細菌耐藥監(jiān)測的質(zhì)量控制課件

1、細菌耐藥監(jiān)測的質(zhì)量控制湖南省臨床檢驗中心趙艷華細菌耐藥性監(jiān)測的的意義：監(jiān)測病源微生物對抗生素的敏感性和耐藥性，避開其耐藥機制，指導合理用藥抓好細菌耐藥性監(jiān)測中的質(zhì)量控制，是保證監(jiān)測數(shù)據(jù)的準確性、可靠性的至關重要的環(huán)節(jié)各成員單位進行耐藥監(jiān)測工作時需嚴格執(zhí)行質(zhì)量控制措施。 外部質(zhì)量控制體系 內(nèi)部質(zhì)量控制體系 內(nèi)部質(zhì)量控制體系：各成員單位臨床微生物室（科）要建立完善的質(zhì)量管理體系，建立健全室內(nèi)質(zhì)量控制體系； 外部質(zhì)量控制體系：各成員單位定期參加國家或省臨床檢驗質(zhì)量控制中心的質(zhì)控考核并合格。 質(zhì)量控制概念的引入歷史上，現(xiàn)代風險管理的概念引入實驗室之后，就以質(zhì)量控制的形式出現(xiàn)。狹義上指的是一項持續(xù)的、系

2、統(tǒng)性的評估工作來確保終產(chǎn)品的一致性根據(jù)可接受的程度：事先建立好的允許限度下的精確度和準確度。細菌耐藥性監(jiān)測的內(nèi)部質(zhì)量控制體系主要目標 保證實驗結(jié)果的準確性、可靠性和可重復性實驗室應對分析前、分析中、分析后三個階段實行全面質(zhì)量管理標本分析前的質(zhì)量控制： 微生物學特殊性得到正確分析結(jié)果的基礎樣本質(zhì)量控制樣本質(zhì)量是影響細菌學實驗室結(jié)果的關鍵環(huán)節(jié)實驗室應給標本采集者提供標本采集和運送的指導手冊實驗室應持續(xù)監(jiān)測標本采集和運送過程實驗室應對標本質(zhì)和量（包括體積和數(shù)量）進行監(jiān)測樣本質(zhì)量控制標本采集：采集部位、采集數(shù)量和體積、采集時機、污染標本保存：保存條件、保存時間標本運輸：防止污染標本驗收：標本采集時間、

3、標本量、標本評估標本分離接種：病理成分的選取、選擇合適的分離培養(yǎng)基和方式收集和運送微生物標本的容器要求1、無菌2.無防腐劑3.足夠大4.安全嚴密5.不易碎6.運送培養(yǎng)基 加強無生長因子或保持特定菌的培養(yǎng)基避免用木質(zhì)的棉試子對細菌有毒害收集細菌實驗的標本避免污染抽血前，皮膚必須經(jīng)過嚴格消毒。如果可能，化膿性損傷應通過皮膚抽血，因為這種方法比黏膜更容易消毒液體標本比拭子標本更適合檢測。抽取物用注射器送到實驗室之前應先把針頭去掉，注射器口用安全帽封好。開放傷口，擦去表層分泌物，防止其它細菌干擾。 用拭子取傷口邊緣處運送時間及運輸貯存溫度運送時間-短，運輸貯存溫度因細菌不同而異標本因冷藏及pH改變或在

4、氧氣中暴露，可能減少很多種細菌的存活時間 腦膜炎球菌，淋病奈瑟菌，流感嗜血桿菌，肺炎鏈球菌，布氏桿菌，沙門菌，志賀氏菌，霍亂弧菌，空腸彎曲菌及厭養(yǎng)菌。 對環(huán)境敏感菌株在運送中數(shù)量快速減少時，如果運送時間太長，其它菌則成倍增長，這給需定量評價數(shù)的培養(yǎng)造成困難（尿標本），需要尋找的細菌可同其它菌一起過度生長。 需進行細菌學檢測的所有標本，應在收集后2小時內(nèi)送到實驗室 各種標本的運送及貯存條件標本運送貯存溫度血血培養(yǎng)瓶 室溫或37 膿 、腦脊液 、胸水、心包液 、腹水、關節(jié)滑液 、鼻竇分泌物 短時間內(nèi)運送: 標本在帶帽的注射器內(nèi)保證厭氧條件；長時間運送：使用運送培基室溫，不用培養(yǎng)，避免冷藏支氣管肺泡

