PCR技術(shù)介紹和常用方法

1、PCR 技術(shù)介紹和常用方法PCR技術(shù)介紹和常用方法 PCR(Polymerase Chain Reaction)Three steps: denaturation, primer annealing, polymerization.PCR技術(shù)介紹和常用方法The PCR cycle95C step to denature the duplex DNA,An annealing step of around 55C to allow the primers to bind,72C polymerization step.Mg2+,dNTPs are required in addition to

2、 template,primers,buffer and enzymePCR技術(shù)介紹和常用方法歷史60s-70s：基因的體外分離技術(shù)。Khorana（1971）：美國(guó)MIT教授、1968年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)得主 “經(jīng)過(guò)DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過(guò)程便可克隆tRNA基因”。核酸體外擴(kuò)增最早設(shè)想遺忘: 當(dāng)時(shí)很難進(jìn)行測(cè)序和合成寡核苷酸引物； 當(dāng)時(shí)(1970)Smith等發(fā)現(xiàn)了內(nèi)切酶，體外克隆基因成為可能PCR技術(shù)介紹和常用方法Kary Mullis(1985)發(fā)明過(guò)程 Mullis 在“偶然想出的聚合酶鏈反應(yīng)”一文中寫到: “這種簡(jiǎn)單得令人驚奇，可以無(wú)限量地拷貝DNA

3、片段的方法是在不可想象的情況下，即駕車行駛在月色下的加利福尼亞山間公路上時(shí)想出來(lái)的”。發(fā)展過(guò)程： 開(kāi)始使用大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片段，該酶不耐熱，每次加熱變性DNA后都要重新補(bǔ)加。耗時(shí)、費(fèi)力、易出錯(cuò)。耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得自動(dòng)化。PCR技術(shù)介紹和常用方法專利官司1987年美國(guó)專利局專利授權(quán)1989年，DuPont異議，大小公司對(duì)簿公堂，將決定誰(shuí)將獲得諾貝爾獎(jiǎng)。DuPont理由是，1971年P(guān)CR的雛形已由Khorana一系列文章闡明，并公布于眾，應(yīng)當(dāng)是公共產(chǎn)權(quán)。斯坦福大學(xué)Kornberg（研究DNA聚合酶獲諾貝爾獎(jiǎng)）也認(rèn)為，任何具備生物技術(shù)知識(shí)的人都可以從Khorana等的文章中

4、推知如何操作PCR。美國(guó)專利局駁回DuPont異議，地方法院判屬CetusCetus獲勝后馬上反訴，指出DuPont已侵犯另一項(xiàng)與PCR有關(guān)的專利并要求對(duì)方賠償以及不再銷售與PCR有關(guān)試劑和儀器PCR技術(shù)介紹和常用方法PCR發(fā)展速度驚人，沒(méi)有一種技術(shù)能與之相比引用論文最多、應(yīng)用范圍十分廣泛1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)：Mullis，與開(kāi)創(chuàng)了“寡核苷酸基因定點(diǎn)誘變”加拿大籍英國(guó)科學(xué)家Michael Smith共獲 PCR技術(shù)介紹和常用方法原理 類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制。首先待擴(kuò)增DNA模板加熱變性解鏈，隨之將反應(yīng)混合物冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生退火，再將溫度升高使退火引物在DNA

5、聚合酶作用下得以延伸。這種熱變性-復(fù)性-延伸的過(guò)程就是一個(gè)PCR循環(huán)，PCR就是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)。PCR技術(shù)介紹和常用方法procedurestemplate(DNA or RNA),primers,Taq enzyme,10PCR buffer,Mg+,5mmol/L dNTPspre-denaturation-denature completelyDenaturationannealingElongationcycles:25-30PCR技術(shù)介紹和常用方法Primer designMost imp.(1)length: 2030bp(2)G+C contents:ATCG

6、random distributed(3)primers : no complementary sequence(4)3end of the primer: no modification(5)5end of the primer:product length，can be modified(6) specificity:less than 70% homology with non-specific amplification sequence, or 8bpcontinuous complementary basePCR技術(shù)介紹和常用方法Primer designed with the h

