《食品安全監(jiān)測技術(shù)》word版

1、第四章 食品安全檢測技術(shù)研究進(jìn)展第一節(jié) 三聚氰胺檢測方法目前檢測三聚氰胺的方法很多，HPLC，液質(zhì)和氣質(zhì)聯(lián)用是較常用的方法。本站收集部分國內(nèi)相關(guān)文章，并整理如下。方法包括：GC-MS，Spectra-Quad線檢測，超高效液相色譜_電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法，反相高效液相色譜法，高效液相色譜-二極管陣列法，高效液相色譜法HPLC，高效液相色譜-四極桿質(zhì)譜聯(lián)用，固相萃取與高效液相色譜聯(lián)用，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法LC- MS MS）等。液質(zhì)，氣質(zhì)聯(lián)用檢測三聚氰胺1、超高效液相色譜2電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法測定飼料中殘留的三聚氰胺飼料樣品經(jīng)1%三氯乙酸2二甲基亞砜提取,Wa te rs O as is MCX柱凈化,超高

2、效液相色譜分離,最終采用電噴霧串聯(lián)四極桿質(zhì)譜進(jìn)行檢測。結(jié)果表明,三聚氰胺在飼料中的含量范圍為105 000g / kg時(shí),線性關(guān)系良好 r 0199 。在10100g / kg 的添加水平范圍內(nèi)的平均回收率為83%94%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為412%615%。該方法的檢出限為10g / kg.2、高效液相色譜- 四極桿質(zhì)譜聯(lián)用測定飼料中三聚氰胺含量試驗(yàn)采用自動(dòng)固相萃取裝置, 建立合適的過柱程序; 運(yùn)用Agilent HP1100 高效液相色譜- 四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀, 優(yōu)化質(zhì)譜條件, 建立飼料中三聚氰胺殘留檢測方法。方法的線性范圍為0.0100.500 g/ml, 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.2%7.7%之間,回

3、收率在72.4%91.2%之間, 具有較好的準(zhǔn)確度和精密度。3、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法LC - MS/MS分析寵物食品中三聚氰胺建立了液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜LC - MS/MS用于寵物食品中三聚氰胺檢測的方法, 并將其與美國食品藥品監(jiān)督管理局US FDA公布的氣相色譜- 質(zhì)譜GC - MS和液相色譜LC方法進(jìn)行了對比,結(jié)果發(fā)現(xiàn)LC - MS/MS的方法, 前處理過程簡單, 是一種高靈敏度、高選擇性的分析方法。4、液相色譜2串聯(lián)質(zhì)譜法測定飼料中三聚氰胺殘留應(yīng)用液相色譜2串聯(lián)質(zhì)譜法測定飼料中三聚氰胺殘留。試樣用V 乙腈 V H2O = 11溶液,提取,高速離心后,供液相色譜2串聯(lián)質(zhì)譜儀定性定量分析。流動(dòng)

4、相為V 乙腈 V H2O = 8020混合溶液。采用電噴霧離子源, 定性離子對為127. 2 /85. 2 和127. 2 /68. 2; 定量離子對為127. 2 /85. 2。在添加了0. 5 10. 0 mg/kg的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)的回收率為92. 6%103. 2%;相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD在0. 8% 2. 0%;檢出限為0. 2 mg/kg。5、固相萃取一液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法檢測食品中的三聚氰胺樣品經(jīng)均質(zhì)，1三氯乙酸溶液提取，用OASIS MCX固相萃取小柱凈化，減壓濃縮后以甲醇溶解定容，用Waters BEHC。柱分離，乙腈和水為流動(dòng)相，經(jīng)液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法檢測。三聚氰胺線性范圍為0

5、1100mgkg，相關(guān)系數(shù)r為09999，平均回收率為71 95 ，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為456 一982n=6，方法的檢出限為05 mgkg。Spectra-Quad在線分析三聚氰胺含量三聚氰胺含量的實(shí)驗(yàn)室檢測方法存在檢測結(jié)果受蛋白質(zhì)分子中氮含量影響較大的問題，這種相似性會導(dǎo)致三聚氰胺的檢測異常困難。賽默飛世爾科技（上海）有限公司提供的Spectra-Quad在線成分分析儀可以實(shí)現(xiàn)三聚氰胺含量的在線實(shí)時(shí)連續(xù)檢測（見圖1），并能較好的解決檢測結(jié)果受蛋白質(zhì)含量影響的問題。Spectra- Quad采用近紅外線吸收檢測技術(shù)，是一種無接觸、無損傷和無危害的檢測方法。傳感器利用特定波長的近紅外線照射樣品，并對

