FUNDC1 and mitophagy全文英翻漢

1、在哺乳動物細胞中通過線粒體外膜蛋白FUNDC1介導缺氧誘導的線粒體自噬【摘要】越來越多的證據(jù)表明，功能失調(diào)的線粒體可以通過線粒體自噬被選擇性地移除。線粒體自噬功能的失調(diào)與神經(jīng)退行性疾病和代謝性疾病的發(fā)展方面是密切相關(guān)的。個別的線粒體是怎么被識別后清除的，并且這個過程是如何被調(diào)控的我們尚不清楚。我們在文章中所說的FUNDC1,是一種不可缺少的線粒體外膜蛋白，是一種由缺氧誘導的線粒體自噬受體。FUNDC1通過與典型的LC3結(jié)合基序Y（18）xxL（21）與LC3相互作用，LC3相互作用區(qū)的突變削弱了FUNDC1與LC3的相互作用以及隨后的線粒體誘導。內(nèi)源性FUNDC1的敲低顯著阻止缺氧誘導的線粒體

2、，這可以被野生型FUNDC1的表達逆轉(zhuǎn)，但不是LC3相互作用缺陷型FUNDC1突變體的逆轉(zhuǎn)。機理/機制的研究進一步揭示了缺氧誘導FUNDC1脫磷酸化和增強其與LC3的選擇性線粒體相互作用。因此，我們的研究結(jié)果提供了在哺乳動物細胞中的線粒體質(zhì)量控制的深入了解?！灸康?、結(jié)果與方法】注：方法為實驗操作與圖結(jié)合【總目的】探究“自噬”選擇性去除功能障礙的線粒體的機制【各論】一.線粒體外膜蛋白FUNDC1誘導線粒體自噬目的：1.1確定線粒體外膜蛋白的潛在功能探究線粒體外膜蛋白是否和如何導致線粒體自噬。方法：11（a）將HeLa細胞勻漿并分級分離，然后用Percoll梯度離心。通過用FUNDC1和不同細胞器

3、標記物例如線粒體蛋白（TIM23），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白（鈣聯(lián)接蛋白）和高爾基蛋白（GM130）的western印跡分析梯度級分（b）將細胞固定,然后用FUNDC1抗體（綠色）免疫染色，并對線粒體蛋白細胞色素c（紅色）進行復染色。比例尺，10口m。（c）用編碼FUNDC1-Myc和Mito-dsRed的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染GFP-LC3（綠色）穩(wěn)定HeLa細胞24小時。然后將細胞固定，并用FUNDC1（紫色，抗Myc）免疫染色。比例尺，10“n。（d）用編碼的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HeLa細胞FUNDC1-Myc和GFP以4：1的比率或Myc和GFP對照載體。將FUNDC1-Myc陽性細胞和載體對照細胞（均為GFP陽性）分選并

4、用抗VDAC1抗體（10nm金顆粒）進行免疫金色電子顯微鏡檢查。藍色框（插圖）表示VDAC1-陽性線粒體。綠色和紅色框表示吞噬線粒體的自噬體。黑色箭頭顯示雙膜自噬體。比例尺，500nm。d）用編碼的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HeLa細胞FUNDC1-Myc和GFP以4：1的比率或Myc和GFP對照載體。將FUNDC1-Myc陽性細胞和載體對照細胞（均為GFP陽性）分選并用抗VDAC1抗體（10nm金顆粒）進行免疫金色電子顯微鏡檢查。藍色框（插圖）表示VDAC1-陽性線粒體。綠色和紅色框表示吞噬線粒體的自噬體。黑色箭頭顯示雙膜自噬體。比例尺，500nm（e）HeLa細胞用編碼FUNDC1-Myc，GFP-LC3

5、的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24h，水稻dsRed和青色熒光蛋白LAMP1。收集代表性活細胞Z-Stack圖像和三維重建示例。綠色和藍色箭頭表示線粒體碎片被LC3和LAMP1陽性自體溶酶體包圍。比例尺，10口m.（f）用編碼的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細胞，F(xiàn)UNDC1-Myc指示的時間和線粒體（TIM23，TOM20，VDAC1），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（鈣聯(lián)接蛋白）和高爾基標記（GM130）蛋白通過蛋白質(zhì)印跡法檢測。（g）HeLa細胞用編碼FUNDC1-Myc的載體或質(zhì)粒轉(zhuǎn)染12小時，放入或不放入巴佛洛霉素A1（BFA）溶液中，然后是TIM23,TOM20或通過western印跡檢測LC3。（h）Mito-Cherry穩(wěn)定的HeLa

