基因工程6重組體克隆的篩選與鑒定

1、第六章 重組體克隆的篩選與鑒定1 由DNA分子的體外重組，通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等適當(dāng)途徑引入宿主，會(huì)得到大量的重組體細(xì)胞或噬菌體。在這些眾多的重組體中，會(huì)有多種類型的DNA分子，包括：不帶任何外源DNA插入片段，僅由線性載體分子自身連接形成的環(huán)狀DNA分子；由一個(gè)載體分子和一個(gè)或數(shù)個(gè)外源DNA片段構(gòu)成的重組體DNA分子；單純由數(shù)個(gè)外源DNA片段彼此連接形成的多聚DNA分子。 2 對(duì)于這些由混合的DNA制劑轉(zhuǎn)化而來的大量的克隆群體，需要采用特殊的方法，才能選擇和鑒定出可能含有目的基因的重組體克隆。目前已發(fā)展和應(yīng)用了一系列重組體克隆檢測(cè)法，包括遺傳檢測(cè)法、物理檢測(cè)法、使用特異性探針的核酸雜交法，以

2、及免疫化學(xué)法等。 3 6.1 利用表型特征選擇（遺傳檢測(cè)法） 表型是指機(jī)體遺傳組成同環(huán)境相互作用所產(chǎn)生的外觀或其他特征。這里所說的供篩選用的表型特征來自兩個(gè)方面：一個(gè)是克隆載體提供的，另一方面是插入的外源DNA序列提供的，前者應(yīng)用較多。 4 6.1.1 利用載體提供的表型特征選擇重組體分子 1. 抗藥性標(biāo)記插入失活選擇法 檢測(cè)外源DNA插入作用的一種通用的方法是插入失活效應(yīng)。例如在pBR322質(zhì)粒的DNA序列上，編碼有四環(huán)素抗性基因(Tetr)和氨芐青霉素抗性基因(Ampr)，且在Tetr基因內(nèi)有Bam HI和Sal I兩種限制酶的單一切點(diǎn)。在這兩個(gè)識(shí)別位點(diǎn)中的任何插入作用，都會(huì)導(dǎo)致Tetr基

3、因出現(xiàn)功能性失活，因而根據(jù)AmprTets表型即可篩選出在Tetr基因內(nèi)帶有插入DNA片段的重組體細(xì)胞。 5 利用環(huán)絲氨酸富集法可以簡(jiǎn)化這種插入失活檢測(cè)法的程序，該法可以使那些只帶有原來質(zhì)粒載體的細(xì)菌致死，從而抑制不含有插入DNA片段的載體分子形成轉(zhuǎn)化子。例如： 當(dāng)外源DNA 插入在pBR322質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基因(Tetr)上，該基因便會(huì)立即失去它的功能作用，而另一種抗菌素抗性基因氨芐青霉素基因(Ampr)，則仍然是完整的。將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌培養(yǎng)物移至含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，經(jīng)過這樣的選擇作用而得以存活下來的所有細(xì)胞，都應(yīng)該帶上了pBR322質(zhì)粒分子。 6 在這些pBR322質(zhì)粒分子中，有一

4、部分是在其Tetr基因序列內(nèi)具有DNA插入片段的重組質(zhì)粒。把這種富集了的培養(yǎng)物作適當(dāng)?shù)南♂尯?，轉(zhuǎn)接到含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，于是在其pBR322質(zhì)粒分子的Tetr基因序列中帶有DNA插入片段的所有細(xì)胞，都將停止生長(zhǎng)（注意：四環(huán)素不會(huì)使細(xì)胞死亡，只是抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)）。最后加入環(huán)絲氨酸，就會(huì)促使所有正在生長(zhǎng)著的細(xì)胞發(fā)生溶胞反應(yīng)，那些沒有發(fā)生溶胞反應(yīng)而存活下來的細(xì)胞，大約有90100%都帶有pBR322重組質(zhì)粒，且在其Tetr基因上都含有一個(gè)插入的外源DNA片段，這些細(xì)胞可通過離心作用收集起來。 7 此外，在pBR322質(zhì)粒的Ampr基因序列中，也有一個(gè)Pst I限制酶的唯一識(shí)別位點(diǎn)。Ampr基因