7、elp of computerDNA databaseconservative region comparisionprimers or blast PCR技術(shù)介紹和常用方法PCR reaction components and their functionstemplate：ssDNA, dsDNA mRNA needed to be RT as cDNAsamples：from blood,sperm or any other tissue,from older forensic specimens, from ancient biological samples or in the la

8、b. From bacterial colonies or phage plaques.DNA：very stablePCR技術(shù)介紹和常用方法primesIf the PCR product is to be cloned, it is sensible to include the sequence of unique restriction enzyme sites within the 5-ends of the primers.Can amplify fragments over 10kb in lengthStore:純化引物在25乙腈溶液中4；凍干引物于-20可保存1-2年，液體狀

9、態(tài)于-20可保存6個(gè)月。不用時(shí)應(yīng)-20保存。PCR技術(shù)介紹和常用方法buffer10-50mmol/L Tris-HCl(pH8.3-8.8, 20)。Mg2+：for Taq polymerase activityconc.:Low:low activity high: non-specific amplificationdNTPs：貯備dNTP液：1 mol/L NaOH 調(diào)pH至中性。貯備濃度為5-10mmol/L，終濃度為20-200umol/L，分裝-20保存。4種dNTP濃度應(yīng)相同。PCR技術(shù)介紹和常用方法Taq DNA polymerase：from thermophilic b

10、acteria. Taq polymerase from Thermus aquaticus.other thermostable DNA polymerase with greater accuracy used for certain applications.mineral oilPCR技術(shù)介紹和常用方法Selection for DNA polymeraseKlenow酶早期采用該酶不耐熱，缺點(diǎn)有溫度要求低(37)，受熱即失活；產(chǎn)物特異性不高；積累大量的失活殘酶，使反應(yīng)產(chǎn)物純度大大降低；擴(kuò)增的最長(zhǎng)序列約400bp（Taq酶則能擴(kuò)增10kb）PCR技術(shù)介紹和常用方法thermostabl

11、e DNA polymerasesTaq DNA polymeraseTth DNA polymerasefrom VENT DNA polymerasefrom Sac polymerasepfu polymerasePCR技術(shù)介紹和常用方法Taq DNA聚合酶分離:1969年，美國(guó)黃石國(guó)家公園溫泉分子量:94KDa活性：在幾種水生棲熱菌中活性最高，200 000U/mgPCR技術(shù)介紹和常用方法Taq DNA聚合酶離子需要：對(duì)Mg2+、單價(jià)離子性質(zhì)和濃度較 敏感。最適濃度為50mmol/L。忠實(shí)性:沒(méi)有校正單核苷酸錯(cuò)配功能-致命弱點(diǎn)。一般出錯(cuò)率為210-4核苷酸/每輪循環(huán)，利用PCR克隆、測(cè)

12、序時(shí)尤應(yīng)注意。PCR技術(shù)介紹和常用方法Taq DNA聚合酶抑制劑:尿素、乙醇、DMSO、DMF、甲酰胺、SDS及許多其他化學(xué)藥劑。內(nèi)源DNA:不同來(lái)源的酶可能由于制備過(guò)程中殘留的原細(xì)菌DNA或PCR產(chǎn)物的污染而含有不明來(lái)源的DNA。在使用擴(kuò)增保守序列的通用引物時(shí)，會(huì)在無(wú)模板對(duì)照管出現(xiàn)擴(kuò)增帶。保存:在-20至少6個(gè)月。PCR技術(shù)介紹和常用方法PCR optimization變性溫度和時(shí)間92-95，富含G和C的序列，可適當(dāng)提高，但過(guò)高或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)都會(huì)導(dǎo)致酶活性損失。退火溫度與時(shí)間引物中G、C含量高、長(zhǎng)度長(zhǎng)并與模板完全配對(duì)時(shí)，應(yīng)提高溫度。溫度越高，產(chǎn)物特異性越高。通常37-55、1-2分鐘。延伸溫度