6、細胞用編碼FUNDCl-Myc的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染24小時或48小時,（Fdcl）和GFP以4：1的比率或與Myc對照載體一起孵育48小時。通過共聚焦捕獲每個樣品的五個隨機挑取的區(qū)域z軸，并掃描GFP陽性細胞的總面積和體積，進行線粒體計算和定量（平均值土s.e.m。；n=90個細胞來自三次獨立實驗）；*P0.01。未裁剪的圖像印跡如附圖所示。S6。結(jié)果：11異位表達的FUNDC1誘導綠色熒光蛋白（GFP）-LC3斑點的顯著增加，與線粒體的片段化密切相關(guān)。12如圖1d所示，在電子顯微鏡下用表達FUNDC1-Myc的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞中，在雙膜自噬小泡中，通過抗VDAC1的免疫膠體（10nm）可以清楚地觀察到

7、被隔離的線粒體的積聚。自噬泡囊完全不存在空轉(zhuǎn)染的細胞向量。三維成像研究表明，如圖1e所示。片段化線粒體被封閉在GFP-LC3和LAMP1陽性自噬溶酶體中。有趣的是，F(xiàn)UNDC1誘導總線粒體蛋白由于巴佛洛霉素A1能夠增強LC3-II的水平，F(xiàn)UNDC1可誘導自噬通量的增加（圖1g）。如預期的，總的線粒體體積在FUNDC1表達后顯著降低（圖1h）。此外，F(xiàn)UNDC1能夠誘導在MCF7細胞和新鮮分離自小鼠的小鼠胚胎成纖維細胞的線粒體自噬（補充圖S2）。結(jié)論：FUNDC1是介導線粒體自噬，線粒體質(zhì)量控制的重要機制。二作為含有LIR基序的蛋白質(zhì)的FUNDC1是選擇性線粒體的受體目的：21探究FUNDC1

8、對線粒體的自噬的作用22嘗試了解分子機制其中FUNDC1介導有絲分裂2.3論證FUNDC1是否通過LIR與LC3相互作用方法：2.1共免疫沉淀檢查：（a,b）將來自細菌（a）或HeLa細胞裂解物（b）的純化的FUNDC1蛋白與固定的GST或GST-LC3B珠孵育，然后用FUNDC1抗體檢測FUNDC1。使用考馬斯染色觀察GST和GST-LC3B蛋白。（c,d）用GFP或GFP-LC3B轉(zhuǎn)染HeLa細胞。轉(zhuǎn)染后24小時，收集細胞用于用抗GFP或抗FUNDC1的免疫沉淀（IP），并分別用FUNDC1或GFP抗體分析。IB，免疫印跡。（e）FUNDC1與LC3家族蛋白相互作用。將來自HeLa細胞的細

9、胞提取物與固定的GST或所示的GST融合蛋白一起孵育。免疫沉淀FUNDC1用FUNDC1抗體檢測。使用PonceauS染色來顯現(xiàn)GST和GST-融合蛋白。引發(fā)一系列突變，例如Y18A，L21A，Y18A/L21A雙突變體和來自氨基的缺失突變體酸18至21，在宮頸癌細胞中過表達這些突變體。（f）典型的LIR序列與FUNDC1一起手工比對用于比較。陰影區(qū)域表示FUNDC1的推定LIR中的高度保守殘基。（g）用編碼FUNDC1-Myc的質(zhì)?；蛑付ǖ耐蛔凅w轉(zhuǎn)染HeLa細胞。轉(zhuǎn)染后24小時，裂解細胞與固定的GST-LC3B溫育。通過用Myc抗體的western印跡檢測共沉淀的蛋白質(zhì)。使用PonceauS