5、正常情況下表達(dá)產(chǎn)生-內(nèi)酰胺酶，在其作用下青霉素會(huì)變成青霉酮酸，當(dāng)加入碘-青霉素指示液（30% I2，1.5% KI，5%青霉素G，0.05M的pH 6.4的磷酸緩沖液），AmprTetr菌落為無色透明。但當(dāng)pBR322質(zhì)粒的Ampr基因插入失活后，AmpsTetr菌落在碘-青霉素指示液中不褪色，仍呈碘的藍(lán)灰色。根據(jù)菌落周圍指示液顏色的改變與否，很容易鑒別出重組體菌落。8 這種方法的優(yōu)點(diǎn)是無需把每一個(gè)轉(zhuǎn)化子接種在Amp和Tet平板上，直接在轉(zhuǎn)化平板上即可鑒定。其缺點(diǎn)是由于把指示液直接加入選擇平板內(nèi)，極易超成菌落之間的相互污染，給其后的鑒定帶來困難。目前使用紙片法使這一方法得到了改善：預(yù)先將一定大

6、小的紙片浸泡在指示液中，干燥后密閉保存，使用時(shí)只要將紙片覆蓋在轉(zhuǎn)化平板上，數(shù)分鐘內(nèi)就可以觀察到結(jié)果。 9 2. -半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法 將pUC質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，培養(yǎng)在補(bǔ)加有X-gal和乳糖誘導(dǎo)物IPTG的培養(yǎng)基中時(shí)，由于基因內(nèi)互補(bǔ)作用形成的有功能的半乳糖苷酶，會(huì)把培養(yǎng)基中無色的X-gal切割成半乳糖和深藍(lán)色的底物，使菌落呈現(xiàn)出藍(lán)色反應(yīng)。 當(dāng)pUC質(zhì)粒載體的lacZ 序列插入了外源DNA片段時(shí)，會(huì)阻斷讀碼結(jié)構(gòu)，使其編碼的肽失去活性，結(jié)果產(chǎn)生出白色的菌落。因此，根據(jù)這種-半乳糖苷酶的顯色反應(yīng)，便可以檢測(cè)出含有外源DNA插入序列的重組體克隆。 10 6.1.2 利用插入序列提供的表型特征選擇重組

7、體分子 這種選擇法要求所克隆的DNA片段是一個(gè)完整的序列，而且能夠在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)功能的表達(dá)。其依據(jù)的基本原理是：轉(zhuǎn)化進(jìn)來的外源DNA編碼的基因，能夠?qū)Υ竽c桿菌寄主菌株所具有的突變發(fā)生體內(nèi)抑制或互補(bǔ)效應(yīng)，從而使被轉(zhuǎn)化的寄主細(xì)胞表現(xiàn)出外源基因編碼的表型特征。例如小鼠的二氫葉酸還原酶（DHFR）的分離： 11 先將含有DHFR-mRNA的小鼠總mRNA制劑反轉(zhuǎn)錄成cDNA拷貝，構(gòu)建cDNA基因文庫。根據(jù)小鼠DNFR對(duì)于藥物三甲氧芐二氨嘧啶呈現(xiàn)抗性這種性狀特征，將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌生長(zhǎng)在含有三甲氧芐二氨嘧啶的培養(yǎng)基中（其含量水平為可以抑制大腸桿菌的DHFR的活性），選擇轉(zhuǎn)化子。這樣分離出來的抗性克隆，顯然都

8、是由于具有小鼠DHFR基因的克隆片段，賦予寄主細(xì)胞新的抗性表型所致。 12 6.1.3 利用噬菌斑形態(tài)選擇重組體分子 把DNA包裝成有活性的噬菌體顆粒，主要取決于兩個(gè)因素：一是要具有能被噬菌體包裝蛋白和頭部前體所識(shí)別的區(qū)域，即cos區(qū)；二是DNA的長(zhǎng)度，只有重組體DNA是野生型 DNA的75105%的長(zhǎng)度時(shí)，才能在培養(yǎng)平板上形成清晰的噬菌斑，而單一的載體DNA是不會(huì)包裝成活的噬菌體顆粒的。13 經(jīng)體外包裝，轉(zhuǎn)導(dǎo)后能否形成清晰噬菌斑，尤其是對(duì)替換型載體，本身就是一種可利用的選擇標(biāo)記。 另外cI基因插入失活后，會(huì)誘發(fā)溶源性細(xì)菌的原噬菌體進(jìn)入溶菌周期，根據(jù)產(chǎn)生噬菌斑的清晰與混濁，也可以進(jìn)行選擇。14

