生物質(zhì)譜分析技術(shù)課件

1、生物質(zhì)譜分析技術(shù)主講： 胡 水 旺 南方醫(yī)科大學病生教研室 E-mail: QQ:493448858 第一部分系統(tǒng)生物學的發(fā)展生命科學研究的目標尋找生命活動的起源及奧秘，解釋及探索生命活動的一般規(guī)律，改善人類生活質(zhì)量，延長人類壽命對生命的認識過程1.生命是神造的、上帝造（By God）等；2.生命是活力（Activity）；3.生命是機器（Machine）；4.生命是信息（Information）。系統(tǒng)生物學的定義 系統(tǒng)生物學（systems biology），是在細胞、組織、器官和生物體整體水平多層次、多系統(tǒng)研究各種分子（DNA、mRNA、蛋白質(zhì)、糖類、脂類等）的結(jié)構(gòu)、功能及其相互作用，用計

2、算生物學方法整合各組學數(shù)據(jù)來定量描述和預測它們的生物功能、表型和行為的科學。 系統(tǒng)生物學不同于以往的實驗生物學，僅關心個別的基因和蛋白質(zhì)，它要研究所有的基因、所有的蛋白質(zhì)、組分間的所有相互關系。還原論vs整合論傳統(tǒng)生物學是還原論 (reductionism) 的觀點 還原論假設一個復雜的系統(tǒng)可以分割為許多不會互相干擾的子系統(tǒng)，因此只要將子系統(tǒng)研究清楚，就能了解復雜系統(tǒng)的行為。 系統(tǒng)生物學是整合論(synthesis)的觀點 面對子系統(tǒng)不獨立的可能性，希望尋找新 的方法來解決子系統(tǒng)間交互作用的問題。組學實驗理論計算基因組轉(zhuǎn)錄組蛋白質(zhì)組相互作用組代謝組表型組數(shù)據(jù)整合模型構(gòu)建系統(tǒng)干涉合成生物學系統(tǒng)生

3、物學研究的兩大技術(shù)方法：組學實驗和理論計算系統(tǒng)生物學應用舉例 應用系統(tǒng)生物學的方法可以預測藥物的作用機制、病人對藥物的應答，包括毒副作用和療效等。 例如，美國紐約基因網(wǎng)絡科學公司（Gene Network Sciences）構(gòu)建了一種人類癌細胞模型，該模型內(nèi)含有500多種基因和蛋白質(zhì)，可將以前分別孤立研究的生物過程聯(lián)系在一起，利用該生物網(wǎng)絡模型，能夠更好地理解細胞的生物學行為。第二部分 蛋白質(zhì)組學的興起解析疾病機制手段的改進:DNA Protein 蛋白質(zhì)表達調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控翻譯水平調(diào)控翻譯后水平調(diào)控 蛋白質(zhì)存在復雜的翻譯后修飾，作為生命功能的行使者，它比基因更能直接地反映生理過程及其變化。

4、蛋白質(zhì)相互作用及空間構(gòu)向等問題是生命現(xiàn)象復雜性的真實體現(xiàn)。蛋白質(zhì)研究的復雜性蛋白質(zhì)研究的復雜性細胞周期信號轉(zhuǎn)導圖傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)研究方法中存在的問題1.生命現(xiàn)象的發(fā)生往往是多因素的，必然涉及到多個蛋白質(zhì)。2.多個蛋白質(zhì)的參與是交織成網(wǎng)絡的，或平行發(fā)生，或呈級聯(lián)因果關系。3.在執(zhí)行生理功能時蛋白質(zhì)的表現(xiàn)是多樣的、動態(tài)的，并不像基因組那樣基本固定不變。 隨著人類基因組計劃重點由結(jié)構(gòu)基因組到功能基因組的轉(zhuǎn)移，生命科學開始進入后基因組時代。 研究基因終產(chǎn)物及生命活動直接功能執(zhí)行者蛋白質(zhì)的科學-蛋白質(zhì)組學（Proteomics）應運而生。 蛋白質(zhì)組最早是由澳大利亞Macquarie 大學的Wilkins和