5、灌洗液、痰，其它分泌物 、便 立刻送檢（2-3小時）冷藏眼 、耳 、嘴、咽 、鼻、尿道、生殖道 、直腸、傷口拭子放在運送培養(yǎng)基(4小時運送時間)室溫，不培養(yǎng)痰標本合格標準痰標本留取后應先涂片, 進行革蘭染色鏡檢合格后再接種痰標本鱗狀上皮細胞白血球細菌種類合格=101-3種不合格=25/低倍3種拒收標本指標 除非不能再采集的標本，否則不予檢測；如果培養(yǎng)或檢測，要對結(jié)果進行說明。書寫錯誤容器問題干燥試子厭養(yǎng)菌容器無菌、無防腐劑、足夠大、安全嚴密不易碎、運送培養(yǎng)基、無生長因子或保持特定菌的培養(yǎng)基、避免用木質(zhì)的棉試子對細菌有毒害細菌學實驗室檢測方法確認臨床細菌學實驗室選擇的檢測方法準確性和重復性好檢測

6、結(jié)果的臨床相關性好 更換新的檢測方法應證明其準確度和精密度良好應在工作人員具備相應的操作能力和具備研判和報告結(jié)果的能力后進行細菌學實驗室檢測方法確認不需確認的試驗方法SFDA批準的一般試驗不需進行確認試驗單個試劑和培養(yǎng)基通過日常質(zhì)控進行檢測，不需進行確認試驗 需確認的試驗方法如抗菌藥物敏感試驗 血培養(yǎng) 非培養(yǎng)的檢測方法SFDA批準試驗方法的改良方法未經(jīng)SFDA批準的方法自己開發(fā)的方法細菌學實驗室檢測方法確認確認的內(nèi)容實驗室可否獲得與制造商相同的檢測結(jié)果非商品檢測方法應與可接受的參考方法進行比較應評價方法的敏感性、特異性、準確性、精密度和預測值細菌學實驗室檢測方法確認方法確認需至少20個陽性標本

7、和20-50個陰性標本至少檢測12-15個種的50株菌與參考方法比較，新方法的敏感性和特異性應95%經(jīng)方法學確認的試驗方法，在實踐中應記錄其質(zhì)控資料、人員能力、PT結(jié)果、儀器校準、臨床相關性等資料，達到臨床確認分析中質(zhì)量控制 常規(guī)儀器和設備 成品商業(yè)培養(yǎng)基（診斷抗血清）、試劑設備的質(zhì)量控制預防性維護與保養(yǎng)可保證儀器的精確性和使用壽命按照制造商的建議，有計劃的定期檢查可減少儀器故障和維修需要明確維護保養(yǎng)的責任是保障設備完好的前提商家的支持是保障設備完好的后盾設備的質(zhì)量控制新設備的檢查，包括如安全性、配件、有無破損等新設備比對實驗（與舊設備比對或與參考設備或方法比對）設備運行記錄、維護保養(yǎng)記錄、維

8、修記錄制定和執(zhí)行標準操作規(guī)程培訓操作人員設備的質(zhì)量控制培養(yǎng)箱、冰箱、水浴箱 每天有溫度記錄二氧化碳培養(yǎng)箱 每天檢查CO2含量高壓滅菌器和干熱滅菌器 應有溫度記錄裝置和滅菌指示劑厭氧罐或厭氧箱 美籃為指示劑，無氧時應無色生物安全柜 更換濾網(wǎng)由專門技術人員進行細菌培養(yǎng)儀 對每批培養(yǎng)瓶進行生長試驗。保證在有效期內(nèi)使用微生物鑒定儀 及時更新系統(tǒng)操作軟件 使用細菌鑒定儀要注意維持比色的清潔，不要在比色板上方添加試劑；取、放鑒定條要小心，以免打翻溢出；比色完畢即將比色板送入機體內(nèi)。定期請工程師校對比色、比濁系統(tǒng)，也可用標準菌株作質(zhì)控對照 儀器設備質(zhì)量控制標準 設備 控制標準 允許范圍高壓滅菌器 121 1