6、反射光線進(jìn)行分析，且 Spectra-Quad所用光線亮度非常低，不會加熱或損傷樣品。對于三聚氰胺來說，其含量越高所反射出的光線就越少。實(shí)際檢測中，檢測人員可以將 Spectra-Quad傳感器固定到任何現(xiàn)有的傳送裝置上，通過使用粉末取樣儀，實(shí)現(xiàn)對氣動(dòng)傳輸產(chǎn)品中三聚氰胺含量的連續(xù)檢測，檢測數(shù)據(jù)可以輸出到某個(gè)工藝控制系統(tǒng)或PC機(jī)控制器內(nèi)，從而確保產(chǎn)品免受三聚氰胺的污染。HPLC檢測三聚氰胺1、反相高效液相色譜法測定飼料中三聚氰胺的含量2、高效液相色譜- 二極管陣列法測定高蛋白食品中的三聚氰胺建立用高效液相色譜- 二極管陣列法測定高蛋白食品中的三聚氰胺的檢測方法。對不同樣品采用不同的前處理方法,然

7、后用Agilent TC2C18 4. 6 250 mm色譜柱,柱溫為40 ,流動(dòng)相為0. 02 mol/L硫酸銨甲醇= 94 6 V V ,流速0. 8 mL /min,二極管陣列檢測器于235 nm 波長下進(jìn)行檢測,并以保留時(shí)間和三維光譜圖相似性系數(shù)進(jìn)行定性,外標(biāo)法定量。不同樣品的加標(biāo)回收率為98. 8% 101. 5% ,RSD小于1. 2%。方法線性范圍為0. 1150g/mL,檢測限為0. 01g/mL,相關(guān)系數(shù)R = 0. 999 9。3、高效液相色譜法HPLC測定飼料中三聚氰胺的含量本文建立了飼料中三聚氰胺的HPLC測定方法。該法采用Symmetry C18柱為分離柱,二極管陣列

8、紫外檢測器進(jìn)行樣品檢測max = 236nm 。方法簡單、快速、重現(xiàn)性好,平均回收率大于90% , RSD小于3. 0% ,線性范圍為1mg/L - 100mg/L。4、固相萃取與高效液相色譜聯(lián)用測定寵物食品中三聚氰胺利用陽離子交換2反相萃取柱凈化樣品提取液,結(jié)合高效液相色譜對寵物食品中三聚氰胺進(jìn)行測定,獲得較滿意的結(jié)果。復(fù)雜基質(zhì)中154種農(nóng)藥殘留量的分析2006年日本推出了肯定列表制度，針對800種農(nóng)藥設(shè)置了殘留限量，使農(nóng)藥殘留分析成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，目前用于農(nóng)藥殘留分析的主要技術(shù)為氣相色譜/單四桿質(zhì)譜的選擇離子掃描技術(shù)（SIM）1-2離子阱質(zhì)譜多選擇反應(yīng)監(jiān)測技術(shù)（MRM）3和全掃描的計(jì)算機(jī)

9、輔助技術(shù)4-5。單四極桿的選擇離子技術(shù)采集的質(zhì)譜信息少，選擇性較差，結(jié)果存在很大的不確定性。離子阱質(zhì)譜二級質(zhì)譜技術(shù)為時(shí)間上的串聯(lián)，因此對于多組份化合物同時(shí)分析存在掃描速度受限的問題。本文采用Thermo推出的最新一代氣相色譜/三重四極桿串接質(zhì)譜（TSQ Quantum GC），通過其高通量離子傳輸?shù)男阅堋⑴鲎彩伊愦當(dāng)_技術(shù)和高選擇性反應(yīng)監(jiān)測技術(shù)（H-SRM），實(shí)現(xiàn)了一針進(jìn)樣同時(shí)對154種化合物的同時(shí)分析，整個(gè)分析過程可在在22min內(nèi)完成，保證結(jié)果準(zhǔn)確的同時(shí)大幅度提高了分析效率。實(shí)驗(yàn)部分以下為實(shí)驗(yàn)中使用的色譜、質(zhì)譜儀器、操作條件。表1為Quantum GC 質(zhì)譜部分的分段掃描程序。氣相色譜：TR

10、ACE GC ultraColumn：Rti-5MS （Restek）15m0.25 mm I.D. df=0.25mInjection mode：Splitless Injection Temp：220Transferline Temp：280Oven Temp：70（1 min）25/min13015/min160 5/min210 25/min290（5 min）Flow：constant flow 1.0 ml/min質(zhì)譜：Ion Source Temp，250Emission Current：50AIonization mode：EIIon volumn：Closed EIAnaly