9、 6.2 利用核酸雜交篩選 從基因文庫中篩選帶有目的基因插入序列的克隆，最廣泛使用的一種方法是核酸分子雜交技術(shù)。它所依據(jù)的原理是放射性同位素（32P或125I）標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行DNA-DNA或DNA-RNA雜交，利用同源DNA堿基配對(duì)的原則檢測(cè)特定的重組克隆。15 核酸雜交篩選法的最大優(yōu)點(diǎn)是它可以普遍廣泛地應(yīng)用，尤其適合于大量群體的篩選，只要有現(xiàn)成可用的特異性探針，就可以有效地檢測(cè)任何一種插入的外源DNA序列，而不以這種序列能否在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)為前提。16 6.2.1 原位雜交篩選 生長(zhǎng)在培養(yǎng)基平板上的菌落或噬菌斑，按照其原來的位置不變地影印在硝酸纖維素濾膜上，并在原位發(fā)生

10、溶菌、DNA變性和雜交作用，而將母板很好地保存起來。因?yàn)樽冃訢NA同硝酸纖維素濾膜有很強(qiáng)的親和力，便在膜上形成DNA的印跡，在80下烘烤濾膜，使DNA牢固地固定下來。17 用放射性同位素標(biāo)記的RNA或DNA為探針同濾膜上的菌落所釋放的變性DNA雜交，并用放射自顯影技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，凡是含有與探針互補(bǔ)序列的菌落DNA，就會(huì)在X光膠片上出現(xiàn)曝光點(diǎn)。根據(jù)曝光點(diǎn)的位置，便可以從保留的母板上相應(yīng)位置挑出所需要的陽性菌落或噬菌斑，這就是所需要的含有目的基因插入片段的重組體克隆。18 6.2.2 核酸雜交檢測(cè)的探針 進(jìn)行核酸分子雜交的前提是要有特定的DNA或RNA作探針。具有一定已知序列的核酸片段，再帶上一定的

11、探測(cè)標(biāo)記，就構(gòu)成了核酸探針。它可以通過分子雜交與待測(cè)基因的DNA序列結(jié)合，產(chǎn)生雜交信號(hào)，從而把待測(cè)基因的質(zhì)和量顯示出來。19 1. 放射性探針 廣泛使用的探針，多是以32PdNTP為標(biāo)記前體，通過缺口平移的方法，把天然DNA或RNA片段標(biāo)記上放射性同位素。 此外還可以化學(xué)合成DNA探針，只要已知目的基因產(chǎn)物的部分氨基酸序列，就可以從這個(gè)信息中，反推出基因編碼區(qū)可能的核苷酸排列順序。選擇一小段含有獨(dú)特密碼子（Met和Try）或簡(jiǎn)并性最小的密碼子（Cys、His、Phe和Tyr等）的氨基酸序列，用化學(xué)法合成出相當(dāng)于這些密碼子序列的寡核苷酸片段（1020個(gè)堿基）混和物；然后利用多核苷酸激酶，將32P

12、dNTP轉(zhuǎn)移到合成的DNA的5-OH末端（稱為末端標(biāo)記 ），即成為標(biāo)記好的探針。20一個(gè)密碼子： Met（甲硫氨酸） AUG Try （色氨酸） UGG二個(gè)密碼子： Cys（半胱氨酸） His （組氨酸） Phe （苯丙氨酸） Try （酪氨酸） Lys （賴氨酸） 21 2. 非放射性探針 由于32P放射性同位素半衰期只有14.3天，不易保存，且對(duì)人體有一定的損害，因而近年來又研制了非放射性物質(zhì)標(biāo)記核酸的方法，如糖基化探針、生物素探針、毛地黃苷標(biāo)記等。 用生物素標(biāo)記DNA形成探針是目前用得較多的一種，它可以采用酶促或光促生物素來標(biāo)記核酸。酶促法是利用缺口轉(zhuǎn)移的方法，但標(biāo)記前體不是32PdTT

