PCR原理及檢測(cè)說課講解課件

1、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的基本 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR：Polymerase Chain Reaction) Kary B. Mullis PCR是由美國科學(xué)家穆利斯提出的一種體外簡(jiǎn)化條件下模擬DNA體內(nèi)復(fù)制的DNA快速擴(kuò)增的方法，此技術(shù)獲得1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。PCR的概念PCR體系的組成常見的PCR分類PCR產(chǎn)物常見的檢測(cè)方法 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR：Polymerase Chain Reaction) 它是一個(gè)在體外特異地復(fù)制一段已知/未知（？）序列的DNA片段的過程，這項(xiàng)技術(shù)使人們很快從試管中獲得大量拷貝的特異核酸片段。 PCR的基本原理 變性、復(fù)性、半保留復(fù)制一生二，二生四，四生萬物

2、 PCR三步曲變性 9097退火 4555延伸 72左右PCR過程PCR反應(yīng)循環(huán)729555PCR循環(huán)變性退火延伸1234522557294時(shí)間（min）溫度（）2. PCR的反應(yīng)過程適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)13步2530輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)1234522557294時(shí)間（min）溫度（）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)13步2530輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DN

3、A95PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)9550引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)50引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72第1輪結(jié)束95第2輪開始PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)955072TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72第2輪結(jié)束3. PCR技術(shù)的特點(diǎn)1）高度的靈敏性30輪循環(huán)擴(kuò)增量達(dá)230個(gè)拷貝（109拷貝）PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍2 ）特異性引物引物 引物的序列及其與模板結(jié)合的特異性是決定PCR反應(yīng)結(jié)

4、果的關(guān)鍵。 引物設(shè)計(jì)的最大原則是最大限度地提高擴(kuò)增效率和特異性；同時(shí)盡可能減少非特異性擴(kuò)增。引物設(shè)計(jì)原則：（1) 序列應(yīng)位于高度保守區(qū),與非擴(kuò)增區(qū)無同源序 列。（2）引物長(zhǎng)度以15-40 bp為宜。（3）堿基盡可能隨機(jī)分布,G+C占50-60%。（4）引物內(nèi)部避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。（5）兩引物間避免有互補(bǔ)序列。（6）引物3端為關(guān)鍵堿基；5端無嚴(yán)格限制。3535限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列啟動(dòng)子序列定點(diǎn)突變探針標(biāo)記3）操作簡(jiǎn)便易行 PCR擴(kuò)增法,只需要數(shù)小時(shí),就可以用電泳法檢出1g基因組DNA中僅含數(shù)個(gè)拷貝的模板序列。 通常的DNA 擴(kuò)增法是分子克隆法, 首先要構(gòu)建含有目的的基因的載體, 然后將它導(dǎo)入細(xì)胞

5、后進(jìn)行擴(kuò)增,還要用同位索探針進(jìn)行篩選;這種方法,要經(jīng)過DNA內(nèi)切、連接、轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)等相關(guān)的過程,操作復(fù)雜,一般需要數(shù)周時(shí)間。4 ）用途廣泛生命學(xué)科醫(yī)學(xué)工程遺傳工程疾病診斷法醫(yī)學(xué)考古學(xué) PCR的特點(diǎn)靈敏度高皮克(pg=10-12)量級(jí)擴(kuò)增到微克(ug=10-6)水平能從100萬個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞病毒檢測(cè)的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU細(xì)菌檢測(cè)的最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌簡(jiǎn)便、快速一次性加好反應(yīng)液，24 小時(shí)完成擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析對(duì)標(biāo)本的純度要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等組織的粗提DNA4.PCR的反應(yīng)體系和方法 PCR管加熱使模板變性, 退火使引物與模板DNA互補(bǔ),延伸需將反應(yīng)溫度

6、升至中溫( 72),在Tap多聚酶的作用下,以dNTP為原料,以引物為復(fù)制的起點(diǎn),合成新鏈。 如此重復(fù)改變反應(yīng)溫度,即高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個(gè)階段為一個(gè)循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬倍; 將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳,經(jīng)溴化乙錠染色,在紫外燈照射下肉眼能見到擴(kuò)增特異區(qū)段的DNA帶。 總體積 50-100 l Buffer 緩沖液 dNTP 原料 Primer 引物 DNA分子 模板 Taq DNA聚合酶 1）反應(yīng)體系PCR技術(shù)的基本過程(1)模板DNA dNTP 引物Buffer預(yù)變性模板DNA dNTP 引物BufferTaqD