10、染色來顯現(xiàn)GST-融合蛋白。（h）在顯示Y18evL21的LIR的線粒體外膜中的FUNDC1蛋白的示意圖。2.3（i）用編碼FUNDC1-Myc的質(zhì)?；蛑付ǖ耐蛔凅w（紫色，抗Myc）和GFP-LC3共轉(zhuǎn)染FUNDC1-敲低的HeLa細胞24小時。與野生型FUNDC1相比，F(xiàn)UNDC1的LIR突變體具有削弱的誘導GFP-LC3點數(shù)目增加的能力。比例尺,10口m。（j）用ImageJ（平均值土s.e.m。；來自三次獨立實驗的n=90個細胞）定量用Myc載體或編碼野生型或LIR-突變體FUNDC1的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞中GFP-LC3點的數(shù)量。（k）Western印跡檢測由Myc載體和野生型和LIR突變體

11、FUNDC1誘導的LC3-II的變化。印跡的未裁剪圖像顯示在補充圖。S6。結(jié)果：2.1FUNDC1確實與LC3B（圖2a-d）和其他LC3同源物進行了物理性的相互作用（圖2e）。2.2自噬受體如p62和Atg32與LC3及其同源物，通過具有核心共有序列的典型的線性基序序列W/YxxL/I結(jié)合（圖2f）；表明FUNDC1和LC3之間的相互作用是通過LIR區(qū)域（圖2g）；表明FUNDC1是一個線粒體外膜蛋白，通過其在細胞溶膠暴露N端的LIR與LC3相互作用（圖2h）2.3數(shù)據(jù)表明FUNDC1誘導的線粒體自噬高度依賴于它與LC3的相互作用三內(nèi)源性FUNDC1在線粒體中的生物學意義目的：了解內(nèi)源性FU

12、NDC1在線粒體中的生物學意義方法：.（a）FUNDC1-敲低HeLa細胞與Myc載體和編碼FUNDC1-Myc，F(xiàn)UNDC1118-21，F(xiàn)UNDC1W32-33A（SEQIDNO：藍色，抗Myc）和GFP-LC3孵育24小時。如圖1的標題中所述進行實驗。圖像顯示LIR結(jié)構(gòu)域缺失突變體而不是W32-33A突變體不能誘導GFP-LC3點數(shù)目的增加，盡管它誘導線粒體片段化。比例尺，10口m。定量含有斷裂線粒體的細胞數(shù)（平均值土標準誤差n=來自三次獨立實驗的100個細胞）。（b）用Myc載體和編碼FUNDC1-Myc和FUNDC1118-21的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染FUNDC1-敲低的HeLa細胞。24小時后

13、，處理細胞并通過電子顯微鏡分析（黑色箭頭，自噬空泡）。比例尺，600nm（c）轉(zhuǎn)染的對照細胞和ATG5敲低（ATG5KD）細胞中LC3和TIM23表達的Western印跡分析編碼FUNDC1-Myc的質(zhì)粒12和24小時。（d）使用共聚焦顯微鏡觀察在用編碼FUNDC1（紅色，抗Myc）和GFP-LC3（綠色）的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的對照和ATG5敲低細胞中的自噬體的出現(xiàn)24小時。比例尺，10口m。定量自噬細胞的數(shù)量（平均值土s.e.m。；來自三次獨立實驗的n=100個細胞）。（e）對照細胞和BECN1敲低細胞中LC3和TIM23表達的Western印跡分析用編碼FUNDC1-Myc的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染12和24小時。

14、（f）共聚焦顯微鏡用于顯示在用編碼FUNDC1（紅色，抗Myc）和GFP-LC3（綠色）的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的對照和BECN1敲低細胞中24小時的自噬體的出現(xiàn)。印跡的未裁剪圖像顯示在補充圖。S6。結(jié)果：FUNDC1誘導線粒體依賴于ATG5，因為ATG5的敲低HeLa細胞完全阻斷GFP-LC3斑點的形成LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)化和TIM23的減少，誘導的FUNDC1（圖3c,d）。然而，BECN1的敲低不能預防FUNDC1誘導的mitophagy（圖3e，f）。結(jié)論：數(shù)據(jù)表明FUNDC1通過相互作用介導選擇性的線粒體LC3通過LIR與核心自噬機制耦合四.FUNDC1介導缺氧誘導的mitophagy目的