13、P，而是用嘧啶環(huán)C5位連接了生物素的dTTP （或dUTP），它可以有效地?fù)饺隓NA中形成生物素探針。22 光促法使用的試劑為光敏生物素乙酸鹽，它是由光敏基團(tuán)、連接臂和生物素組成的。光敏基團(tuán)可在光照下活化，與核酸的堿基結(jié)合，連接臂可以降低生物素基團(tuán)對(duì)核酸雜交的空間位阻；生物素用做標(biāo)記物。將待標(biāo)記的核酸（DNA或RNA）與光敏生物素乙酸鹽混合，在近紫外的光源（如高壓汞燈、碘鎢燈）下照射1520分鐘，就可將生物素標(biāo)記在單鏈或雙鏈的DNA或RNA上，形成穩(wěn)定的共價(jià)結(jié)合。23 標(biāo)記好的生物素探針，可用于核酸的雜交反應(yīng)，然后用親和素-酶系統(tǒng)來顯示。親和素可以特異地與生物素結(jié)合，酶可與底物反應(yīng)進(jìn)行顯色或化

14、學(xué)發(fā)光，這就相當(dāng)于放射性同位素探針雜交后的放射自顯影。最常用的工具酶是辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AP）。 非放射性方法進(jìn)行核酸雜交，其靈敏度不如放射性方法高，但非放射性探針具有安全、穩(wěn)定、使用方便等優(yōu)點(diǎn)，是一種正在發(fā)展很有前途的方法。24 6.3 利用免疫學(xué)方法篩選 免疫學(xué)方法專一性很強(qiáng)、靈敏度很高，其基本原理是：以目的基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)物（多肽）作抗原，以該基因產(chǎn)物的免疫血清作抗體，通過抗原抗體反應(yīng)將目的基因克隆檢出。 免疫學(xué)方法可以分為兩種：即放射性抗體測(cè)定法和免疫沉淀測(cè)定法。這些方法最突出的優(yōu)點(diǎn)是，它們直接檢測(cè)重組克隆所表達(dá)的蛋白產(chǎn)物，能夠檢測(cè)無任何可供選擇的表型特征的

15、重組克隆。當(dāng)然這種方法必須具備有效的特異性抗體。256.3.1 放射性抗體測(cè)定法 這一方法所依據(jù)的原理為： (1) 一種免疫血清含有好幾種特異性抗體（IgG），它們識(shí)別抗原分子上的不同定子，并分別同各自識(shí)別的抗原定子相結(jié)合； (2) 抗體分子或抗體的F(ab)部分，能夠十分牢固地吸附在固體基質(zhì)（如聚乙烯等塑料制品）上，而不會(huì)被洗脫掉； (3) 通過體外碘化作用，IgG抗體便會(huì)迅速地被放射性同位素125I標(biāo)記上。26 放射性抗體測(cè)定的主要程序是：(1) 首先把轉(zhuǎn)化的菌落涂布在平板上，長(zhǎng)出菌落以后，再影印到另一塊平板上繼續(xù)培養(yǎng)，并保留原來的平板作為母板；(2) 待影印平板上的菌落長(zhǎng)好后，置于含有氯

16、仿飽和氣體的容器中使菌落裂解，陽性菌落便釋放出抗原；(3) 將吸附了未標(biāo)記IgG抗體的聚乙烯薄膜覆蓋在平板表面，如果抗原與抗體具有對(duì)應(yīng)關(guān)系，則在薄膜上形成抗原-抗體復(fù)合物；27(4) 取下聚乙烯薄膜，再用125I 標(biāo)記的IgG處理，125I-IgG便會(huì)與結(jié)合在聚乙烯薄膜上的抗原決定簇結(jié)合；(5) 漂洗聚乙烯膜除去過剩的125I-IgG，干燥后進(jìn)行放射性自顯影判斷結(jié)果，并從母板上獲得相應(yīng)的重組克隆。28 對(duì)于能夠分泌表達(dá)產(chǎn)物的重組體克隆，可以省去影印平板、裂解菌落等程序，操作更為簡(jiǎn)化。例如分泌胰島素重組體克隆的篩選：29 在放射免疫分析法基礎(chǔ)上，最近又發(fā)展了一類非放射性免疫分析技術(shù)，例如熒光免疫