9、21 孵育箱 35 1 水溫箱 37 1 冰箱 4 2 低溫冰箱 -20 5 二氧化碳培養(yǎng)菌 5%10% 10%培養(yǎng)基質(zhì)量控制 1 一般性狀 培養(yǎng)基的一般性狀包括外觀、厚度、 pH 值等 液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基2 無菌試驗 壓力蒸汽滅菌后傾注的固體培養(yǎng)基 滅菌后無菌操作分裝的液體培養(yǎng)基 無需高壓滅菌只需煮沸消毒的選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)基名稱 質(zhì)控菌株 ATCC 鑒定標準 血平板 金黃色葡萄球菌化膿性鏈球菌肺炎鏈球菌大腸埃希菌 2592319615630525922 中度到大量生長生長， - 溶血生長，溶血生長 巧克力平板 流感嗜血桿菌腦膜炎奈瑟菌淋病奈瑟菌 102111309043096 生長生長生

10、長 伊紅美藍平板 鼠傷寒沙門菌大腸埃希菌糞腸球菌 140282592229212 生長，無色到琥珀色菌落生長，藍黑菌落，金屬光澤部分抑制 麥康凱平板 大腸埃希菌奇異變形桿菌鼠傷寒沙門菌糞腸球菌 25922124531402829212 生長，紅色菌落生長， 無色菌落，遷徒現(xiàn)象部分抑制生長，無色菌落部分抑制 11 種常用培養(yǎng)基的質(zhì)量鑒定SS 平板 鼠傷寒沙門菌福氏志賀菌糞腸球菌大腸埃希菌 14028120222921225922 生長，無色菌落，有或無黑心生長，無色菌落全部抑制部分或全部抑制 TCBS 平板 霍亂弧菌副溶血弧菌大腸埃希菌 94591780225922 生長，黃色菌落生長，藍色菌落

11、部分或全部抑制 營養(yǎng)瓊脂平板沙保弱平板 福氏志賀菌白色念珠菌大腸埃希菌 120221023125922 中度到大量生長生長部分或全部抑制 羅氏培養(yǎng)基 結(jié)核分枝桿菌 H37R大腸埃希菌 2517725922 生長部分或全部抑制 淋病選擇性培養(yǎng)基 淋病奈瑟菌奇異變形桿菌表皮葡萄球菌 430964307112228 生長部分抑制部分抑制 11 種常用培養(yǎng)基的質(zhì)量鑒定測定羊血瓊脂平板的性能 培養(yǎng)基質(zhì)控菌株判定標準生長試驗金黃色葡萄球菌 ATCC25923生長溶血反應肺炎鏈球菌ATCC19615生長，溶血 化膿性鏈球菌 ATCC6305生長，溶血 桿菌肽敏感（紙片法） 化膿性鏈球菌 ATCC630510

12、mm，敏感B群鏈球菌10mm，耐藥染色液質(zhì)量控制 染色液應每周作一次質(zhì)量控制。用金黃色葡萄球菌 (ATCC25923) 。大腸埃希菌 (ATCC 25922) 作革蘭染色液的室內(nèi)質(zhì)控。用結(jié)核分枝桿菌 H37Ra(ATCC 25177) 對抗酸染色液進行質(zhì)量鑒定。試劑質(zhì)控診斷血清的質(zhì)控 初次使用時應注意：根據(jù)使用說明來使用和保存，凍干制品還應注明配成水溶液的日期，應用已知菌效價和特異性進行測定，合格者方可使用。貯存于 4 ，每 3 個月對血清進行一次質(zhì)控。 試劑名稱 陽性對照菌種 陰性對照菌種 監(jiān)控頻率 凝固酶血漿 金黃色葡萄球菌 表皮葡萄球菌 每天 桿菌肽 A 群鏈球菌 B 群鏈球菌 每周 O