5、Williams在1994年的意大利舉辦的雙向電泳會議上首次提出來的。 Proteome一詞由“蛋白質(zhì)（PROTEin）”與“基因組（genOME）”雜合而成，對于“基因組學（Genomics）”,“蛋白質(zhì)組學”定義為一個基因組所表達的全套蛋白質(zhì)。由Proteome進一步派生出Proteomics。2001年，Science雜志把蛋白質(zhì)組學列為21世紀六大研究熱點之一。2003年4月14日，科學家宣布人類基因組計劃已經(jīng)順利完成，99%的人類遺傳密碼被破譯，人類基因組圖譜提前2年完成。蛋白質(zhì)組學被進一步提上日程。 蛋白質(zhì)組學(Proteomics) ：是通過大規(guī)模研究蛋白質(zhì)的表達水平的變化、翻譯

6、后修飾、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用，以獲取蛋白質(zhì)水平上疾病變化、細胞進程及蛋白質(zhì)網(wǎng)絡相互作用的整體綜合信息的科學研究。 疾病蛋白質(zhì)組學：蛋白質(zhì)組學用于研究疾病發(fā)病機制便發(fā)展為疾病蛋白質(zhì)組學。蛋白質(zhì)組學定義 蛋白質(zhì)組學的研究的機遇和挑戰(zhàn)： 機遇：基因組計劃的快速進行，大量基因序列和EST的確定為蛋白質(zhì)的快速鑒定提供了良好的基礎。 挑戰(zhàn)：從單一蛋白質(zhì)的研究轉(zhuǎn)變到細胞和組織的整體蛋白質(zhì)研究，在理論和技術(shù)上提出了挑戰(zhàn)。 蛋白質(zhì)研究技術(shù)的革命：蛋白質(zhì)組學蛋白質(zhì)組學常用的兩大技術(shù)平臺第三部分生物質(zhì)譜技術(shù)的原理及應用質(zhì)譜技術(shù)特點質(zhì)譜儀是一個用來測量單個分子質(zhì)量的儀器，實際上質(zhì)譜儀提供的是分子的質(zhì)量與電荷比

7、(m/z or m/e).質(zhì)譜法是一強有力的分析技術(shù)。它可用于未知化合物的鑒定、定量分析、分子結(jié)構(gòu)及化學特性的確定等方面；所需化合物的量非常低：10-12g, 或10-15 mole；應用范圍廣: (1) 有機質(zhì)譜法：生物、醫(yī)藥、聚合物、法醫(yī)和環(huán)境等方面；(2) 無機質(zhì)譜法： 地球化學，地質(zhì)礦產(chǎn)和無機元素分析鑒定等方面。質(zhì)譜分析原理 質(zhì)譜分析法是通過對被測樣品離子的質(zhì)荷比的測定來進行分析的一種分析方法。被分析的樣品首先要離子化，然后利用不同離子在電場或磁場的運動行為的不同，把離子按質(zhì)荷比（m/z）分開而得到質(zhì)量圖譜，通過樣品的質(zhì)量圖譜和相關信息，可以得到樣品的定性定量結(jié)果。質(zhì)譜發(fā)展史1911年

8、:世界第一臺質(zhì)譜裝置（J.J.Thomson） 40年代: 用于同位素測定和無機元素分析50年代：開始有機物分析（分析石油）60年代：研究GC-MS聯(lián)用技術(shù)70年代：計算機引入生物質(zhì)譜的發(fā)展80年代：快原子轟擊電離，基質(zhì)輔助激光解吸電離，電噴霧電離，大氣壓化學電離 質(zhì)譜技術(shù)因解決科學前沿難題屢次獲得諾貝爾獎：1.1906年，Thompson .J.J（發(fā)明質(zhì)譜技術(shù)）；2.1922年，Aston F.W（利用質(zhì)譜儀發(fā)現(xiàn)非放射性同位素）；3.1980年，Paul W.（發(fā)明離子阱原理與技術(shù)）；4.1996年，Curl R.F/Sroalley R.E.等（用質(zhì)譜儀觀測到激光轟擊下產(chǎn)生的碳60）；