13、和時(shí)間溫度：72，接近Taq酶的最適75時(shí)間：過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物非特異性增加。但對(duì)低濃度的目的序列，則可適當(dāng)增加時(shí)間。循環(huán)次數(shù)循環(huán)過(guò)多，非特異性產(chǎn)物大量增加PCR技術(shù)介紹和常用方法PCR污染及其對(duì)策強(qiáng)大擴(kuò)增能力+檢測(cè)的敏感性極微量的污染便可導(dǎo)致假陽(yáng)性污染源的追蹤點(diǎn)樣器和加樣器;離心機(jī);微解剖刀;濃縮用具、真空瓶;電泳裝置;紫外燈箱;乙醇或水浴鍋;冰箱門把手、實(shí)驗(yàn)臺(tái)面等PCR技術(shù)介紹和常用方法污染的預(yù)防隔離不同操作區(qū) 分裝試劑 改進(jìn)實(shí)驗(yàn)操作 專用加樣器(5)結(jié)果的重演PCR技術(shù)介紹和常用方法PCR技術(shù)的應(yīng)用PCR技術(shù)介紹和常用方法遺傳性疾病地中海貧血的基因診斷血友病苯丙酮尿癥PCR技術(shù)介紹和常用方法

14、傳染性疾病肝炎性病腫瘤PCR技術(shù)介紹和常用方法法醫(yī)學(xué)個(gè)人識(shí)別、親子鑒定1985年，英國(guó)遺傳學(xué)家Jeffreys采用DNA指紋圖譜進(jìn)行個(gè)人識(shí)別和親子鑒定。有時(shí)犯罪物證量很少，不足以用來(lái)進(jìn)行DNA指紋分析，PCR有效解決這些問(wèn)題。對(duì)于犯罪現(xiàn)場(chǎng)中遺留的少量生物物證，如一根毛發(fā)、一滴血等都可用于分析，在法醫(yī)學(xué)上認(rèn)證罪犯、親子鑒定以及人的性別鑒定中PCR技術(shù)被普遍采用。PCR技術(shù)介紹和常用方法植物遺傳育種構(gòu)建遺傳圖譜、分離目的基因、 基因定位分子標(biāo)記輔助育種了解不同品種間的親緣關(guān)系、系統(tǒng)進(jìn)化PCR技術(shù)介紹和常用方法畜 牧畜禽病診斷:豬偽狂犬病毒、豬口蹄疫病毒、豬瘟病毒、牛白血病毒、牛病毒、性腹瀉病毒、免

15、疫缺陷病毒等檢測(cè)性別鑒定：牛、綿羊Y染色體上特異 DNA片段構(gòu)建基因圖譜檢測(cè)基因整合與表達(dá)：轉(zhuǎn)基因魚PCR技術(shù)介紹和常用方法其他考古學(xué)植物分類學(xué)群體生態(tài)學(xué)PCR技術(shù)介紹和常用方法 DNA芯片技術(shù)第一小節(jié) 概 述一、DNA芯片技術(shù)的概念 DNA芯片技術(shù)是指在固相支持物上原位合成（in situ synthesis）寡核苷酸探針，或者直接將大量的DNA探針以顯微打印的方式有序的固化于支持物表面，然后與標(biāo)記的樣品雜交，通過(guò)對(duì)雜交信號(hào)的檢測(cè)分析即可得出樣品的遺傳信息（基因序列及表達(dá)的信息）。由于常用計(jì)算機(jī)硅芯片作為固相支持物，所以稱為DNA芯片。DNA芯片又被稱為基因芯片（gene chips）、DN

16、A陣列（DNA array）、cDNA芯片（cDNA chips）、寡核苷酸陣列（oligonucleotide array）等。PCR技術(shù)介紹和常用方法二、DNA芯片的主要類型及其特點(diǎn)。 根據(jù)DNA芯片的制備方式可以將其分為兩大類： 原位合成芯片（synthetic gene chip） 采用顯微光蝕刻等技術(shù)在芯片的特定部位原位合成寡核苷酸而制成的芯片稱為原位合成芯片。這種芯片的集成度教高，可達(dá)10萬(wàn)40萬(wàn)點(diǎn)陣/平方厘米。但合成的寡核苷酸探針長(zhǎng)度較短，一般為820個(gè)核苷酸殘基（nucleotide，nt），最長(zhǎng)為50nt，因此需要使用多個(gè)相互重疊的探針片進(jìn)行檢測(cè)，才能對(duì)基因進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定。