11、tical mode:H-SRM （High Selected Reaction Monitoring）Scan width：0.002 m/zScan Time：0.025 secPeak Width for H-SRM：Q1，0.4Da；Q3，0.7DaCollision Gas Pressure：1.5 mTorr （Ar）結(jié)果與討論掃描分段程序（Segment）的建立隨著待檢測項(xiàng)目的逐漸增多，分析方法的效率和準(zhǔn)確度成為影響實(shí)驗(yàn)室檢測能力的主要因素之一。TSQ Quantum GC具有高通量離子傳輸性能和碰撞室零串?dāng)_技術(shù)特點(diǎn)，本方法憑借這一特點(diǎn)成功實(shí)現(xiàn)了一次進(jìn)樣，22分鐘之內(nèi)對154種農(nóng)

12、藥的準(zhǔn)確的定性、定量分析。眾所周知，使用一根毛細(xì)管色譜柱對百種以上化合物實(shí)現(xiàn)色譜上完全分離是非常困難的1，本方法為了提高分析效率，縮短分析時(shí)間，使用15 m的色譜柱。在此條件下，154種化合物的保留時(shí)間分布非常緊湊，在某些保留時(shí)間處，會出現(xiàn)34個(gè)化合物同時(shí)出峰的結(jié)果。這就要求質(zhì)譜必須具有高通量的離子掃描功能，以保證所有化合物均能夠被準(zhǔn)確、快速檢測。TSQ Quantum GC是當(dāng)前具有最高通量離子傳輸效率的三重四極質(zhì)譜，正是基于這一特點(diǎn)，本方法可實(shí)現(xiàn)對154種化合物的一次進(jìn)樣同時(shí)連續(xù)分析。圖1為韭菜中添加濃度為1 ppb農(nóng)藥的色譜圖，從圖中可以看出使用TSQ Quantum GC按照表1所列條

13、件進(jìn)行分析，獲得了超高靈敏度，具有很好的定量結(jié)果。零串?dāng)_功能的使用對于多組份化合物同時(shí)分析，碰撞池的離子間串?dāng)_是影響分析結(jié)果的另一主要因素。對于三重四極桿質(zhì)譜在進(jìn)行SRM掃描的過程中，當(dāng)后一組離子進(jìn)入碰撞池時(shí)，前一組離子若仍然存在，便會有產(chǎn)生離子串?dāng)_的可能，導(dǎo)致第二組離子產(chǎn)生錯(cuò)誤的色譜圖，當(dāng)兩組不同SRM事件具有相同“子”離子時(shí)，這一問題會更為嚴(yán)重。在進(jìn)行超過百種化合物的一針進(jìn)樣同時(shí)檢測分析時(shí)，不可避免地在一個(gè)窗口中會放入多組離子進(jìn)行同時(shí)的SRM分析，如果儀器中存在交叉干擾，會導(dǎo)致最終的結(jié)果失去準(zhǔn)確性。TSQ Quantum 三重四極桿質(zhì)譜采用直角碰撞池設(shè)計(jì)，可有效地消除離子串?dāng)_，此設(shè)計(jì)被稱為

14、無離子串?dāng)_技術(shù)。通過這種“無離子串?dāng)_技術(shù)”有效地消除了由儀器檢測所產(chǎn)生假陽性的可能，從而保障了TSQ Quantum 對154種化合物同時(shí)進(jìn)行分析的準(zhǔn)確性。高選擇反應(yīng)檢測有效去除基質(zhì)干擾復(fù)雜基質(zhì)中多組份殘留物分析，排除基質(zhì)干擾準(zhǔn)確對目標(biāo)化合物進(jìn)行定量是另一主要難點(diǎn)。對于三重四極桿質(zhì)譜，選擇反應(yīng)監(jiān)測（SRM）是目標(biāo)化合物定量分析中最為基本的掃描技術(shù)。然而以單位質(zhì)量分辨選擇母離子，往往會受到來自于生物體自身和環(huán)境基質(zhì)的干擾。而高選擇性反應(yīng)監(jiān)測（H-SRM）通過在Q1上使用分辨增強(qiáng)峰，獲得耐受性更強(qiáng)的母離子，可有效增加待測化合物分析的選擇性。TSQ Quantum GC是唯一具有H-SRM功能的氣相

15、色譜/三重四極桿質(zhì)譜儀。圖2為使用TSQ Quantum GC對韭菜中添加1ppb 甲基苯噻隆采用SRM（Q1，0.7 FWHM）掃描和高選擇H-SRM（Q1，0.4 FWHM）掃描采集的色譜圖。分析圖2A可以看出采用SRM掃描時(shí)，恰好在待測目標(biāo)化合物（6.80 min）處存在較大干擾，無法對目標(biāo)化合物進(jìn)行定量分析。圖B為Q1采用0.4分辨進(jìn)行H-SRM掃描得到的色譜圖，從中可以看出來自基質(zhì)的干擾被有效地去除，得到了理想的待測化合物色譜峰。比較A、B兩圖，H-SRM更為有效地去除了基質(zhì)干擾，提高了方法的檢測下限。圖3為韭菜中添加1ppb的各種農(nóng)藥采用H-SRM掃描的色譜圖，各化合物均獲得了理想