15、：4.1進一步明確FUNDC1在線粒體中的作用4.2進一步證明FUNDC1是缺氧誘導的mitophagy的特異性調(diào)節(jié)劑方法：4.1（a）將HeLa細胞暴露于缺氧條件指定的時間。TIM23，細胞色素c，鈣聯(lián)接蛋白和LC3蛋白通過蛋白質(zhì)印跡分析。（b）在存在或不存在巴佛洛霉素A1（BFA）的情況下，HeLa細胞用缺氧處理0和12小時;TIM23，TOM20,FUNDC1和LC3。（c）GFP-LC3穩(wěn)定HeLa細胞維持在缺氧條件下24小時。然后用抗VDAC1抗體（5nm金顆粒）處理樣品用于標記線粒體（箭頭）和抗GFP抗體（10nm金顆粒）以標記自噬體（箭頭）的免疫金色電子顯微鏡。比例尺，300nm

16、。（d）對照和FUNDC1敲低（KD）HeLa細胞用1%02處理0或18小時，并通過用不同抗體的western印跡分析。4.2在FUNDC1所在的細胞中進行的救援實驗：（e）對照HeLa細胞和FUNDC1敲低穩(wěn)定HeLa細胞維持在缺氧條件下24小時或?qū)φ誋eLa細胞在常氧條件下培養(yǎng)24小時。通過電子顯微鏡分析樣品。棒，500nm。（f）對照HeLa細胞和FUNDC1敲低的穩(wěn)定HeLa細胞在常氧下生長或暴露于1O224小時。細胞用TIM23染色。通過共聚焦z軸掃描捕獲每個樣品的三個隨機挑取的區(qū)域，并且定量線粒體的總面積和體積（平均值土s.e.m。;來自三次獨立實驗的n=90個細胞）。*P0.01

17、。（g）FUNDC1敲低細胞用FUNDC1或FUNDC1突變體轉(zhuǎn)染24小時，然后暴露于低氧條件另外24小時。收集樣品用于western印跡。（h）對照和FUNDC1敲低細胞暴露于1O224小時。線粒體被細胞色素c抗體染色。計算片段化線粒體的百分比（平均值土s.e.m。；來自三次獨立實驗的n=100個細胞）。*P0.01。（i）對照和FUNDC1敲低細胞用GFP-LC3轉(zhuǎn)染24小時，然后暴露于1O20或24小時。定量每個細胞的GFP-LC3點的數(shù)目（平均值土s.e.m。；來自三次獨立實驗的n=100個細胞）。NS,無顯著性。印跡的未裁剪圖像顯示在補充圖。S6。結(jié)果：4.1生化分析顯示線粒體蛋白T

18、IM23和細胞色素的水平c在缺氧處理中以時間依賴性的方式降低，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白鈣聯(lián)接蛋白不受影響（圖4a）。低氧誘導的線粒體蛋白如TIM23，TOM20和FUNDC1的降解可以被巴弗洛霉素A1抑制（圖4b）。GFP-LC3（10nm免疫膠質(zhì)）-陽性，通過電子顯微鏡分析可以清楚地觀察到含有由VDAC1（5nm免疫膠質(zhì)）標記的線粒體的雙膜自噬體（圖1,4c）。最重要的是，線粒體蛋白的降解可以通過Western印跡分析顯示的FUNDC1的敲低（圖4d）。4.2擊倒FUNDC1導致線粒體完整性的顯著保護（圖4h），而不影響一般自噬如在缺氧處理的細胞中LC3-II的轉(zhuǎn)化和GFP-LC3斑點的總數(shù)所示（圖4d

19、，i）。敲除FUNDC1對饑餓誘導的LC3轉(zhuǎn)化或TIM23和TOM20蛋白的減少沒有影響（補充圖S3a-c）。結(jié)論：在缺氧條件下，F(xiàn)UNDC1介導高選擇性線粒體清除率不影響一般自噬。五.FUNDC1的去磷酸化激活缺氧誘導的線粒體目的：如何調(diào)節(jié)FUNDC1和LC3之間的相互作用以響應(yīng)缺氧。方法：（a）如通過抗-p-FUNDC1（Tyr18）和抗-p-Src（Tyr416）抗體所指示的,FUNDC1和Src激酶在缺氧條件下脫磷酸化的時間過程。（b）用編碼FUNDC1-Myc的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染編碼GFP,Src-GFP或Src（mt）-GFP（激酶死亡）的質(zhì)粒，并通過抗Myc抗體免疫沉淀（IP）樣品，并用