17、DNA微集芯片（DNA microchips） 將預(yù)先制備的DNA片段以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面而制成的芯片稱為DNA微集芯片，又稱為DNA微集陳列（DNA microarray）。這類芯片集成度相對(duì)較低，可達(dá)1萬(wàn)10萬(wàn)點(diǎn)陣/平方厘米，但使用的探針組的來(lái)源比較靈活，可以是合成的寡核苷酸短片段，也可以是采用來(lái)自基因組的較長(zhǎng)的DNA片段；可以是雙鏈，也可以采用單鏈的DNA或RNA片段，且技術(shù)實(shí)現(xiàn)未受到嚴(yán)格的專利控制，因而近年來(lái)發(fā)展很快。探針的長(zhǎng)度可達(dá)100500nt。PCR技術(shù)介紹和常用方法第二節(jié) DNA芯片技術(shù)的基本原理與方法一、芯片的制備 芯片制備的基本原理。 芯片的制備包括支持物

18、的預(yù)處理、原位合成芯片的準(zhǔn)備和DNA微集陳列的制備三個(gè)方面。 1.支持物的預(yù)處理 目前用于DNA芯片制作的固相支持物大致可分為兩類：實(shí)性材料和膜性材料。實(shí)性材料包括硅芯片、玻片和瓷片等。膜性材料有聚丙烯膜、尼龍膜、硝酸纖維素膜等。實(shí)性材料需要進(jìn)行預(yù)處理，使其表面衍生出羥基、氨基等活性基團(tuán)。在合成寡核苷酸前，這些基因可與光敏材料的光敏保護(hù)基團(tuán)形成共價(jià)交聯(lián)而被保護(hù)起來(lái)，合成時(shí)在光照下除去光敏保護(hù)基團(tuán)，該活性基團(tuán)又可以和活化的單核苷酸發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。另一方面，這些活性基團(tuán)可與DNA分子中的羥基等基團(tuán)形成共價(jià)結(jié)合而使打印在上面的DNA牢固地固化在支持物表面。而膜性材料通常需要包被氨基硅烷或多聚賴氨酸等，

19、使其帶上正電荷吸附帶負(fù)電荷的DNA探針。PCR技術(shù)介紹和常用方法 2.原位合成芯片的制備 原位合成芯片是采用顯微光蝕刻（photolithography）技術(shù)或壓電打?。╬iezoelectric printing）技術(shù)，在芯片的特定區(qū)域原位合成寡核苷酸而制成。顯微光蝕刻技術(shù)也稱為光引導(dǎo)聚合技術(shù)（light-directed synthesis），它不僅可用于寡核苷酸的合成，也可用于合成寡肽分子。它是照相平板印刷技術(shù)（photolithography）與傳統(tǒng)的核酸，多肽固相合成技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，是原位合成芯片的主要方法。壓電打印法的裝置與普通的彩色噴墨打印機(jī)相似，所用的技術(shù)也是常規(guī)的固相合成方

20、法。 微集陳列的制備 DNA微集陳列的制備采用的是預(yù)先合成DNA或制備基因探針然后打印到芯片上的方式。PCR技術(shù)介紹和常用方法二、樣品的準(zhǔn)備 樣品的準(zhǔn)備包括樣品的分離純化、擴(kuò)增和標(biāo)記等過(guò)程。 1樣品的分離純化 主要從活組織或血液中獲得DNA或mRNA，這個(gè)過(guò)程包括細(xì)胞分離，破裂，去蛋白，提取及純化核酸的過(guò)程。 2樣品的擴(kuò)增 測(cè)定時(shí)往往需要較多的樣品分子，因此對(duì)于分離獲得的基因組DNA通過(guò)PCR技術(shù)直接擴(kuò)增，對(duì)于mRNA則需要逆轉(zhuǎn)錄，制備cDNA。 3.樣品的標(biāo)記 標(biāo)記物主要有熒光分子（cy3、cy5）、生物素以及放射性同位素等。帶有標(biāo)記的dNTP（cy3或cy5-dNTP、32P-dNTP、生