16、的靈敏度。結(jié)論在22min內(nèi)，憑借TSQ Quantum GC超高的離子傳輸效率、通過設(shè)定多個(gè)時(shí)間段（Segment）和掃描通道可一針進(jìn)樣同時(shí)分析154種農(nóng)藥成分。通過TSQ Quantum GC 的高選擇反應(yīng)檢測掃描（H-SRM），可有效去除基質(zhì)干擾，與離子阱和單四極質(zhì)譜相比，更為有效地排除假陽性，進(jìn)一步地保證定量和定性的準(zhǔn)確性。本方法具有較高靈敏度，部分農(nóng)藥在復(fù)雜基質(zhì)中的檢測下限可達(dá)到0.5ppb，完全滿足肯定列表等國際法規(guī)對檢測的要求。食品基質(zhì)中403種農(nóng)藥殘留的測定復(fù)雜食品基質(zhì)（如谷物、蜂蜜、蘋果、肉類）中痕量農(nóng)殘的分離檢測非常復(fù)雜，本文建立了使用Agilent 快速高分離度液相色譜（

17、RRLC）與三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜 (QQQ)聯(lián)用的方法，實(shí)驗(yàn)得到了良好的線性關(guān)系和重復(fù)性。與常規(guī)HPLC相比，顯著改善了復(fù)雜樣品的分離度，極大地提高了檢測靈敏度和分析通量，在復(fù)雜食品基質(zhì)中痕量組分中有著廣闊的應(yīng)用前景。儀器和主要試劑Agilent 1200 RRLC快速高分離度液相色譜；Agilent 6410 QQQ（三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜）；振蕩儀；氮?dú)獯蹈蓛x。所有試劑均為色譜純，購自Sigma公司；C18 SPE柱（Supelclean LC-18，3ml Tubes，Supelco）；微孔濾膜過濾：0.45m（Supelco）；所有農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma Inc.。標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備標(biāo)準(zhǔn)儲備溶

18、液：分別精確稱取5.0mg分別置于10ml容量瓶中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的溶解度選甲醇、乙腈等溶劑溶解并定溶至刻度?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液（混合標(biāo)準(zhǔn)溶液A、B、C、D、E和F）：按照農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品的性質(zhì)和保留時(shí)間，將403種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品分成A、B、C、D、E、F六個(gè)組。依據(jù)每種農(nóng)藥的分組，移取一定量的單個(gè)農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)儲備液于100ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，所有被分析物的線形濃度范圍0.5500ng/ml?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液避光4保存，可使用一個(gè)月。樣品的提取與凈化稱取10g樣品至300ml三角瓶中，加入100ml乙腈并震搖30min，過濾乙腈提取液至100ml梨形瓶中，于40水浴濃縮至5ml左右。 100m

19、l 4%氯化鈉水溶液分三次溶解濃縮液，并將其全部轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加入50ml二氯甲烷震蕩提取10min（重復(fù)二次）。下層有機(jī)相過裝有無水硫酸鈉的漏斗于100ml梨形瓶中，40水浴旋轉(zhuǎn)濃縮蒸干后用5ml甲醇溶解，上C18 SPE柱（Supelclean LC-18，3ml Tubes，Supelco；SPE柱預(yù)先用5ml甲醇洗脫，然后用5ml洗脫進(jìn)行預(yù)處理），用5ml甲醇洗脫，全部甲醇洗脫液在氮?dú)庀麓蹈?，殘留物用甲醇：水?5：85）定容至1ml，0.45m微孔濾膜過濾后供LC-QQQ分析。操作條件色譜條件譜柱：Agilent SB-C18，2.1100mm，1.8m；柱溫：50；進(jìn)樣量：20

20、l；流動(dòng)相及流速見表1；后運(yùn)行時(shí)間：8min。質(zhì)譜條件電離源模式：電噴霧離子化；電離源極性：正模式；霧化氣：氮?dú)?；霧化氣壓力：40psi；離子噴霧電壓：4000V；干燥氣溫度：350；干燥氣流速：10L/min；分辨率：Q1（unit）Q3（unit）。樣品分析定性測定：在相同實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行樣品測定時(shí)，如果樣品中檢出色譜峰的保留時(shí)間與基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)中某種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品色譜峰的保留時(shí)間一致，并且在扣除背景后所選擇的二對離子及豐度比也一致，則可判定為樣品中存在這種農(nóng)藥殘留。定量測定：本方法中LC-QQQ采用外標(biāo)校準(zhǔn)曲線法定量測定。為減少基質(zhì)對定量測定的影響，定量用標(biāo)準(zhǔn)溶液采用基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液繪制，