7、NA聚合酶94oC52）基本過程PCR技術(shù)的基本過程(2)Taq 酶模板DNA dNTP 引物Buffer循環(huán)儀9455 72 Taq 酶模板DNA dNTP 引物Buffer72 57 min循環(huán)2535次瓊脂糖凝膠電泳PCR技術(shù)的基本過程(3)1）PCR反應(yīng)成分（1）模板 單、雙鏈DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。 一般100ng DNA模板/100L。 模板濃度過高會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。3）PCR反應(yīng)條件提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)一般臨床檢測(cè)標(biāo)本，可采用快速簡(jiǎn)便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于

8、PCR擴(kuò)增RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA（2）引物濃度 0.1-0.5 mol/L 濃度過高易導(dǎo)致模板與引物錯(cuò)配,反應(yīng)特異性下降。 引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，用 PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增目前有兩種 Taq DNA 聚合酶供應(yīng)天然酶：從棲熱水生桿菌中提純基因工程酶：大腸菌合成一個(gè)典型的 PCR反應(yīng)約需酶量 2.5U（指總反應(yīng)體積為100 ul時(shí)）濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少（3）Taq DN

9、A聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 l（4）dNTP dNTP濃度取決于擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度 四種dNTP濃度應(yīng)相等 濃度過高易產(chǎn)生錯(cuò)誤堿基的摻入,濃度過低則 降低反應(yīng)產(chǎn)量 dNTP可與Mg2+結(jié)合,使游離的Mg2+濃度下降, 影響DNA聚合酶的活性。dNTP 的質(zhì)量與濃度dNTP的質(zhì)量與濃度和 PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系dNTP呈顆粒狀， 保存不當(dāng)易變性失活dNTP溶液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris-HCl的緩沖液將其pH調(diào)節(jié)到7.0-7.5，小量分裝，-20冰凍保存。多次凍融會(huì)使dNTP降解在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50-20

10、0umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等（等摩爾配制 ）， 如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)（偏高或偏低），就會(huì)引起錯(cuò)配。濃度過低又會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量dNTP 能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低（5）Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。0.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系。Mg2+濃度過低會(huì)使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降； Mg2+過高影響反應(yīng)特異性。Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合,所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。2）循環(huán)參數(shù)變性 使雙鏈DNA解鏈為單鏈 94oC 20-30秒(2) 退火 溫度由引物長(zhǎng)度和GC含量決定。

11、增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合;降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。（3）延伸 70-75,一般為72 延伸時(shí)間由擴(kuò)增片段長(zhǎng)度決定（4）循環(huán)次數(shù) 主要取決于模版DNA的濃度 一般為25-35次 次數(shù)過多：擴(kuò)增效率降低 錯(cuò)誤摻入率增加經(jīng)典循環(huán)參數(shù)（500bp以內(nèi)）94 30s 55 45s72 1min94 5min30次72 7min42 forever3）PCR反應(yīng)條件的選擇PCR反應(yīng)條件:溫度時(shí)間循環(huán)次數(shù)溫度與時(shí)間的設(shè)置：設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在9095變性，再迅速冷卻至40 60，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至7075，在Taq DN

12、A 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸對(duì)于較短靶基因（長(zhǎng)度為100300bp時(shí)）可采用二溫度點(diǎn)法， 將退火與延伸溫度合二為一，一般采用94變性，65左右退火與延伸 變性溫度與時(shí)間：變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因一般9394lmin足以使模板DNA變性若低于93則需延長(zhǎng)時(shí)間但溫度不能過高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對(duì)酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會(huì)導(dǎo)致PCR失敗 退火(復(fù)性)溫度與時(shí)間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素變性后溫度快速冷卻至4060，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA 比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間

13、的碰撞退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長(zhǎng)度對(duì)于20個(gè)核苷酸，G+C含量約50%的引物，55為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想引物的復(fù)性溫度通過以下公式幫助選擇合適的溫度：Tm值（解鏈溫度）=4（G+C）2（A+T）在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性復(fù)性時(shí)間一般為30-60sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合 延伸溫度與時(shí)間：Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性： 70-80 150核苷酸/S/酶分子 70 60核苷酸/S/酶分子 55 24核苷酸/S/酶分子 高于90時(shí)，DNA合成幾乎不能進(jìn)行 延伸溫度