21、物素-dNTP）通過(guò)DNA或cDNA擴(kuò)增的過(guò)程，摻入靶分子序列。也可以在制備引物時(shí)，摻入標(biāo)記的核苷酸，擴(kuò)增靶序列后，使擴(kuò)增產(chǎn)物末端帶有標(biāo)記物。膜性載體可以用于檢測(cè)同位素標(biāo)記的樣品。 樣品分子標(biāo)記的質(zhì)量影響芯片檢測(cè)的靈敏度，因此，核酸的提取，反轉(zhuǎn)錄以及標(biāo)記等各環(huán)節(jié)要求嚴(yán)格操作。熒光標(biāo)記分辨率高于同位素標(biāo)記，而且可以采用雙色，如對(duì)照樣品標(biāo)紅色，待檢樣品標(biāo)綠色，有助于結(jié)果分析與判斷。PCR技術(shù)介紹和常用方法 三、分子雜交 芯片雜交是應(yīng)用標(biāo)記的待測(cè)樣品（靶序列）與固定在載體表面的探針進(jìn)行的復(fù)雜過(guò)程。 依據(jù)探針長(zhǎng)度、類型以及不同的目的，確定溫度、鹽濃度與反應(yīng)時(shí)間。通常采用的條件是：42，50%甲酰胺，6

22、SSC，0.5%SDS，5Denhardt試劑。也可采用65，6SSC，0.5%SDS，5Denhardt試劑或者65，10%SDS，7%PEG-800。 雜交過(guò)程類似Northern或Southern雜交，如封閉液預(yù)雜交、雜交、清洗、干燥與檢測(cè)。 四、檢測(cè)分析 芯片雜交信號(hào)的檢測(cè)可應(yīng)用熒光檢測(cè)法、質(zhì)譜法、化學(xué)發(fā)光法、光導(dǎo)纖維法以及生物傳感器法。其中激光共聚焦熒光檢測(cè)法是最常應(yīng)用的方法：激光從芯片的背面切入，聚焦于芯片與靶溶液的相互作用面，與探針雜交的靶序列標(biāo)記物被激發(fā)產(chǎn)生熒光，經(jīng)過(guò)棱鏡聚焦而被檢測(cè)器檢測(cè)。樣品靶序列與探針嚴(yán)格配對(duì)雜交的分子發(fā)生強(qiáng)熒光信號(hào)，不完全雜交顯示較弱的信號(hào)。PCR技術(shù)介

23、紹和常用方法第三節(jié) DNA芯片技術(shù)的應(yīng)用 DNA芯片使用的基本流程。 DNA芯片使用包括待測(cè)樣品準(zhǔn)備、分子雜交和檢測(cè)分析3個(gè)步驟。 1.待測(cè)樣品的準(zhǔn)備 樣品的準(zhǔn)備包括樣品的分離純化、擴(kuò)增和標(biāo)記。 首先采用常規(guī)方法從組織細(xì)胞中分離純化樣品核酸、DNA或mRNA，由于目前芯片檢測(cè)儀器的靈敏度有限，要求對(duì)樣品中靶序列進(jìn)行高效而特異地?cái)U(kuò)增。樣品的標(biāo)記主要采用熒光法，也可以用生物素，放射性核素標(biāo)記法。 2.分子雜交 待測(cè)樣品經(jīng)擴(kuò)增和標(biāo)記處理后，即可與DNA芯片上的探針陳列進(jìn)行分子雜交。芯片雜交與傳統(tǒng)的Southern印跡等雜交方法類似，屬固-液雜交。探針?lè)肿庸潭ㄓ谛酒砻?，與位于液相的靶分子進(jìn)行反應(yīng)。芯