21、并且所測樣品中農(nóng)藥殘留的響應(yīng)值均在線性范圍內(nèi)。平行試驗(yàn)：按以上步驟對同一試樣進(jìn)行平行試驗(yàn)?？瞻自囼?yàn)：除不稱取試樣外，均按上述步驟進(jìn)行。結(jié)果計(jì)算：LC-QQQ測定采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量結(jié)果由Mass Hunter定量軟件Quantitative Analysis計(jì)算生成。結(jié)果403種農(nóng)藥的線形濃度范圍0.5500ng/ml，線形關(guān)系良好，R值均大于0.99。谷物樣品中農(nóng)藥殘留的總離子流圖（TIC）見圖1、圖2。結(jié)論本文所建立的方法具有出色的檢測靈敏度、良好的線性關(guān)系和重復(fù)性，非常適用于復(fù)雜食品基質(zhì)中痕量農(nóng)殘的分離檢測。Agilent快速高分離度液相色譜（RRLC）與三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜

22、（QQQ）的聯(lián)用，不僅顯著改善了復(fù)雜樣品的分離度、而且極大提高了檢測靈敏度和分析通量。新型持久性有機(jī)污染物PBDEs分析方法多溴聯(lián)苯醚(PBDEs) 是一種新型持久性有機(jī)污染物，在環(huán)境及生物體內(nèi)普遍存在且污染呈增長趨勢，并對動(dòng)物及人類健康造成潛在的危害。本文介紹了PBDEs的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、對環(huán)境的污染情況、分析方法等。文/多溴聯(lián)苯醚（polybrominated diphenyl ethers, PBDEs）是一類廣泛使用的溴代阻燃劑。由于其熱穩(wěn)定性好，阻燃效率高，被廣泛應(yīng)用于紡織、家具、建材和電子等產(chǎn)品當(dāng)中。由于其為一種添加型阻燃劑，沒有化學(xué)鍵的束縛，PBDEs易于從其應(yīng)用產(chǎn)品（如電子產(chǎn)品）中

23、向環(huán)境中釋放。PBDEs化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在環(huán)境中難以降解，具有高親脂性，并且能隨食物鏈產(chǎn)生生物富集和放大效應(yīng)。毒理學(xué)研究表明PBDEs是一種致癌性并且具有內(nèi)分泌干擾毒性的有毒物質(zhì)。作為新型持久性有機(jī)污染物，PBDEs已經(jīng)成為當(dāng)前環(huán)境科學(xué)的研究熱點(diǎn)。化學(xué)結(jié)構(gòu)及應(yīng)用PBDEs的分子式為C12H（0-9）Br（1-10）O，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。PBDEs有209種同系物，遵循同多氯聯(lián)苯一樣的IUPAC編號命名系統(tǒng)，其中二位單取代的同系物命名為BDE-1，而取代位全被溴原子取代的同系物命名為BDE-209。根據(jù)溴原子取代個(gè)數(shù)的不同，209種PBDEs 同系物分為10個(gè)同系組。PBDEs的沸點(diǎn)為310425，

24、具有蒸汽壓低、熱穩(wěn)定性高的特點(diǎn)，在環(huán)境中難以降解。實(shí)驗(yàn)表明PBDEs的蒸汽壓比多氯聯(lián)苯的蒸汽壓低，并且隨取代溴原子個(gè)數(shù)的增加其蒸汽壓降低。四溴聯(lián)苯醚同系物的辛醇水分配系數(shù)logKow為5.96.2，五溴聯(lián)苯醚為6.57.0，八溴聯(lián)苯醚為 8.48.9，十溴聯(lián)苯醚為10，表現(xiàn)出較強(qiáng)的親脂疏水性，并且容易在生物體內(nèi)的脂肪和蛋白質(zhì)中富集并通過食物鏈放大。高溫分解時(shí)PBDEs會生成劇毒物多溴二苯并二惡英（PBDDs）及多溴二苯并呋喃（PBDFs）。商業(yè)PBDEs產(chǎn)品主要包括五溴聯(lián)苯醚、八溴聯(lián)苯醚和十溴聯(lián)苯醚。五溴聯(lián)苯醚作為紡織品、聚氨酯泡沫的添加阻燃劑應(yīng)用于家具、床墊等行業(yè)。八溴聯(lián)苯醚產(chǎn)品常被作為聚碳