9、2002年美國科學家約翰.芬恩與日本科學家田中耕一由于發(fā)明了對生物大分子的質(zhì)譜分析方法而獲得了諾貝爾化學獎。因為該方法解決了生物大分子“是什么”的問題。質(zhì)譜儀的示意圖數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)離子檢測器質(zhì)量分析器離子源蛋白質(zhì)產(chǎn)生離子按離子的質(zhì)量與電荷比分離離子離子轉(zhuǎn)換成電信號控制整個質(zhì)譜儀高斯狀峰棒狀峰質(zhì)譜工作流程進樣系統(tǒng)離子源質(zhì)量分析器離子檢測器1.加熱進樣2.直接進樣1.單聚焦 2.雙聚焦 3.飛行時間4.四極桿 1.電子轟擊 2.化學電離 3.場致電離 4.激光 5.快原子轟擊質(zhì)譜的構(gòu)造進樣系統(tǒng)：按電離方式的需要，將樣品送入 離子源的適當部位，分為加熱進樣和直接進樣。離子源：用來使樣品分子電離生成離子

10、 質(zhì)量分析器：利用電磁場的作用將來自離子源的離子束中不同質(zhì)荷比的離子按空間位置，時間先后或運動軌道穩(wěn)定與否等形式進行分離 離子檢測器：用來接受、檢測和記錄被分離后的離子信號 進樣系統(tǒng)氣體進樣液體進樣 固體進樣 離子源電子轟擊電離（EI）化學電離（CI） 快原子轟擊（FAB） 電噴霧電離（ESI）基質(zhì)輔助激光解吸電離（MALDI） 表面增強激光解吸電離(SELDI)技術(shù)1).電子轟擊(Electron impact, EI)電離 M + e- M+. + 2e-Fi+ , i=1, 2, 3, .電子束氣體分子離子束2). 化學電離(chemical ionization, CI) 正離子模式：

11、GH+ + M M + H+ + G負離子模式：G-H- + M M - H- + G G: 離子化的試劑氣體分子, CH4, NH3 等M: 被分析物電子束氣體分子試劑分子離子束3). 快原子轟擊(Fast atom bombardment, FAB)離子化技術(shù)-可分析分子量達數(shù)千的多肽, 極性分子.4). 電噴霧離子化(Electrospray ionization, ESI)技術(shù)a). 常規(guī)電噴霧源(mL/min)b). 微升噴霧源 (L/min)c). 毫微噴霧源( nL/min)Drying gasNebulizer gas 電噴霧離子化（Electrospray Ionizsati

12、on，ESI）是在毛細管的出口處施加一高電壓，所產(chǎn)生的高電場使從毛細管流出的液體霧化成細小的帶電液滴，隨著溶劑蒸發(fā)，液滴表面的電荷強度逐漸增大，最后液滴崩解為大量帶一個或多個電荷的離子，致使分析物以單電荷或多電荷離子的形式進入氣相。電噴霧離子化的特點是產(chǎn)生高電荷離子而不是碎片離子，使質(zhì)量電荷比（m/z）降低到多數(shù)質(zhì)量分析儀器都可以檢測的范圍，因而大大擴展了分子量的分析范圍，離子的真實分子質(zhì)量也可以根據(jù)質(zhì)荷比及電荷數(shù)算出 可以方便地與多種分離技術(shù)聯(lián)合使用，如液質(zhì)聯(lián)用（LCMS）是將液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)合而達到檢測大分子物質(zhì)的目的。5). 基質(zhì)輔助激光解吸電離技術(shù)(Matrix-assisted la