20、抗磷酸酪氨酸抗體。（c）在Src-GFP或GFP存在下，用編碼Myc，F(xiàn)UNDC1-Myc和突變體的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細胞。用抗Myc抗體免疫沉淀裂解物并用所示抗體進行免疫印跡。（d）體外激酶測定：將GST，GST-FUNDC1或GST-FUNDC1Y18W與或不與Src孵育20分鐘，然后通過western印跡分析樣品。（e）Cherry-LC3陽性FUNDC1敲低細胞用編碼FUNDC1或FUNDC1Y18W的質(zhì)粒在Src-GFP或GFP存在下共轉(zhuǎn)染24小時。顯示了代表性的共焦顯微鏡圖像。比例尺，20口m。（f）自噬體（AV）的總面積被定量（平均值土s.e.m。；來自三次獨立實驗的n=200個細

21、胞）。*P0.01。NS，無顯著性。（g）用編碼GFP或Src-GFP的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HeLa細胞維持在缺氧條件下或在常氧條件下保持12小時。通過蛋白質(zhì)印跡分析細胞。（h）將FUNDC1-Myc轉(zhuǎn)染體裂解物與固定的GST或GST-LC3B珠孵育，并通過western印跡檢測。使用PonceauS顯現(xiàn)GST和GST-LC3B。（i）將HeLa細胞暴露于含氧量正?；蛉毖鯒l件下24小時。內(nèi)源性LC3用抗FUNDC1抗體或IgG免疫沉淀。通過western印跡分析樣品。（j）HeLa細胞用缺氧或常氧處理。通過用抗LC3（紅色）和抗FUNDC1（綠色）抗體的免疫熒光顯現(xiàn)樣品。比例尺,20口m。（k）FUND

22、C1在缺氧反應(yīng)的線粒體中的假設(shè)模型。FUNDC1在Tyr18在含氧量正常的Src酪氨酸激酶磷酸化，并在缺氧條件下脫磷酸化。這增加其與LC3-II的結(jié)合，其在缺氧處理下大量產(chǎn)生。LC3結(jié)合的隔離膜的募集將導致線粒體周圍的隔離膜的擴展以形成自噬體，其然后與溶酶體融合降解。印跡的未裁剪圖像顯示在補充圖。S6。結(jié)果：4.1計算分析預測，Src激酶可能負責FUNDC1的Tyr18磷酸化（參考文獻29,30）。FUNDC1的孵育其突變Y18W與Src激酶進一步證明FUNDC1是Src激酶的直接底物（圖5d）。此外，Src激酶抑制FUNDC1介導的線粒體反應(yīng)缺氧（圖5g）。這些數(shù)據(jù)表明FUNDC1的去磷酸化

23、觸發(fā)了線粒體的激活響應(yīng)缺氧。FUNDC1是選擇性的受體通過其特征性LIR來應(yīng)答缺氧的線粒體特異性地與LC3相互作用。在正常生理條件下，F(xiàn)UNDC1介導的mitophagy被其磷酸化抑制在Src激酶的LIR基序的Tyr18位置。關(guān)于缺氧刺激，已發(fā)現(xiàn)FUNDC1是如何作為一個mitophagy受體與核自噬機制耦合（文獻：34）。以前的研究表明Atg32通過其LIR主題與Atg8高度相互作用在酵母中的特異性mitophagy19,20,Atg32和FUNDC1在有絲分裂期間減少（圖5和S4b，c）。線粒體碎裂是一個先決條件，但不足以用于自噬體形成。敲低FUNDC1減少LC3的募集線粒體和預防線粒體碎

24、片缺氧，可降低線粒體的水平。FUNDC1是保守的在高等真核生物中并在大多數(shù)組織中高度表達（補充圖S4a），表明有絲分裂的機制對于細胞功能是重要的。Nix參與缺氧誘導的自噬并且是不可缺少的用于在網(wǎng)織紅細胞期間程序性消除線粒體成熟（文獻：15,27,36）。顯然，F(xiàn)UNDC1誘導的機制線粒體與Nix或其同源物BNIP3的不同。另外，盡管發(fā)現(xiàn)兩者都是參與由缺氧誘導的線粒體誘導，增加的表達觀察到Nix或BNIP3，而FUNDC1的水平降低。此外，Nix和BNIP3定位在其他細胞器，參與調(diào)節(jié)凋亡或程序性壞死影響線粒體呼吸27,39,40。顯然，F(xiàn)UNDC1不影響FUNDC1后缺氧條件下的細胞活力擊倒（補