25、酸酯、熱固樹脂、ABS工程塑料的阻燃劑并應(yīng)用于電子產(chǎn)品領(lǐng)域。十溴聯(lián)苯醚作為大多數(shù)合成材料的阻燃劑常被應(yīng)用于印刷電路板、紡織品等領(lǐng)域。五溴聯(lián)苯醚和八溴聯(lián)苯醚是由多種PBDE同系物組成的混合物，其組成成分隨生產(chǎn)商的不同而有所變化。生物體內(nèi)PBDE的污染狀況從首次在環(huán)境中發(fā)現(xiàn)PBDEs至今已有20多年的歷史。1979年，美國一家PBDEs生產(chǎn)企業(yè)周圍的土壤和污泥中首次檢測到了BDE-209的存在。1987年，在北冰洋、波羅的海和北海的海洋哺乳動(dòng)物組織中檢測到PBDEs，由此顯示PBDEs已成為一類全球性的環(huán)境污染物。目前研究表明包括空氣、土壤、底泥、野生動(dòng)物以及人體血液、母乳中都有PBDEs的檢出。

26、瑞典檢測了39名分娩母親母乳中PBDEs的濃度水平，發(fā)現(xiàn)母乳中PBDEs濃度水平與母親年齡、電腦使用頻率、飲酒等因素不相關(guān)。對日本母乳的研究發(fā)現(xiàn)攝入魚類較多的女性其母乳中PBDEs的濃度（1.34 ng/g （脂肪含量）高于攝入魚類較少的女性母乳（0.71 ng/g 脂肪含量）。瑞典在19951997年，檢測了77人的脂肪組織中BDE-47的濃度，所有的樣品中全部檢測出PBDEs。研究表明19702001年三十年時(shí)間段內(nèi)，北美、歐洲以及日本人體血液、母乳及組織中PBDEs的濃度增加了100倍，每隔5年濃度增加一倍。北美地區(qū)人體內(nèi)的PBDEs污染水平明顯高于歐洲地區(qū)，日本人群所處的環(huán)境中，PBD

27、E的含量比歐洲要低，而北美的濃度明顯偏高，為35ng/g （脂肪含量）。職業(yè)暴露人群體內(nèi)以高溴代的BDE-183、 BDE-209為主。與十溴聯(lián)苯醚接觸的工人體內(nèi)血清中BDE-209的含量明顯高于普通人，一項(xiàng)針對19名計(jì)算機(jī)工廠全職工人的研究表明工人血清中 BDE-153、-183和-209的含量比常人高5倍，說明多溴聯(lián)苯醚的逸出是造成職業(yè)人員體內(nèi)濃度偏高的主要原因。在野生動(dòng)物體內(nèi)中也檢測到了PBDEs。通過19812000年對美國五大湖地區(qū)的污染水平比較發(fā)現(xiàn)，銀鷗蛋中PBDEs每隔3年濃度增加一倍。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)19702001年加拿大北極地區(qū)的水生哺乳動(dòng)物體內(nèi)的PBDEs濃度非常低，為5ng

28、/g （脂肪含量），但是每隔大約7年濃度增加一倍。世界上其他地區(qū)的水生哺乳動(dòng)物體內(nèi)PBDEs每隔大約5年濃度加倍。瑞典一些鳥蛋中污染水平也非常高（脂肪含量為2000 ng/g），并且每隔6年濃度加倍。我國PBDEs的相關(guān)研究起步較晚，但是最近幾年研究發(fā)展非常迅速。初步結(jié)果表明PBDEs的含量在我國還處于相對較低的水平。對 20042005年珠江河口生物樣品中PBDEs的檢測表明魚類（魚、大黃魚、銀鯧、舌鰨、龍頭魚）、蝦類（刀額新對蝦、近緣新對蝦）及蝦蛄類生物樣品肌肉組織中10種PBDEs的含量分別為37.8407.1 ng/g （脂肪含量）、49.0239.1 ng/g （脂肪含量）和1424

29、44.5 ng/g （脂肪含量），所有樣品中，BDE-47相對含量最高。對中國南方某城市21對嬰兒臍帶和母親靜脈血樣的分析結(jié)果顯示BDE-47和BDE-153為最主要的同系物，總PBDEs的濃度范圍為1.517 ng/g，遠(yuǎn)低于美國所報(bào)道的水平。分析方法PBDEs的分析方法主要借鑒多氯聯(lián)苯的檢測方法。目前各實(shí)驗(yàn)室所用的方法主要是依據(jù)美國EPA1614（草稿）方法進(jìn)行改進(jìn)。主要步驟包括樣品提取、凈化、分離和檢測。對于液體樣品，一般用液液萃取、固相萃取以及連續(xù)液液萃取等方法，固體樣品常用的提取方法有超聲萃取、索式提取、加速溶劑萃?。ˋSE）、微波輔助萃取等。萃取溶劑可選擇二氯甲烷、正己烷、丙酮以及