13、ptochin 紙片 肺炎鏈球菌 每周 10% 去氧膽酸鈉 肺炎鏈球菌 每周 三氯化鐵（馬尿酸鈉試驗） B 群鏈球菌 A 群鏈球菌 每次 常用試劑的質(zhì)量鑒定 過氧化氫 金黃金葡萄球菌 A 群鏈球菌 每天 氧化酶 銅綠假單胞菌 大腸埃希菌 每天 甲基紅試劑 雷極普羅威登斯菌 陰溝腸桿菌 每周 VP 試劑 粘質(zhì)沙雷菌 雷極普羅威登斯菌每周 三氯化鐵（苯丙氨酸脫氫酶試驗） 雷極普羅威登斯菌陰溝腸桿菌每周 常用試劑的質(zhì)量鑒定 “ X ”因子條狀物 嗜沫嗜血桿菌 副流感嗜血桿菌 每周 “V ”因子條狀物 副流感嗜血桿菌 流感嗜血桿菌 每周 “ X+V ”因子條狀物 流感嗜血桿菌副流感嗜血桿菌 每周 芽管

14、血清 白色念珠菌 熱帶念珠菌 每次 常用試劑的質(zhì)量鑒定 抗菌藥物敏感性試驗 AST 目的 檢出細菌對抗生素的耐藥性， 預測臨床治療結(jié)果 體外R體內(nèi)R，對R的結(jié)果可以相信 體外S體內(nèi)S，對S的結(jié)果應持懷疑態(tài)度 定義：AST 是一個檢測細菌耐藥性的體外抑菌試驗（ART）如果沒有細菌耐藥性檢測治療過度：用藥不當，過度使用抗生素治療錯誤：用藥錯誤，危重患者喪失搶救時機增加不必要的副作用增加不必要的費用增加細菌的耐藥性降低醫(yī)療服務的質(zhì)量（1）手工試驗 1.紙片擴散法（S，I，R） 2.稀釋法（MIC） 3.E test（MIC）（2）自動儀器 Vitek，Microscan， Phoenix（3）分子試

15、驗 PCR直接檢測mecA基因（4）酶試驗 Nitrocefin、ESBL檢測方 法：紙片法最適合常規(guī)實驗室使用。其特點是方便、易操作，測定的藥物隨意可變，靈活性強。重要的是紙片法藥敏試驗有一套完善的質(zhì)量控制方法，結(jié)果相當可靠。紙片法唯一的不足是中度耐藥的菌株會出現(xiàn)問題。肉湯稀釋法和瓊脂稀釋法是把抗菌藥物倍比稀釋在肉湯或瓊脂中定量測定MIC的方法。稀釋法可以精確測定一些厭氧菌及苛養(yǎng)菌，而對這些菌紙片擴散法是無能為力的。瓊脂稀釋法較肉湯稀釋法精確的原因在于細菌的生長情況可查，且一套平皿可測多株細菌。這兩種方法的缺點的耗時費力。自動化藥敏儀目前，有Vitek系統(tǒng)、Microscan系統(tǒng)、Senss

16、titerARIS等。但自動化儀也有一定的局限性。首先藥物的選擇缺乏靈活性，其次檢測一些特殊菌的耐藥性時有困難，尤其是快速藥敏板，其可靠性不佳。 E-Test法是結(jié)合擴散法和稀釋法的特點，長塑料條含有連續(xù)的呈指數(shù)梯度變化的抗菌藥物，具有精確、可靠、穩(wěn)定性好的特點，且各種耐藥表型均有良好的效果，唯一的缺點是價格昂貴。 藥物敏感試驗的質(zhì)量控制紙片擴散法:每周至少一次;更換藥物或培養(yǎng)基是要做質(zhì)控常用質(zhì)控菌株:金黃色葡萄球菌ATCC25923大腸埃希菌ATCC25922 銅綠假單胞菌ATCC27853稀釋法(手工):每周至少一次,最好每批實驗標準菌株和臨床分離菌同時做常用質(zhì)控菌株:金黃色葡萄球菌ATC