25、充圖S5b-d）。結(jié)論：總的來說，F(xiàn)UNDC1和BNIP3在誘導有絲分裂中的角色是不同的，雖然我們不能排除他們用于線粒體有合作的可能性。六.一般方法方法動物：基于由InstitutionalAnimalCareCommittee批準的動物方案維持和護理所有小鼠。將成年C57BL/6（B6）小鼠在缺氧室中在含氧量正?；?%缺氧條件下處理72小時，然后制備腦組織，并通過western印跡檢測線粒體蛋白如TIM23，F(xiàn)IS1，MFN1和FUNDC1?？贵w：抗TIM23（1:1,000），抗TOM201:1000（BDBiosciences），抗GFP（1:2000，單克隆;SantaCruz），抗細

26、胞色素c（1:1000），抗鈣粘蛋白-1（1：1,000），抗鈣聯(lián)蛋白單克隆抗體（1：1,000），抗GM130單克隆抗體（1：1,000;BDBiosciences）;抗LC3B多克隆抗體（1:1000），抗肌動蛋白單克隆抗體（1:10,000;Sigma）;抗c-Myc單克隆抗體（1：1,000;SantaCruz）;抗FUNDC1多克隆抗體(1：1,000;AVIVA);抗GFP多克隆抗體(1:2,000;Invitrogen);抗VDAC1單克隆抗體(1:2000)，抗Bnip3多克隆抗體(1:1000;Abeam);抗Src(1：1,000)和抗Sre(Tyr416)多克隆抗體(1：

27、1,000;CellSignaling);抗GST(1:3,000);通過用純化的磷酸肽在FUNDC1中免疫兔并親和純化(Abgent)產(chǎn)生抗P-FUNDC1(Tyr18)多克隆抗體(1：1,000)。使用以下熒光二抗：山羊抗小鼠IgG異硫氰酸熒光素(FITC)，Cy3(DAKO);山羊抗兔IgG(DAKO);山羊抗小鼠Cy5(Invitrogen)。通過使用pET28a表達載體在大腸桿菌中產(chǎn)生的重組FUNDC1(6跨膜結(jié)構(gòu)域)蛋白免疫兔產(chǎn)生針對FUNDC1的多克隆抗體。對于免疫沉淀測定，抗GFP多克隆抗體1:1000(Invitrogen)，抗FUNDC11:1000,抗Mye1:100;用

28、于免疫熒光，抗TIM231:100，抗TOM201:100，抗細胞色素e1:100，抗Mye1:100，抗FUNDC11:50，抗LC3B(納米工具)1:50。使用以下熒光二抗：山羊抗小鼠IgGFITC1：100;山羊抗小鼠IgGCy31:100;山羊抗兔IgGFITC(DAKO)1:100;山羊抗小鼠Cy5(Invitrogen)1:100。BafilomyeinA1和新霉素購自Sigmao免疫金抗體(1:50)購自Jackson實驗室和Sigma。6.3細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：HeLa細胞在補充有10%胎牛血清(Hyclone)和1%青霉素-鏈霉素的DMEM中在37C，5%CO2下生長。用用1%0

29、2，5%CO2和95%N2的預分析氣體混合物沖洗的缺氧室(Billups-Rothenberg)實現(xiàn)缺氧條件。在FUNDC1中用于RNA干擾的靶序列是50-GCAGCACCTGAAATCAACA-30;ATG5中的靶序列為50-GAAGTTTGTCCTTCTGCTA-30;加擾RNA干擾序列為30-GACATTTGTAACGGGATTC-50;在用于RNA干擾的beelin-1中的靶序列是50-CTCAGGAGAGGAGCCATTT-30。根據(jù)制造商的說明書(Ambion)設(shè)計短發(fā)夾RNA的引物，并克隆到pSileneer2.1-neo載體中。為了建立穩(wěn)定的細胞系，用相應(yīng)的載體轉(zhuǎn)染HeLa細胞

