中醫(yī)辨證論治的觀點(diǎn)，對(duì)于疫癘造成的疫病，多選用清熱瀉火、清熱燥濕、清熱解毒、清熱涼血等治療原則，對(duì)于熱毒造成的氣虧血虛、陰虛，還要選用補(bǔ)氣血、滋陰生津的藥材輔助治療，這就給中藥治療病毒性疾病提供了中醫(yī)基礎(chǔ)理論15。中草藥源自天然，經(jīng)過幾千年的篩選，藥效確實(shí)、毒副作用小，殘留量小甚至無殘留，具有保健、治療、康復(fù)等綜合作用，并以整體調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)一切抗病因素、抵御疾病、增強(qiáng)

9、免疫力而越來越受到人們的關(guān)注。作為傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)精華的中藥，在中國有著豐富的生產(chǎn)和加工量，長期的醫(yī)療實(shí)踐也使得對(duì)多種中藥的性能功效有著清楚的了解，因此，將中藥應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)，用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的觀點(diǎn)再重新研究中藥的調(diào)節(jié)機(jī)體免疫和抵抗外界病原微生物的侵襲作用，有著獨(dú)特的優(yōu)勢16。徐振娜等17為了觀察10種中藥抗豬流感病毒的效果，通過先加中藥再加病毒、先加病毒再加中藥以及中藥和病毒混合后一起加3入種加藥方式，采用雞胚培養(yǎng)法和紅細(xì)胞凝集(HA)試驗(yàn)研究了桂枝等10種中藥在體外抗豬流感病毒的效果。然后，將有顯著效果的中藥篩選出來，測定其治療指數(shù)(TI)和半數(shù)有效量(ED50)。試驗(yàn)結(jié)果表明，在3種加藥方式中，桂枝

10、和麻黃抗豬流感病毒的效果最為顯著。邱美珍等18將豬流感病毒分別和地錦草，黃連、蒲公英提取液混合接種到911日齡雞胚，繼續(xù)孵化，記錄雞胚死亡時(shí)間和測定死亡雞胚尿囊液血凝價(jià)，結(jié)果表明地錦草對(duì)豬流感病毒沒有作用，黃連和蒲公英對(duì)豬流感病毒有一定的抑制作用，減緩了雞胚的死亡，降低了血凝效價(jià)，但是對(duì)病毒不能完全殺滅。曾詳英等7以Mahomia bealei為原料，以雞胚試驗(yàn)技術(shù)為輔助手段進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)Mahomia bealei中的生物堿成分具有良好的抗流感病毒作用。Okunade AL等8的研究表明小檗堿能夠抑制與AIDS致病相關(guān)的白色念珠菌，這種作用是通過和酶以及模板的相互作用，抑制人體免疫缺損病毒反

11、轉(zhuǎn)錄酶(HIV一1RT)而實(shí)現(xiàn)的。另外，小檗堿的抗病毒的作用機(jī)理可能是小檗堿能插入DNA中，從而抑制DNA的合成和反轉(zhuǎn)錄。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用煎煮法獲取十大功勞水煎液，并通過不同的加藥方式進(jìn)行十大功勞對(duì)H3N2型豬流感病毒(SIV)體外作用的研究，旨在了解十大功勞在MDCK細(xì)胞上對(duì)H3N2型豬流感病毒的體外作用，從而為研制新型抗H3N2型豬流感病毒的藥物制劑提供理論依據(jù)。1 材料(cilio)與方法1.1 試驗(yàn)時(shí)間(shjin)、地點(diǎn)本試驗(yàn)(shyn)于2013年3月至2013年5月在河南省動(dòng)物性食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。1.2 十大功勞水煎液的提取十大功勞產(chǎn)自河南，按照常規(guī)的煎煮法進(jìn)行提取。取100g藥

12、物用蒸餾水浸泡2h；浸泡后煎煮藥物1.5h后留液體；加入蒸餾水進(jìn)行稀釋，再煮1h,留液體。將前兩步中的液體混合后用濾紙過濾，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將其濃縮至100ml,高壓，4備存。1.3 毒株、細(xì)胞H3N2型豬流感病毒和MDCK細(xì)胞由河南省動(dòng)物性食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存、傳代，按常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng)。1.4 試劑DMEM培養(yǎng)基(GIBCO公司產(chǎn)品)、小牛血清(Hyclone公司產(chǎn)品)、細(xì)胞生長液(含10小牛血清)、細(xì)胞維持液(含2小牛血清)、胰蛋白酶(0.25)、PBS緩沖液、7.4NaHCO3、雙抗(青霉素100gmL、鏈霉素100 gmL)、MTT（用pH7.4 PBS配制成5mg/ml的溶液）、D