24、片雜交的特點(diǎn)是探針的量顯著大于靶基因片段，雜交動(dòng)力學(xué)呈線形關(guān)系。雜交信號(hào)的強(qiáng)弱與樣品中靶基因的量成正相關(guān)。 3.檢測(cè)分析 芯片雜交及清洗后，未雜交分子被清除，帶有熒光標(biāo)記的靶DNA（雜交分子）與其互補(bǔ)的DNA探針形成雜交體，在激光的激發(fā)下，熒光素發(fā)射熒光。以掃描儀對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)和分析，通過(guò)陳列上DNA探針的原始序列將靶DNA的信息反映出來(lái)。PCR技術(shù)介紹和常用方法 DNA芯片技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用 DNA芯片用于基因診斷、DNA序列測(cè)定、臨床藥物篩選、法醫(yī)鑒定、 食品工業(yè)和環(huán)境監(jiān)測(cè)等方面。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有極大的潛力。 1.基因診斷 應(yīng)用DNA芯片技術(shù)可以在DNA水平檢測(cè)與疾病相關(guān)的內(nèi)源性或外源

25、性基因；應(yīng)用表達(dá)芯片可以在mRNA水平分析同一組織在不同的發(fā)育階段，正常及病理狀態(tài)基因表達(dá)的差異，也可以分析不同組織同一基因在正常及病理狀態(tài)下表達(dá)的差異，從而為疾病診斷與分類，病原微生物分型提供科學(xué)依據(jù)。 序列測(cè)定 任何線狀的單鏈DNA或RNA序列均可被分解成一系列堿基數(shù)固定、錯(cuò)落而且重疊的寡核苷酸，如GTACTCGAATGC分解成GTACTAGA、TACTCGAA、ACTCGAAT、CTCGAATG、TCGAATGC五個(gè)錯(cuò)開(kāi)1個(gè)堿基但是可重疊7個(gè)堿基的8體亞序列，當(dāng)然也可以分解成7體，9體或其他整數(shù)（n體）亞序列。如果用某種方法將5個(gè)亞序列全部測(cè)定出來(lái)，就可以重新組建原來(lái)的核苷酸排列順序。應(yīng)

26、用這一原理，可以合成或應(yīng)用已知序列的所有可能的n體寡核苷酸，并將其固定在芯片表面，然后與標(biāo)記的待測(cè)靶序列雜交，經(jīng)過(guò)重新組合，即可得到待測(cè)的DNA序列。 3.臨床藥物篩選 臨床許多細(xì)菌對(duì)藥物具有抗藥性，但是不同的亞型對(duì)同一藥物的敏感性不同。DNA芯片技術(shù)已被用于鑒定結(jié)核菌及非典型分支桿菌的基因型與耐利福平的相關(guān)性以及HIV產(chǎn)生抗藥性與其逆轉(zhuǎn)錄酶及蛋白酶基因突變的相關(guān)性。這為臨床選擇敏感藥物提供了有效手段。 4.其他領(lǐng)域 法醫(yī)鑒定、食品工業(yè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)等方面，DNA芯片技術(shù)也將具有極大的潛力。PCR技術(shù)介紹和常用方法核酸分子雜交技術(shù)第一節(jié) 核酸分子雜交的基本原理 具有互補(bǔ)序列兩條單鏈核酸分子在一定條

27、件下 按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則退火形成雙鏈的過(guò)程。 雜交的雙方是待測(cè)核酸和已知核酸序列，已知 核酸序列稱探針。 雜交有固一液相雜交和液相雜交。 PCR技術(shù)介紹和常用方法變性復(fù)性 DNA-DNA雜交雙鏈分子PCR技術(shù)介紹和常用方法 一、DNA變性與復(fù)性 （一）DNA變性 1、定義：某些理化因素導(dǎo)致兩條DNA鏈間的氫鏈斷裂變?yōu)閱捂湹倪^(guò)程，稱DNA變性PCR技術(shù)介紹和常用方法2、變性的方法：（1）熱變性：溫度升高到90100時(shí)，雙鏈核酸 分子鏈間的氫鍵完全斷裂。 （2）酸堿變性：pH值低于3或高于10時(shí)，雙鏈核 酸分子鏈 間的氫鍵斷裂。 （3）化學(xué)試劑變性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使 雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵

28、斷裂。PCR技術(shù)介紹和常用方法3、變性后的理化性質(zhì)變化： 粘度降低 密度增加 紫外吸收值增加PCR技術(shù)介紹和常用方法4、GC含量與Tm值之間的關(guān)系 （G+C）%=（PCR技術(shù)介紹和常用方法（二）復(fù)性 1、定義：變性的單鏈核酸分子在一定條件下按堿基互補(bǔ)原則重新結(jié)合為雙鏈核酸的過(guò)程，稱復(fù)性或雜交。具有互補(bǔ)序列的兩條單鏈核酸都可互補(bǔ)形成雙鏈：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。PCR技術(shù)介紹和常用方法2、復(fù)性過(guò)程（1）單鏈分子間碰撞形成局部雙鏈（2）局部雙鏈周圍的堿基如不配對(duì)時(shí)，雙鏈重新解離（3）局部雙鏈周圍的堿基如配對(duì)，則形成中心序列（4）形成完整的

29、雙鏈分子PCR技術(shù)介紹和常用方法 二、影響雜交的因素 1、核酸分子的濃度和長(zhǎng)度： 濃度越大，復(fù)性速度越快 分子越大，復(fù)性速度越慢 單鏈探針，濃度增加，雜交效率增加 雙鏈探針，濃度控制在0.10.5g,濃度過(guò)高影響雜 交效率PCR技術(shù)介紹和常用方法2、溫度： （1）DNA/DNA雜交，適宜溫度較Tm值低2025 （2）RNA/DNA或RNA/RNA雜交，加甲酰胺降低 Tm值 （3）用寡核苷酸探針雜交，適宜溫度較Tm值低5 PCR技術(shù)介紹和常用方法3、離子強(qiáng)度： （1）低鹽濃度時(shí)雜交率較低，隨著鹽濃度增加，雜交率增加 （2）高濃度的鹽使堿基錯(cuò)配的雜交體更穩(wěn)定，當(dāng)進(jìn)行序列不完全同源的核酸分子雜交時(shí)，

30、必須維持雜交反應(yīng)液中較高的鹽濃度和洗膜溶液的鹽濃度 PCR技術(shù)介紹和常用方法4、甲酰胺： （1）甲酰胺能降低核酸雜交的Tm值，能降低雜交液的溫度，低溫時(shí)探針與待測(cè)核酸雜交更穩(wěn)定，當(dāng)待測(cè)核酸與探針同源性不高時(shí)，加50%甲酰胺溶液在3542 雜交 （2）如待測(cè)核酸序列與探針同源性高時(shí)，則用水溶液在68雜交 PCR技術(shù)介紹和常用方法5、非特異性雜交反應(yīng)： （1）雜交前封閉非特異性雜交位點(diǎn)，減少其對(duì)探針的非特異性吸附 （2）常用的封閉物有兩類：即非特異性DNA和高分子化合物。如鮭精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脫脂奶粉 PCR技術(shù)介紹和常用方法 第二節(jié) 核酸分子雜交的方法按待測(cè)核酸是否

31、固定在固相支持物上分： 固-液相雜交 膜上印跡雜交 原位雜交 液相雜交 RNA酶保護(hù)分析法 核酸酶S1保護(hù)分析法 PCR技術(shù)介紹和常用方法一、Southern印跡雜交（一）待測(cè)核酸樣品的制備 1、裂解或破碎細(xì)胞 2、抽取純化基因組DNA 3、限制酶消化DNA為大小不同的DNA片段PCR技術(shù)介紹和常用方法（二）待測(cè)DNA樣品的電泳分離 1、瓊脂糖濃度：分離大片段用低濃度膠 分離小片段用高濃度膠 2、凝膠電泳：凝膠具有分子篩效應(yīng)，大分子 DNA泳動(dòng)慢,小分子DNA泳動(dòng)快， 大小 相同的分子處于同一條帶 3、分子量標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)Hind消化的DNA，雜交 所用分子量標(biāo)準(zhǔn)可用核素標(biāo)記 PCR技術(shù)介紹和常用方