17、分析、酶免疫分析以及化學(xué)發(fā)光免疫分析等。這些方法具有和放射免疫法相同的靈敏度和特異性，而且沒有象同位素那樣的半衰期短和安全防護(hù)問題，是一類很有發(fā)展前途的檢測(cè)技術(shù)。30 6.3.2 免疫沉淀測(cè)定法 相對(duì)于放射性免疫法，該方法靈敏度要低，而且易受干擾，但它的價(jià)值在于實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)便易行。其做法是：在生長(zhǎng)菌落的瓊脂培養(yǎng)基中，加入專門抗這種蛋白質(zhì)分子的特異性抗體。如果有些菌落的細(xì)菌會(huì)分泌出某種蛋白質(zhì)，那么在它的周圍就會(huì)出現(xiàn)一條叫做沉淀素的抗體-抗原沉淀物所形成的白色的圓圈。31 上述方法的缺點(diǎn)是只能檢測(cè)分泌出細(xì)胞的蛋白質(zhì)；經(jīng)兩項(xiàng)輕微的改良后，也可以用來檢測(cè)非分泌的蛋白質(zhì)。 第一種改良方法是：采用對(duì) cI857

18、噬菌體溶源性的大腸桿菌細(xì)胞作寄主，它含有在42下會(huì)發(fā)生熱失活的熱敏感阻遏物。把生長(zhǎng)著待檢測(cè)菌落的原培養(yǎng)基平板，影印到加有抗體的瓊脂平板上，等到影印平板中的菌落長(zhǎng)到肉眼可以辨認(rèn)的大小時(shí)，將培養(yǎng)溫度上升到42，經(jīng)過1 h之后，平板中就會(huì)有許多細(xì)胞被熱誘導(dǎo)發(fā)生溶菌作用。于是細(xì)胞的內(nèi)含物便被釋放出來，分布在周圍的培養(yǎng)基中，其中目的基因編碼的蛋白質(zhì)就會(huì)同加在培養(yǎng)基中的抗體發(fā)生反應(yīng)，并在菌落的周圍形成一圈沉淀素帶。32 第二種改良方法是：將補(bǔ)加有抗體和溶菌酶的瓊脂，小心地傾注到菌落的上面，并使之凝固。在溶菌酶的作用下，處于菌落表面的細(xì)胞發(fā)生溶菌反應(yīng)，逐步地釋放出細(xì)胞內(nèi)部的蛋白質(zhì)。如果有某些菌落的細(xì)胞能夠分

19、泌出目的基因編碼的蛋白質(zhì)，它們就會(huì)同包含在瓊脂培養(yǎng)基中的抗體發(fā)生反應(yīng)，形成沉淀素圈。33 6.4 轉(zhuǎn)譯篩選法 轉(zhuǎn)譯篩選法可分為雜交阻斷轉(zhuǎn)譯法（HART）和雜交釋放轉(zhuǎn)譯法（HRT）兩種不同的篩選策略。它們的突出優(yōu)點(diǎn)是，能夠?qū)⒖寺〉腄NA同所編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物之間的關(guān)系對(duì)應(yīng)起來。這兩種方法都要通過無細(xì)胞轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)檢測(cè)經(jīng)處理后的mRNA的生物學(xué)功能，常用的有麥胚提取物系統(tǒng)、網(wǎng)織紅細(xì)胞提取物系統(tǒng)。34 6.4.1 雜交阻斷轉(zhuǎn)譯法（HART） 這種方法又稱雜交抑制的轉(zhuǎn)譯篩選法，其依據(jù)的原理是：在體外無細(xì)胞的轉(zhuǎn)譯體系中，mRNA一旦同DNA分子雜交之后，就不能夠再指導(dǎo)蛋白質(zhì)多肽的合成，即mRNA的轉(zhuǎn)譯被抑制了