13、MSO溶液。1.5 儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱（SANYO/MCO-15A型）、倒置顯微鏡（江南/XD-202型）、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(CoringCostar產(chǎn)品)、雙人雙面凈化工作臺(tái)（蘇州凈化/SW-CJ-2F型）、酶標(biāo)儀（Thermo/Multiskan Fc型）。1.6 病毒TCID50的測定按常規(guī)方法將細(xì)胞傳代，將細(xì)胞數(shù)調(diào)整至1106個(gè)/ml,加至96孔板上，0.1ml/孔。待細(xì)胞培養(yǎng)成單層后，棄液。加入不含血清營養(yǎng)液2倍比稀釋的病毒液（2-4 2-13），0.1ml/孔，每個(gè)稀釋度重復(fù)4孔，作用1.5h后吸出，加維持液100L/孔。設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照和空白對(duì)照。于375% CO2培

14、養(yǎng)箱觀察培養(yǎng)72h；待培養(yǎng)68h后，棄去舊液，加入MTT 20L/孔，37繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄去MTT殘液，加入DMSO 150L/孔，震蕩10min后，于492nm測定OD值。按ReedMuench公式計(jì)算TCID50。病毒稀釋液對(duì)細(xì)胞生長破壞率=（細(xì)胞對(duì)照組OD-試驗(yàn)組OD）/（細(xì)胞對(duì)照組OD-空白對(duì)照組OD）距離比例=（高于50%細(xì)胞生長抑制率-50%）/（高于50%細(xì)胞生長抑制率-低于50%細(xì)胞生長抑制率） Log2TCID50=距離比例稀釋度對(duì)數(shù)之間的差+高于50%細(xì)胞生長抑制率對(duì)數(shù)1.7 細(xì)胞安全濃度的測定細(xì)胞按常規(guī)方法傳代后，將細(xì)胞數(shù)調(diào)整至1106個(gè)/ml,接種到96孔板上，100L

15、/孔。待細(xì)胞鋪滿單層后，棄掉培養(yǎng)液。用維持液將藥物倍比稀釋（2-62-14），每孔加入藥物和細(xì)胞維持液各100L，每個(gè)濃度重復(fù)4孔。對(duì)照孔不加藥物，只加細(xì)胞維持液200L/孔。于375% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)觀察。待培養(yǎng)68h后，棄去舊液，加入MTT 20L/孔，37繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄液。加入DMSO 150L/孔，震蕩10min后，于492nm測定OD值。細(xì)胞抑制率=（細(xì)胞對(duì)照組OD-試驗(yàn)組OD）/細(xì)胞對(duì)照組OD將對(duì)細(xì)胞生長沒有明顯抑制作用的最大藥物濃度作為起始藥物濃度。1.8 不同(b tn)加藥方式下十大功勞對(duì)H3N2型SIV體外作用(zuyng)的測定1.8.1 十大功勞(gng lo)對(duì)S

16、IV抑制作用（先加藥物后加病毒） 將對(duì)細(xì)胞生長沒有抑制作用的最大藥物濃度作為起始藥物濃度倍比稀釋成6個(gè)稀釋度，將每個(gè)稀釋度的藥液加入到長成單層的MDCK細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板上，100L/孔。每個(gè)稀釋度做4個(gè)重復(fù)，于375% CO2培養(yǎng)感作4小時(shí)，棄去藥液，加入4個(gè)TCID50的病毒液100L/孔，同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞和病毒對(duì)照。于37 5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察CPE，當(dāng)病毒對(duì)照CPE達(dá)到80以上時(shí)加入MTT 20L/孔，37繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄液。加入DMSO 150L/孔，震蕩10min后，于492nm測定OD值。1.8.2 十大功勞對(duì)SIV阻斷作用(先加病毒后加藥物) 先將4個(gè)TCID50病毒液