17、C29213大腸埃希菌ATCC25922 銅綠假單胞菌ATCC27853藥物敏感試驗質(zhì)量控制培養(yǎng)基：每批做一次質(zhì)控紙片：每批并每周一次菌懸液濃度標準：為1.5108CFUmlM-H瓊脂平皿定量在瓊脂擴散法藥敏試驗中，M-H瓊脂厚度是嚴重影響紙片藥敏試驗結(jié)果的重要因素，瓊脂培養(yǎng)基越厚抑菌環(huán)直徑越小、反之則越大；克服的辦法是要在保持水平的平臺上（水平儀）定量傾注培養(yǎng)基，這個問題至今未被充分的重視。10cm的平皿應傾注23-25ml的培養(yǎng)基。 抗菌藥紙片貯藏 紙片失效是造成藥敏結(jié)果錯誤的最重要的原因，必須在-20或更低溫度的低溫冰箱中保存紙片，近期使用的紙片只需放4冰箱，一周后棄取，更換新紙片。藥物

18、敏感試驗質(zhì)量控制連續(xù)質(zhì)控檢測1次/天共30天，獲30個檢測值，如：1、3個值超出范圍，可行每周一次質(zhì)控 2、4個值超出范圍，繼續(xù)做每天一次質(zhì)控 3、每當試劑、藥敏紙片、培養(yǎng)基改變時，應重新行30天的質(zhì)控 4、每周一次質(zhì)控時如某周出現(xiàn)一次失控，則應連續(xù)做5次質(zhì)控。零失控時作每周一次質(zhì)控，否則行連續(xù)30次質(zhì)控藥物敏感試驗(儀器法)使用廠家規(guī)定的標準菌株對相應試劑進行質(zhì)控每批試劑至少一次當試驗結(jié)果異常、不穩(wěn)定，或缺少經(jīng)驗的人員操作時，應增加質(zhì)控頻率。分析后的質(zhì)量控制包括：結(jié)果分析、解釋 及報告（包括監(jiān)測結(jié)果的正確報告）合理使用耐藥性分析軟件1.不可能的結(jié)果如MRSA對青霉素類敏感；耐慶大霉素的革蘭陽

19、性球菌對其他氨基糖苷類敏感；腸桿菌科耐三代頭孢卻對氨基、羧基西林或一代頭孢菌素敏感此類結(jié)果必須找出原因。2.需要修正的結(jié)果葡萄球菌、嗜血桿菌或淋病奈瑟菌，如-內(nèi)酰胺酶陽性時應報告對所有青霉素類耐藥。耐林可霉素的葡萄球菌即使出現(xiàn)對克林霉素敏感的結(jié)果也應報耐藥。耐慶大霉素的革蘭陽性球菌即使出現(xiàn)對阿米卡星、奈替米星敏感的結(jié)果，因只抑菌而不殺菌，也應報告耐藥。同樣，托布霉素/阿米卡星也有類似規(guī)律。3.提示性藥物細菌對此種藥物耐藥可提示對同類藥物均耐藥。葡萄球菌對苯唑西林耐藥，提示對所有-內(nèi)酰胺類抗生素均耐藥，也會對氨基糖苷類耐藥。耐氨芐西林的腸球菌提示對所有青霉素類及亞胺培南耐藥。耐慶大霉素的革蘭陽性球菌對氨基糖苷類均耐藥。大腸埃希菌或克雷伯菌對頭孢泊肟、頭孢他啶或氨曲南耐藥提示會產(chǎn)生超廣譜-內(nèi)酰胺酶（ESBL)。4.需向臨床醫(yī)師解釋的結(jié)果MRS的體外藥敏試驗可能出現(xiàn)對某種頭孢菌素類、碳青霉烯類或-內(nèi)酰胺酶抑制類抗生素的敏感結(jié)果，但用藥無效。具有ESBL的大腸埃?；蚩死撞词乖囼炛袑δ撤N-內(nèi)酰胺類敏感也在臨床無效，均應向臨床解釋。外部質(zhì)量控制體系：室間質(zhì)量評價臨床細菌學實驗室室間質(zhì)量評價目的：了解本實