30、并用新霉素選擇。6.4實時PCR分析：使用TRIzol試劑(Invitrogen)制備RNA。使用SuperSeriptVILOeDNA合成試劑盒(Invitrogen)合成互補DNA。通過使用QuantOneStepqRT-PCR(Probe)試劑盒(Tiangen)和CFX96實時PCR檢測系統(tǒng)(AppliedBiosystems)進行實時PCR。對于半定量PCR，(ATGGCATCCCGGAACCCCC-3050AGATGCCAGGCCTAGCAAAAAG-3050HPRTCACAGGACTAGAACACCTGC-3050-GCTGGTGAAAAGGACCTCT-30（反向）。引物如下正

31、反正FUNDC150向向向?qū)τ趯崟rPCR引物如下:FUNDC150-GCAGTAGGTGGTGGCTTTC-30（正向）和50TGCTTTGTTCGCTCGTTT-30反向），50-GAPDHTGCACCACCAACTGCTTAGC-30（正向）和50-TCTTCTGGGTGGCAGTGATG-30（反向）。6.5細胞活力測定：根據(jù)標準方案使用膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶測定試劑盒(BDBioseienees)通過膜聯(lián)蛋白V標記評價細胞凋亡事件。使用商業(yè)LDH測定試劑盒(JianchengBioengineering)根據(jù)制造商的說明書檢測LDH活性。6.6免疫熒光顯微鏡：細胞在蓋玻片

32、上生長至60%匯合。處理后，用PBS洗滌細胞兩次，并在37C下用新鮮制備的3.7%甲醛固定15分鐘。通過用0.2%TritonX-100處理增加抗原可及性。將細胞與第一抗體孵育1小時，并且在用PBS洗滌后，用第二抗體染色另外45分鐘。用LSM510Zeiss共聚焦顯微鏡捕獲細胞圖像。電子顯微鏡。如上所述培養(yǎng)和處理細胞。對于免疫電泳顯微術(shù)，首先將細胞用2%多聚甲醛和0.2%戊二醛在二甲胂酸鈉緩沖液（pH7.4）中37C孵育2小時，然后脫水在分級乙醇系列中并嵌入丙烯酸樹脂（LRWhite）中。70nm超薄將切片安裝在鎳網(wǎng)上，用1%BSA/PBS孵育并孵育在4C下用1%BSA/PBS中的一抗（抗GF

33、P抗體（稀釋度1/200）和/或抗VDAC1抗體，終濃度為2ug/ml）的混合物過夜，洗滌5次，每次5min，然后在5%（或20nm）的山羊抗小鼠對于VDAC1和10nm山羊抗兔對于在1%BSA/PBS中的GFP-LC3金綴合的顆粒標記2小時。最后在0.5%BSA/PBS中將網(wǎng)格洗滌4次，每次5分鐘，在1%戊二醛/PBS中孵育15分鐘，在PBS中洗滌2次，在蒸餾水中洗滌3次，在室溫下染色和干燥。使用120kVJeol電子顯微鏡在80kV下觀察樣品，并使用AMT數(shù)字照相機捕獲圖像。SDS和western印跡：在裂解中裂解細胞或膜級分緩沖液（20mMTris，pH7.4,2mMEGTA，1%NP-40，蛋白酶抑制劑）。當量蛋白質(zhì)量（20ug）進行SDS，并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。用所示的一級抗體，隨后是合適的HRP綴合的二級抗體（KPL）探測膜。用化學發(fā)光試劑盒（Pierce）顯現(xiàn)免疫反應(yīng)條帶。免疫沉淀。使用鈣瞬時轉(zhuǎn)染HeLa細胞磷酸鹽法。轉(zhuǎn)染后24小時，將細胞用0.5ml裂解緩沖液加蛋白酶抑制劑（RocheAppliedScience）在冰上30分鐘。在12,000g離心15分鐘后，裂解物進行免疫沉淀與特異性抗體和蛋白A-Sepharose（Invitrogen）在4過夜。然后，用裂解緩沖液洗滌沉淀物三次，免疫復合物用含有1%SDS的樣品緩沖液洗脫5分鐘在95C下