17、接種至長成單層MDCK細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，100L孔，于375%CO2培養(yǎng)箱中吸附2小時(shí)，棄去病毒液。加入稀釋好的藥液，每個(gè)稀釋度做4個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞、病毒對(duì)照。于37 5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察CPE，當(dāng)病毒對(duì)照CPE達(dá)到80以上時(shí)加入MTT 20L/孔，37繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄液。加入DMSO 150L/孔，震蕩10min后，于492nm測定OD值。1.8.3 十大功勞對(duì)SIV直接殺滅作用(病毒和藥物同時(shí)加入) 取4個(gè)TCID50的病毒液與各稀釋度的藥液以等體積混合，于37感作2小時(shí)，以100L/孔加入到長成單層MDCK細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，每個(gè)稀釋度做4個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)置正

18、常細(xì)胞、病毒對(duì)照。于375%CO2繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察CPE，當(dāng)病毒對(duì)照CPE達(dá)到80以上時(shí)加入MTT 20L/孔，37繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄液。加入DMSO 150L/孔，震蕩10min后，于492nm測定OD值。1.9 數(shù)據(jù)分析整理數(shù)據(jù)后，用SPSS19.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行單因素方差分析和多重比較，得出各組數(shù)據(jù)的差異以及相關(guān)性。2 結(jié)果與分析2.1 H3N2型SIV的TCID50測定結(jié)果表1 H3N2型SIV對(duì)MDCK細(xì)胞生長(A492)的影響Table 1 Effects of H3N2 subtype SIV on MDCK cells growth病毒稀釋倍數(shù)Added concentrat

19、ionOD值OD Values細(xì)胞破壞率(%)Rate of cell destruction40.21760.007364.9050.28620.005349.2960.30380.004945.2970.34160.007136.6980.42480.016117.7590.4550.008910.88101112130.46260.01590.48440.00500.46320.00760.46040.01429.154.199.019.65細(xì)胞對(duì)照Cell control空白對(duì)照Blank control0.50280.01560.06340.0011注：“”表示細(xì)胞生長良好(ling

20、ho)，破壞率為負(fù)。： OD值為MeanSD。按ReedMuench公式(gngsh)計(jì)算H3N2型SIV的TCID50為2-4.95/0.1mL.2.2 十大功勞對(duì)MDCK細(xì)胞的安全(nqun)濃度的測定 由表2可知，當(dāng)藥物濃度是0.9770.061mg/mL時(shí)，藥物對(duì)細(xì)胞沒有抑制作用。本試驗(yàn)采用對(duì)細(xì)胞生長沒有抑制作用的最大藥物濃度作為起始藥物濃度。 十大功勞在質(zhì)量濃度為0.061mg/mL時(shí)，其A492值顯著大于細(xì)胞對(duì)照組，表明這個(gè)濃度的十大功勞能顯著促進(jìn)MDCK細(xì)胞生長。表2 十大功勞對(duì)MDCK細(xì)胞生長(A492)的影響Table 2 Effects of Mahonia Fortune

21、 on MDCK cells growth藥物添加質(zhì)量濃度/(mg/mL)Added concentrationOD值OD Values細(xì)胞抑制率(%)Rate of cell inhibition15.6250.29030.0093a37.527.8230.32430.0274a30.203.9060.42830.0379b7.821.9530.45170.0365bc2.800.9770.47370.0309cd0.4880.47500.0201cd0.2440.1220.0610.47070.0132bc0.48830.0208cd0.51770.0040d細(xì)胞對(duì)照Cell contro

22、l0.46470.0124bc注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母者表示在0.05水平差異顯著。：“”表示細(xì)胞生長良好，抑制率為負(fù)。 ：OD值為MeanSD。2.3 不同加藥方式下十大功勞對(duì)H3N2型SIV體外作用的測定2.3.1 十大功勞對(duì)SIV抑制作用（先加藥物后加病毒）的測定 從表3可知除了在藥物濃度為0.061mg/mL時(shí)，其A492值高于病毒(bngd)對(duì)照組但無顯著差異；其余各組A492值均顯著低于病毒(bngd)對(duì)照組。表明采用(ciyng)先加入十大功勞后接種病毒這種加藥方式時(shí)十大功勞成分對(duì)SIV感染MDCK細(xì)胞沒有顯著的抑制作用。表 3 先加十大功勞再加病毒時(shí)各處理組的A492值Tabl