13、ser desorption/ionization, MALDI)離子化過程MALDI的原理是用激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量傳遞給生物分子，而電離過程中將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到生物分子或從生物分子得到質(zhì)子，而使生物分子電離的過程。因此它是一種軟電離技術(shù)，適用于混合物及生物大分子的測定 MALDI Matrix 應具有的特性 能夠嵌入樣品分子間并能起到隔離樣品分子之間的相互作用(如形成共結(jié)晶);能溶解于可溶解樣品分子的溶劑;在真空狀態(tài)下是穩(wěn)定的;可吸收激光,既與激光形成共振吸收;可激發(fā)樣品分子離子化. 樣品引入方式：直接進樣 優(yōu)點： a). 快速獲得分子量的信息; b). 快速獲

14、得混合肽的肽譜.缺點: a). 金屬離子干擾, Na, K； b). 離子源結(jié)構(gòu)復雜,； c). 沒有LC/MALDI 接口； d). 實現(xiàn)MS/MS 困難 e). 需要基質(zhì)質(zhì)量范圍: 分子量小于500,000 Da6). 表面增強激光解吸電離(Surface-enhanced laser desorption/ionization, SELDI)技術(shù)adding the protein sample, washing, adding the energy adsorbing molecule (EAM) 質(zhì)量分析器磁分析器四極桿質(zhì)量分析器 (Quadrupole analyzer)離子阱質(zhì)量

15、分析器 (Ion trap analyzer)飛行時間質(zhì)量分析器(Time of flight analyzer) 傅立葉變換離子回旋共振分析器 （Fourier transform ion cyclotron resonance analyzer ） 1). 磁質(zhì)譜儀 (magnetic-sector mass spectrometer)經(jīng)典質(zhì)量分析器：帶電粒子在磁場中運動受到洛倫茲力的作用m: 離子的質(zhì)量z: 離子所帶電量V: 離子飛行速度B: 磁場強度r MSMS/MS空間串聯(lián)質(zhì)譜儀優(yōu)點：a). 高重現(xiàn)性(穩(wěn)定性); b). 最好定性分析工具; c). 可以實現(xiàn)高分辨; d). 高靈敏度

16、; e). 寬的動態(tài)范圍; f). 可以實現(xiàn)多級質(zhì)譜的串聯(lián); g). 高能collision-induced dissociation (CID) 譜重現(xiàn)性好. 缺點: a). 不能較好的與脈沖離子化技術(shù)聯(lián)用(如: MALDI); b). 造價高, 體積大; c). 聯(lián)動掃描MS/MS譜的分辨率低.應用: a). 所有的有機質(zhì)譜分析方法; b). 精確質(zhì)量測量; c). 定量分析; d). 同位素豐度比的測量.2). 四極質(zhì)量過濾器質(zhì)譜儀(quadrupole mass filter mass spectrometer)quadrupoleMathieu 方程四級桿質(zhì)量分析器 四極桿分析器由四

17、根棒狀電極組成。電極材料是鍍金陶瓷或鉬合金。相對兩根電極間加有電壓（Vdc+Vrf），另外兩根電極間加有-（Vdc+Vrf）。其中Vdc為直流電壓，Vrf為射頻電壓。四個棒狀電極形成一個四極電場。通過改變掃描電壓讓不同質(zhì)荷比的離子分離開。 優(yōu)點: a). 可獲得經(jīng)典的質(zhì)譜圖; b). 重現(xiàn)性好; c). 以其體積較小, 造價較低; d). 在三級四極桿串聯(lián)質(zhì)譜分析器上或四極桿分析器與磁質(zhì)譜(飛行時間)分析器組成的混合串聯(lián)分析器上可獲得低能CID譜;缺點: a). 峰強度與峰的質(zhì)荷比有關; b). 分辨率低; c). 不能較好地與脈沖離子化技術(shù)結(jié)合(如:MALDI); d). collision