32、法（三）凝膠中核酸的變性（堿變化） 凝膠置于NaOH溶液中使DNA變性斷裂為較短的 單鏈 DNA,中性緩沖液中和凝膠中的緩沖液 PCR技術(shù)介紹和常用方法（四）Southern印跡 指將電泳分離的DNA片段轉(zhuǎn)移到一定的固 相支持物上的過(guò)程PCR技術(shù)介紹和常用方法1、固相支持物的選擇（1）理想的固相支持物應(yīng)具備的特性 具有較強(qiáng)結(jié)合核酸分子的能力 不影響與探針的雜交反應(yīng) 與核酸分子結(jié)合穩(wěn)定牢固 具有良好的機(jī)械性能 非特異吸附少PCR技術(shù)介紹和常用方法（2）常用的固相支持物 硝酸纖維素膜：優(yōu)點(diǎn)是吸附能力強(qiáng)，雜交信號(hào)本 底低。缺點(diǎn)是DNA分子結(jié)合不牢固 尼龍膜：優(yōu)點(diǎn)是結(jié)合單鏈，雙鏈DNA的能力比硝酸 纖

33、維素膜強(qiáng)；缺點(diǎn)：雜交信號(hào)本底高 化學(xué)活化膜：優(yōu)點(diǎn)：DNA與膜共價(jià)結(jié)合；對(duì)不同 大小的DNA片段有同等結(jié)合能力；缺點(diǎn)：結(jié)合能 力較上述兩種膜低PCR技術(shù)介紹和常用方法2、Southern印跡的常用方法 （1）毛細(xì)管虹吸印跡法 利用濃鹽轉(zhuǎn)移緩沖液的推動(dòng)作用，將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。 其基本原理是：容器中的轉(zhuǎn)移緩沖液含有高濃度的NaCl和檸檬酸鈉，上層吸水紙的虹吸作用使緩沖液通過(guò)濾紙橋、濾紙、凝膠、硝酸纖維素濾膜向上運(yùn)動(dòng)，同時(shí)帶動(dòng)凝膠中的DNA片段垂直向上運(yùn)動(dòng)，凝膠中的DNA片段移出凝膠而滯留在膜上PCR技術(shù)介紹和常用方法（2）電轉(zhuǎn)法利用電場(chǎng)的電泳作用將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。

34、PCR技術(shù)介紹和常用方法（3）真空轉(zhuǎn)移法 此法原理與毛細(xì)管虹吸法相同，只是以濾膜在下，凝膠在上的方式將其放置在一個(gè)真空室上，利用真空作用將轉(zhuǎn)膜緩沖液從上層容器中通過(guò)凝膠和濾膜抽到下層真空室中，同時(shí)帶動(dòng)核酸片段轉(zhuǎn)移到凝膠下面的尼龍膜或硝酸纖維素膜上。PCR技術(shù)介紹和常用方法 （五）Southern雜交 1、預(yù)雜交：封閉膜上能與DNA結(jié)合的位點(diǎn) 預(yù)雜交液為不含DNA探針的雜交液 2、雜交：液相中的DNA探針與膜上的待測(cè)DNA雜交 雙鏈DNA探針需加熱變性為單鏈，再雜交 3、洗膜：去除游離的放射性探針或非特異結(jié)合的 DNA PCR技術(shù)介紹和常用方法（六）雜交結(jié)果檢測(cè) 1、放射自顯影：適用于放射性核素

35、標(biāo)記的探針 2、比色或化學(xué)發(fā)光檢測(cè)：適于非核素標(biāo)記的探針PCR技術(shù)介紹和常用方法（七）Southern雜交在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 1、酶切圖譜分析 2、特定基因定性和定量 3、基因突變分析 4、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性的分析PCR技術(shù)介紹和常用方法二、Northern印跡雜交 1、基本原理和基本過(guò)程與Southern blot基本相同 2、鑒別RNA 3、探針可用DNA或RNA片段 4、待測(cè)樣品為總RNA或mRNAPCR技術(shù)介紹和常用方法Northern印跡與Southern 印跡的不同點(diǎn) 1、變性：RNA電泳前加熱變性、電泳時(shí)加變性劑保 持RNA處于變性狀態(tài)，DNA電泳前和電泳 中不變性 2、轉(zhuǎn)膜：RNA轉(zhuǎn)膜前不需變性和中和