23、e 3 A492 values of different treatments when adding Mahonia Fortunei firstly then followed by virus藥物添加質(zhì)量濃度/(mg/mL)Added concentrationOD值OD Values0.9770.30230.1580b0.4880.28130.1806b0.2440.21780.1063a0.1220.33930.1162c0.0610.39100.3126d0.0310.21200.0346a病毒對(duì)照Virus control細(xì)胞對(duì)照Cell control0.38600.0887d

24、0.50430.0512e注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母者表示在0.05水平差異顯著。：OD值為MeanSD。2.3.2 十大功勞對(duì)SIV阻斷作用（先加病毒后加藥物）的測定 從表4可知十大功勞質(zhì)量濃度為0.9770.031mg/mL時(shí)，其A492值均顯著低于病毒對(duì)照組。表明采用先加入病毒后加入十大功勞成分這種加藥方式時(shí)對(duì)SIV感染MDCK細(xì)胞沒有顯著的阻斷作用。表 4 先加病毒再加十大功勞時(shí)各處理組的A492的值Table 4 A492 values of different treatments when adding virus firstly then followed by Mahonia

25、Fortunei藥物添加質(zhì)量濃度/(mg/mL)Added concentrationOD值OD Values0.9770.09130.0095a0.4880.11770.0032a0.2440.12870.0015a0.1220.14370.0301b0.0610.12000.0079a0.0310.11530.0246a病毒對(duì)照Virus control細(xì)胞對(duì)照Cell control0.15300.0135b0.91800.0453c注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母者表示在0.05水平差異顯著。：OD值為MeanSD。2.3.3 十大功勞對(duì)SIV直接殺滅作用（藥物和病毒同時(shí)加入）的測定 由表5可

26、知，病毒與藥物感作后同時(shí)加入，十大功勞質(zhì)量濃度為0.9770.031mg/mL時(shí)，其A492值均顯著低于病毒對(duì)照組。表明在此加藥方式下十大功勞成分對(duì)SIV感染MDCK細(xì)胞沒有顯著的直接殺滅作用。表5 病毒與十大功勞同時(shí)加入時(shí)A492的值Table 5 A492 values of different treatments when adding Mahonia Fortunei and virus at the same time藥物添加質(zhì)量濃度/(mg/mL)Added concentrationOD值OD Values0.9770.24430.0175a0.4880.26580.0091b

27、0.2440.27450.0076b0.1220.28050.0087b0.0610.27630.0090b0.0310.26850.0222b病毒對(duì)照Virus control細(xì)胞對(duì)照Cell control0.31480.0154c0.43480.0081d注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同(b tn)字母者表示在0.05水平差異顯著。：OD值為MeanSD。3 分析(fnx)與討論3.1 病毒(bngd)對(duì)細(xì)胞的破壞性 本實(shí)驗(yàn)表明，H3N2型SIV對(duì)于細(xì)胞具有較高的破壞性，細(xì)胞破壞率為9.65%64.9%。其TCID50為2-4.95/0.1mL。程玨益等19進(jìn)行的關(guān)于豬流感病毒的分離鑒定和毒力檢測實(shí)

28、驗(yàn)得出H3N2型豬流感病毒在MDCK細(xì)胞上的TCID50為10-6.5/0.2mL。這種差異的產(chǎn)生可能是所使用病毒毒株不同以及病毒的加入量不同造成的。3.2 十大功勞成分有促進(jìn)MDCK細(xì)胞生長的作用本實(shí)驗(yàn)表明當(dāng)藥物濃度為0.9770.061mg/mL時(shí)，藥物對(duì)細(xì)胞沒有抑制作用。試驗(yàn)觀察了十大功勞成分在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對(duì)MDCK細(xì)胞生長的影響，發(fā)現(xiàn)其大多數(shù)孔的A492值大于細(xì)胞對(duì)照組，當(dāng)濃度為0.061mg/mL時(shí)其A492值顯著大于細(xì)胞對(duì)照組，表明它有顯著的促進(jìn)細(xì)胞增殖作用。而且在安全濃度范圍內(nèi)，十大功勞在低濃度時(shí)的A492值顯著高于高濃度時(shí)，表明十大功勞成分促進(jìn)MDCK細(xì)胞生長的作用有一定