18、-induced dissociation (CID) MS/MS spectra 與collision energy, collision gas, pressure 有關. 應用: a). 多數(shù)臺式質(zhì)譜儀, GC/MS 和 LC/MS 系統(tǒng); b). 串聯(lián)三級四極桿質(zhì)譜儀,MS/MS; c). 磁分析器與四極桿分析器組成混合型串聯(lián)質(zhì)譜儀,MS/MS. 3). 離子阱質(zhì)譜儀 (Ion trap mass spectrometer )離子阱質(zhì)量分析器 離子阱的主體是一個環(huán)電極和上下兩端蓋電極，環(huán)電極和上下兩端蓋電極都是繞Z軸旋轉(zhuǎn)的雙曲面，并滿足r0 2=2Z02（ r0 為環(huán)形電極的最小半徑，

19、Z0為兩個端蓋電極間的最短距離）。直流電壓U和射頻電壓Vrf加在環(huán)電極和端蓋電極之間，兩端蓋電極都處于地電位。 簡單說：用高頻交流電把離子限制在離子阱里，然后用離子的特征電壓分別將其推出離子阱，到檢測器檢測。 優(yōu)點：a). 可以實現(xiàn)多級串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)； b). 結(jié)構(gòu)緊湊。缺點：a). 動態(tài)范圍窄，不適合用于定量分析； b). 存在空間電荷效應和離子-分子反應； c). CID過程中的碰撞能量大小不能確定； d). 多個儀器參數(shù)影響質(zhì)譜中離子的分布， 如：活化能、捕獲時間、檢測器條件等。應用: a). 臺式的GC/MS, LC/MS/MS; b). 目標化合物的篩選; c). 氣相離子化學研究.

20、d). 肽序列測定4).傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀(Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometer, FTICR MS )優(yōu)點: a). 是目前分辨率最高的質(zhì)譜儀, 1000,000; b). 可實現(xiàn)多級串聯(lián)質(zhì)譜分析, msn; c). 可以與脈沖離子化電離技術(shù)聯(lián)用, 如:MALDI; d). 是目前蛋白質(zhì)和肽測序中頂端質(zhì)譜儀; e). 質(zhì)量穩(wěn)定性好;f). 可實現(xiàn)氣相離子-分子反應.缺點: a). 有限的動態(tài)范圍; b). 存在空間電荷效應和離子-分子反應; c). 存在Artifact 峰; d). 多個儀器參數(shù)影響

21、質(zhì)譜圖的分布, 如: 活化能, 捕獲時間, 檢測條件等; e). CID譜與碰撞能，碰撞氣及其他儀器參數(shù)有關應用:a). 生物大分子的分析；b). 有機小分子分析； c). 離子化學研究； e). 可以和各種電離技術(shù)聯(lián)用。5). 飛行時間質(zhì)譜儀(Time-of-flight mass spectrometer)m為離子的質(zhì)量，q為離子所帶的電荷，L為離子飛行的距離，v為離子的飛行速度，V為離子的加速電壓，z為離子所帶的電荷數(shù)，e微電子的電量。優(yōu)點:可獲得高分辨質(zhì)譜；可實現(xiàn)快速的離子傳輸；可以較好地與脈沖離子化電離技術(shù)聯(lián)用，如：MALDI等；高的離子傳輸效率；利用post-source deca

22、y (PSD) 技術(shù)可以快速實現(xiàn)MS/MS技術(shù)；具有較寬的質(zhì)量范圍;利用ToF-ToF可以實現(xiàn)MS/MS.缺點:需要以脈沖開關；需要快速數(shù)字轉(zhuǎn)換器;有限的動態(tài)范圍.應用：MALDI-ToF；GC/EI(CI)-ToF ;可用于有機化合物的分析；生物大分子的分析；肽譜離子檢測器 質(zhì)譜儀的檢測主要使用電子倍增器，也有的使用光電倍增管。由質(zhì)量分析器出來的離子打到高能電極產(chǎn)生電子，電子經(jīng)電子倍增器產(chǎn)生電信號，記錄不同離子的信號即得質(zhì)譜。信號增益與倍增器電壓有關，提高倍增器電壓可以提高靈敏度，但同時會降低倍增器的壽命，因此，應該在保證儀器靈敏度的情況下采用盡量低的倍增器電壓。由倍增器出來的電信號被送入計