14、與時(shí)間：延伸溫度：一般選擇在7075之間常用溫度為72過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。延伸反應(yīng)時(shí)間：根據(jù)待擴(kuò)增片段長(zhǎng)度而定1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時(shí)間1min（足夠） 34kb的靶序列需34min擴(kuò)增10Kb需延伸至15min延伸進(jìn)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時(shí)間要稍長(zhǎng)些循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)決定PCR擴(kuò)增程度循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度循環(huán)次數(shù)：選在3040次之間循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多三、常見的PCR技術(shù)名稱主要用途簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增法擴(kuò)增未知基因片斷巢式PCR提高pcr敏感性、特異性，分析突變復(fù)合PCR同時(shí)檢測(cè)多個(gè)突變或病原反向PCR擴(kuò)增已知序列兩

15、側(cè)的未知序列，致產(chǎn)物突變單一特異引物PCR擴(kuò)增未知基因組DNA單側(cè)引物PCR通過已知序列擴(kuò)增未知cDNA錨定PCR分析具備不同末端的序列名稱主要用途增效PCR減少引物二聚體，提高PCR特異性固著PCR有利于產(chǎn)物的分離膜結(jié)合PCR去除污染的雜質(zhì)或PCR產(chǎn)物殘留表達(dá)盒PCR產(chǎn)生合成或突變蛋白質(zhì)的DNA片斷連接介導(dǎo)PCRDNA甲基化分析、突變和克隆等RACE- PCR擴(kuò)增cDNA末端定量PCR定量mRNA或染色體基因原位PCR研究表達(dá)基因的細(xì)胞比例等臆斷PCR鑒定細(xì)菌或遺傳作用通用引物PCR擴(kuò)增相關(guān)基因或檢測(cè)相關(guān)病原信使擴(kuò)增表型分型同時(shí)分析少量細(xì)胞的mRNA定量PCR：熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)是指在P

16、CR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通 過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法 。常用的熒光標(biāo)記方法可簡(jiǎn)單分為兩大類：非特異檢測(cè)雙鏈DNA內(nèi)插式熒光染料；代表是SYBR Green I熒光染料 擴(kuò)增序列專一檢測(cè)主要指熒光探針。TaqMan探針、和分子信標(biāo)Molecular Beacon 熒光染料技術(shù)成本低廉，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)便；而探針雜交技術(shù)在原理上嚴(yán)格，所得數(shù)據(jù)特異性高、更為精確 SYBR Green I 工作原理：SYBR Green 1 結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位SYBR Green 1 染料只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光。GTTTGGCCCCCCCAAAG

17、GGACTTGATAGCATCGTAASYBR Green I只與DNA雙鏈結(jié)合，插入DNA雙鏈時(shí)發(fā)出熒光；DNA雙鏈解鏈時(shí)釋放出來，熒光信號(hào)急劇減弱。在一個(gè)加入過量SYBR green 1熒光染料的體系內(nèi)，其信號(hào)強(qiáng)度代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量 GTTTTTTGGGGCCCCCCCCAAAAATACCGGGGTTACGAACGGTAAT變性 DNA未結(jié)合SYBR Green 1 dye變性: 無熒光信號(hào)SYBR Green I 工作原理Molecular Beacons莖由互補(bǔ)配對(duì)的序列組成環(huán)與目標(biāo)序列完全配對(duì)熒光基團(tuán)淬滅基團(tuán)分子信標(biāo)（molecular beacon）是一類能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)(或

18、者叫莖環(huán)結(jié)構(gòu))的探針，序列兩末端序列互補(bǔ)（58bp左右），中間環(huán)一般為15-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)，并與目標(biāo)序列互補(bǔ)。探針一端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)，另一端結(jié)合淬滅基團(tuán)，當(dāng)互補(bǔ)序列出現(xiàn)時(shí)，探針與DNA雜交，探針轉(zhuǎn)變成一個(gè)開放的線性結(jié)構(gòu)，報(bào)告熒光基團(tuán)與淬滅熒光基團(tuán)彼此在空間上產(chǎn)生足夠的分離，熒光基團(tuán)脫離了淬滅基團(tuán)的影響，從而產(chǎn)生可被檢測(cè)到的熒光 當(dāng)探針游離呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)時(shí)，結(jié)合在其兩端的熒光基團(tuán)距離上接近，熒光基團(tuán)激發(fā)的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收而使檢測(cè)探頭無法檢測(cè)到。延伸: 沒有熒光Molecular BeaconsMolecular Beacons SNPTACCGGGGGTTACGAACGGTAATTTTTGCCCCCAAAAQ熒光素目標(biāo)序列莖淬滅劑指擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)另外加入一個(gè)特異性的熒光探針：該探針只與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)在