30、甲苯等有機(jī)溶劑。在樣品凈化步驟，對于不同的樣品需要去除不同的雜質(zhì)以保證儀器分析的準(zhǔn)確性。對于生物樣品和植物樣品，需要去除脂肪和色素等雜質(zhì)。而對于底泥和土壤樣品則需要去除硫。濃硫酸或酸性硅膠能有效去除樣品中的脂類、色素等干擾物質(zhì)，凝膠滲透色譜（GPC）除了能去除大分子干擾物外，還可以去除小分子物質(zhì)硫的干擾。凝膠滲透色譜主要是靠體積的差異排除大分子，目前主要應(yīng)用為玻璃填充柱和儀器自動(dòng)凝膠滲透色譜。銅粉可以去除硫干擾物，但是使用前銅粉需用酸活化。先用以上步驟去除大部分雜質(zhì)之后，則需要用復(fù)合硅膠柱對樣品進(jìn)行進(jìn)一步的被分析物的分離和凈化。而對于基質(zhì)特別復(fù)雜的樣品，如污水處理廠的終端產(chǎn)物活性污泥，則需要多

31、次復(fù)合硅膠柱凈化過程。其他常用的凈化方法包括弗羅里土柱、氧化鋁柱等凈化方法。PBDE的儀器檢測方法有GC-ECD、GC-LRMS、GC- HRM S、GC-ICP-MS、HPLC-MS等方法。但是主要應(yīng)用為GC-MS的方法，質(zhì)譜的電離方式為電子轟擊（EI）或負(fù)離子化學(xué)電離源（NECI）。 CI比EI靈敏度高，但是EI可以使用同位素稀釋的方法定量，這使得超痕量分析更加準(zhǔn)確。氣相色譜進(jìn)樣裝置可以采用常規(guī)分流/不分流進(jìn)樣，程序升溫蒸發(fā)，加壓無分流、冷柱頭進(jìn)樣、以及大體積進(jìn)樣等方法以提高儀器的靈敏度和檢測限。而所使用的柱子主要型號為DB-5HT、DB-XLB等。近年來，高分辨氣相色譜-高分辨質(zhì)譜的方法

32、被應(yīng)用于檢測PBDEs，這種方法使得檢測的靈敏度和選擇性達(dá)到更高的水平。分析過程中，樣品中含有的多氯聯(lián)苯會干擾多溴聯(lián)苯醚的檢測，必須引起足夠的重視。另外，高溴代的PBDEs同系物在色譜柱上的保留時(shí)間較長，實(shí)際分析時(shí)一般采用較短的氣相色譜柱，例如分析BDE-209一般采用15m的色譜柱。這樣就可以防止其在柱子上保留時(shí)間過長而導(dǎo)致其在柱子上熱降解而導(dǎo)致分析不準(zhǔn)。總結(jié)作為新型持久性有機(jī)污染物，PBDEs已經(jīng)造成全球性的環(huán)境污染，在環(huán)境及生物體內(nèi)普遍存在且污染呈增長趨勢，并對動(dòng)物及人類健康造成潛在的危害。為此歐洲等一些發(fā)達(dá)國家已禁止生產(chǎn)和使用五溴、八溴聯(lián)苯醚，并禁止含此類化合物的產(chǎn)品進(jìn)入歐盟市場，而我

33、國由于對PBDEs的研究開展較晚，相關(guān)報(bào)道較少，缺乏對該類污染物的防治措施。今后，我國應(yīng)大力加強(qiáng)該污染物在生物體內(nèi)的長期毒性、暴露途徑、環(huán)境及人體內(nèi)的分布及遷移轉(zhuǎn)化、修復(fù)方法等方面的科學(xué)研究，并積極尋找替代品，為制定合理的環(huán)境政策提供依據(jù)和數(shù)據(jù)支持關(guān)于廢水pH的測定?pH為水中氫離子活度的負(fù)對數(shù)。pH=lgaH+在非常稀的溶液中，氫離子活度等于氫離子的濃度。pH是化學(xué)中常用的和最重要的檢測項(xiàng)目之一，可間接地表示水的酸堿程度。pH等于7時(shí)，溶液為中性；大于7時(shí)，溶液為堿性；小于7時(shí)，溶液為酸性。用玻璃電極法測定廢水的pH。其原理是：以飽和甘汞電極為參比電極，以玻璃電極為指示電極組成電池，在25攝