23、算機儲存，這些信號經(jīng)計算機處理后可以得到色譜圖，質(zhì)譜圖及其它各種信息。 質(zhì)譜性能指標靈敏度(sensitivity)分辨率(resolution)質(zhì)量范圍(mass range)質(zhì)量穩(wěn)定性 (mass stability)靈敏度在一定的分辨率下，產(chǎn)生一定信噪比（S/N）的分子離子峰所需的樣品量在質(zhì)譜分析中，儀器出現(xiàn)峰（信號）的強度E應與物質(zhì)的量或濃度C成線性關系：E= SC ， 比例系數(shù)S稱為靈敏度S=E/C 分辨率質(zhì)譜儀的分辨率表示質(zhì)譜儀把相鄰兩個質(zhì)量分開的能力，常用R表示。兩種定義方式：雙峰法和單峰法雙峰法如果某質(zhì)譜儀在質(zhì)量M處剛剛能分開M和M+M兩個質(zhì)量的離子。則該質(zhì)譜儀的分辨率為R=M

24、/M所謂兩峰剛剛分開，一般是指兩峰間的“峰谷”是峰高的10%（每個峰提供5%） 單峰法如果質(zhì)量為M的質(zhì)譜峰其峰高50%處的峰寬（半峰寬）為M。則分辨率為R=M/M，這后一種表示方法測量時比較方便。目前，F(xiàn)T-MS和TOF-MS采用這種分辨率表示方式。 質(zhì)量范圍質(zhì)量范圍是質(zhì)譜儀所能測定的離子質(zhì)荷比的范圍。 對于MALDI離子源，電離得到的離子為單電荷離子，質(zhì)量范圍實際上就是可以測定的分子量范圍；對于ESI離子源，由于形成的離子帶有多電荷，盡管質(zhì)量范圍只有幾千，但可以測定的分子量可達10萬以上。 質(zhì)量穩(wěn)定性質(zhì)量穩(wěn)定性主要是指儀器在工作時質(zhì)量穩(wěn)定的情況，通常用一定時間內(nèi)質(zhì)量漂移的質(zhì)量單位來表示。 生

25、物質(zhì)譜種類按離子源的類型：電噴霧質(zhì)譜和MALDI質(zhì)譜按質(zhì)量分析器類型：四級桿質(zhì)譜；飛行時間質(zhì)譜；離子阱質(zhì)譜；FTICR質(zhì)譜等串聯(lián)質(zhì)譜Q-Q-QTOF/TOF Q-TOFQ-Trap串聯(lián)質(zhì)譜的優(yōu)勢利用軟電離技術(shù)（如電噴霧和快原子轟擊）作為離子源時，所得到的質(zhì)譜主要是準分子離子峰，碎片離子很少，因而也就沒有結(jié)構(gòu)信息。為了得到更多的信息，最好的辦法是把準分子離子“打碎”之后測定其碎片離子。De novo 測序的主體思想裂解方式碰撞誘導分解（Collision Induced dissociation，CID ）源后衰減（Post source decay，PSD ）碰撞誘導分解（CID）碰撞誘導分解在碰撞室內(nèi)進行，帶有一定能量的離子進入碰撞室后，與室內(nèi)惰性氣體的分子或原子（也可以是空氣）發(fā)生碰撞，離子發(fā)生碎裂。源后衰減（PSD）離子在飛行過程中如果發(fā)生裂解，新產(chǎn)生的離子仍然以母離子速度飛行。因此在直線型漂移管中觀測不到新生成的離子。如果采用帶有反射器的漂移管，因為新生成的離子與其母離子動能不同，可在反射器中被分開。MALDI TOF/TOF 4800Pulsed laser2. Target is