20、。 在高濃度甲酰胺溶液的條件下（這種溶液既有利于DNA-RNA的雜交，同時(shí)又能抑制質(zhì)粒DNA的再聯(lián)合），將從轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌落群體或噬菌體群體中制備來的帶有目的基因的重組質(zhì)粒DNA，變性后同未分部的總mRNA進(jìn)行雜交。35 從雜交混合物中回收的核酸，加入到無細(xì)胞轉(zhuǎn)譯體系進(jìn)行體外轉(zhuǎn)譯，由于其中加有35S標(biāo)記的甲硫氨酸，因此轉(zhuǎn)譯合成的多肽蛋白質(zhì)，可以通過聚丙烯酰胺凝膠電泳和放射自顯影進(jìn)行分析。并把其結(jié)果同未經(jīng)雜交的mRNA的轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物作比較，從中便可以找到一種其轉(zhuǎn)錄合成被抑制了的mRNA，這就是同目的基因變性DNA互補(bǔ)而彼此雜交的那種mRNA。根據(jù)這種目的基因編碼的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)譯抑制作用，就可篩選出含有

21、目的基因的重組體質(zhì)粒的大腸桿菌菌落群體或噬菌體群體。36 阻斷轉(zhuǎn)譯雜交法是一種很有效的檢測(cè)手段，它能從總mRNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA群體中檢出所需要的目的cDNA，因而特別適用于那些高豐度的mRNA。37 6.4.2 雜交釋放轉(zhuǎn)譯法（HRT） 這種方法又稱雜交選擇的轉(zhuǎn)譯篩選法，是一種更為敏感的方法，而且可以檢出低豐度的mRNA（占總mRNA的1），它與阻斷轉(zhuǎn)譯雜交的原理相似。 38 其主要程序是：首先將克隆DNA結(jié)合到硝酸纖維素濾膜上，再與未經(jīng)分離純化的mRNA或細(xì)胞的總RNA雜交；然后漂洗濾膜，在低鹽緩沖液或甲酰胺的緩沖液中加熱，把雜交的mRNA洗脫下來（即把mRNA釋放出來）；再用回收的m

22、RNA進(jìn)行體外轉(zhuǎn)譯試驗(yàn)，用聚丙烯酰胺凝膠電泳和放射自顯影分析鑒定轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物，同時(shí)亦可測(cè)定蛋白產(chǎn)物的生物活性，以達(dá)到篩選所需基因的目的。39 6.5 物理篩選法 6.5.1 凝膠電泳篩選法 帶有插入片段的重組體在分子量上會(huì)有所增加，因而一種直截了當(dāng)?shù)姆椒ㄊ欠蛛x質(zhì)粒的DNA并測(cè)定其分子長(zhǎng)度。對(duì)此，電子顯微鏡是有效的方法，但過于繁瑣，通常用操作程序比較簡(jiǎn)單的凝膠電泳法進(jìn)行檢測(cè)。由于質(zhì)粒DNA的電泳遷移率是與其分子量大小成比例的，根據(jù)在凝膠中遷移速度的差別，即可鑒定出含有外源DNA插入序列的重組體菌落。40 有些假陽性轉(zhuǎn)化菌落（如自我連接載體、缺失連接載體、未消化載體、兩個(gè)互相連接的載體，以及兩個(gè)外源片

23、段插入的載體等轉(zhuǎn)化的菌落），用平板法篩選是無法鑒別的，但可以被電泳法淘汰。因?yàn)橛蛇@些轉(zhuǎn)化菌落分離的質(zhì)粒DNA分子的大小各不相同：和真正的陽性重組體DNA比較，前三種重組DNA分子較小，在電泳時(shí)的泳動(dòng)率較快，其DNA帶的位置跑在陽性重組DNA帶的前面；后兩種重組DNA分子較大，泳動(dòng)率較慢，其DNA帶的位置跑在陽性重組DNA帶的后面。所以電泳法能篩選出有插入片段的陽性重組體。41 如果插入片段是大小相近的非目的基因片段，對(duì)于這樣的假陽性重組體，電泳法仍不能鑒別，只有進(jìn)一步用Southern blot雜交，即以目的基因片段制備的放射性探針和電泳篩選出的重組體DNA雜交，才能最終確定真陽性重組體。42 Southern blot： 由E. souther