29、的量效關(guān)系。這說明中藥成分必須有合適的劑量才能發(fā)揮最佳效應(yīng)。徐玉鳳等20也持相同的觀點(diǎn)，但這種作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。3.3 不同加藥方式下十大功勞的抗病毒作用 近年來的研究結(jié)果表明，中草藥抗病毒的作用機(jī)理可分為直接途徑和間接途徑兩種。直接途徑表現(xiàn)為直接滅活或抑制病毒繁殖；間接途徑表現(xiàn)為通過提高機(jī)體免疫功能或誘生干擾素而達(dá)到抗病毒作用。 A492值反映了活細(xì)胞的數(shù)量及其活性，可間接反映出病毒在細(xì)胞上的增殖情況，病毒增殖越多則A492值越低。本試驗(yàn)采用3種加藥方式：先加中藥再加病毒目的是觀察中藥能否抑制病毒的吸附和侵入；先加病毒再加中藥目的是觀察中藥能否對(duì)已進(jìn)入細(xì)胞的病毒起作用，阻斷其生物合成

30、及成熟釋放；中藥和病毒混合后同時(shí)加入目的是觀察中藥對(duì)病毒的直接殺滅作用。結(jié)果表明，三種加藥方式下，十大功勞對(duì)H3N2型SIV無顯著的抑制、阻斷和直接殺滅作用。在三種加藥方式中，我們發(fā)現(xiàn)只有采用先加入十大功勞后接種病毒這種加藥方式的數(shù)據(jù)中，在藥物濃度為0.061mg/mL時(shí)，出現(xiàn)了A492值高于病毒對(duì)照組的情況，但差異不顯著。因此筆者認(rèn)為，當(dāng)采用此種加藥方式時(shí)，十大功勞可能對(duì)H3N2型SIV病毒感染MDCK細(xì)胞有抑制作用。本試驗(yàn)是篩選不同中藥以及不同藥物成分實(shí)驗(yàn)中的其中一步，雖然十大功勞水煎液對(duì)H3N2型SIV無顯著作用，但其他中藥或成分可能對(duì)該病毒有作用；實(shí)驗(yàn)室還從未做過關(guān)于十大功勞的試驗(yàn)，此

31、次試驗(yàn)可以說明十大功勞水煎液對(duì)H3N2型SIV無顯著作用；本次試驗(yàn)是體外試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)室中其他同學(xué)做的關(guān)于十大功勞的小鼠體內(nèi)試驗(yàn)表明該藥對(duì)體內(nèi)細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)能力較好，說明該藥雖然直接殺滅病毒的能力較弱，但具有調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫的能力，可以與體外抗病毒作用良好的藥物聯(lián)合應(yīng)用。曾祥英等7實(shí)驗(yàn)表明十大功勞生物堿成分在雞胚上有良好的抗H1N1流感病毒的作用。而我們初步探索十大功勞水煎液在細(xì)胞上的抗H3N2型豬流感毒作用，并未得出明顯的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，與前文所述有所差異。因此十大功勞生物堿成分在細(xì)胞上的抗病毒作用還有待進(jìn)一步研究。另外，試驗(yàn)過程中操作不當(dāng)或者毒的效力以及細(xì)胞的成長狀態(tài)有差異等原因均可影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及重現(xiàn)性

32、。因此，在今后的試驗(yàn)過程中，我們應(yīng)該選擇合適的試驗(yàn)材料并且不斷探索改進(jìn)操作方法，鍛煉扎實(shí)的試驗(yàn)技能，提高實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性，以減少其他因素對(duì)試驗(yàn)的影響。 參考文獻(xiàn)：1 李海燕,李雁冰,于康震, 等. 豬流感病毒的分離(fnl)鑒定J.中國(zhn u)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2002,24(1):1517.2 董雷, 楊曉紅, 劉銀燕(yn yn), 等.十大功勞屬植物的藥理作用研究進(jìn)展J.中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用,2007,1(6):7275.3 呂光華.高效液相色譜法測定十大功勞屬植物中的7種生物堿成分J. 藥物分析雜志,1999,19（4）:271.4 李燕.中藥十大功勞的化學(xué)成分和活性研究進(jìn)展J. 廣東化工,

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