34、氏度、101.3kpa大氣壓時(shí)，溶液每變化1個(gè)pH，電位差改變59.1毫伏，將伏特計(jì)的刻度改為pH刻度，便可直接讀出溶液的pH值。工具與材料酸度計(jì)（簡稱pH計(jì)），玻璃電極，飽和甘汞電極，磁力攪拌器，燒杯，容量瓶，烘箱，溫度計(jì)。配制pH標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，蒸餾水?；顒?dòng)過程1pH標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。根據(jù)待測廢水的pH的大致范圍，從中選擇pH接近的相應(yīng)物質(zhì)，配制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液。2根據(jù)儀器使用說明書的要求，打開pH計(jì)的電源開關(guān)，預(yù)熱半小時(shí)。3用pH標(biāo)準(zhǔn)液校正儀器刻度。用溫度計(jì)測定環(huán)境溫度，然后把儀器的溫度補(bǔ)償器旋鈕調(diào)至該溫度處。用蒸餾水沖洗兩電極，用濾紙吸干上面殘存的水。把甘汞電極的下端和玻璃電極的玻璃泡

35、浸入pH標(biāo)準(zhǔn)溶液中，用磁力攪拌器攪拌1min。調(diào)整儀器指針，使其位于標(biāo)準(zhǔn)溶液的pH處。4廢水pH的測定。用蒸餾水緩緩淋洗兩電極35次，再用待測廢水淋洗35次。然后將它們插入裝有2550mL廢水的燒杯中，電極浸入水中，攪拌，待讀數(shù)穩(wěn)定后，讀pH。說明與延伸1玻璃電極在使用前應(yīng)在蒸餾水中浸泡24min以上。用畢，沖洗干凈，浸泡在水中。2空氣中的二氧化碳會影響測定結(jié)果，因此測定時(shí)不宜提前打開廢水水樣的瓶塞。3測定時(shí)，玻璃電極的玻璃泡應(yīng)完全浸入溶液中，并稍高于甘汞電極的陶瓷芯端，以免攪拌時(shí)碰破。4為消除誤差，必須使用與被測廢水pH相接近的標(biāo)準(zhǔn)溶液校正儀器。5測定廢水時(shí)，電極用水淋洗后，還需要用被測廢水

36、淋洗，避免產(chǎn)生誤差。植物、煙草、作物植株全氮磷鉀測定方法 待測液的制備（H2SO4H2O2消煮）試劑：濃H2SO4、30%H2O2方法：稱取植株樣品0.3000g置于100ml開氏瓶中，先用水濕潤樣品，然后加濃H2SO4 5ml，輕輕搖勻（最好放置過夜），瓶口放一漏斗，在消化時(shí)先低溫加熱，待濃硫酸分解冒白煙逐漸升高溫度。當(dāng)溶液全部呈棕黑色時(shí)，取下冷卻加30%H2O210滴，并搖動(dòng)，以利反應(yīng)充分進(jìn)行。在加熱至沸騰后，稍冷后再加30%H2O210滴，如此反復(fù)23次。直至消煮液呈無色或清亮后，再加熱510分鐘，以除盡過剩的雙氧水。取出開氏瓶冷卻，用少量水沖洗漏斗，洗液洗入瓶中。將消煮液用水定容至10

37、0ml供測N、P、K的測定。消煮時(shí)同時(shí)做空白試驗(yàn)以校正試劑的誤差。植株全氮的測定：（H2SO4H2O2消煮，奈氏比色法）試劑：100g/L酒石酸鈉溶液、100g/LKOH溶液、奈氏試劑（溶解HgI245.0g和KI35.0g于水中，將此溶液洗入1000ml容量瓶中，加入KOH 112g，加水至800ml，搖勻，冷卻定容，放置數(shù)日以后裝入棕色瓶中備用）、100ug/mlN（NH4+-N）標(biāo)準(zhǔn)液（稱取烘干NH4Cl0.3817g溶于水中，定容為1000ml，此為100ug/mlN（NH4+-N）貯備液。用時(shí)吸上述溶液50ml，稀釋至500ml，即為10ug/mlN（NH4+-N）工作液）操作步驟：

38、取上述待測液5ml置于50ml容量瓶中加100g/L酒石酸鈉溶液2ml，充分搖勻，再加入100g/LKOH溶液中和溶液中的酸（取一份待測液，以酚酞作指示劑，測定中和這份溶液所需KOH的ml數(shù)），加水至40ml，搖勻，加奈氏試劑2.5ml，用水定容后充分搖勻。30分鐘后用分光光度計(jì)比色，波長420nm。同時(shí)做空白。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：分別吸取10ug/mlN（NH4+-N）標(biāo)準(zhǔn)液0、2.50、5.00、7.50、10.00、12.50ml至于50ml容量瓶中，顯色步驟同上樣品測定。濃度溶液分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2. 5ug/ml N（NH4+-N），在420nm波長處比色。以空白

39、消煮液顯色后調(diào)零點(diǎn)。結(jié)果計(jì)算：N（%）=Vts10-4/m顯色液N（NH4+-N）的質(zhì)量濃度ug/ml V顯色液體積(ml) ts分取倍數(shù)m干樣品質(zhì)量(g)104將mg/L濃度單位換算為百分含量的換算因數(shù)植物全磷的測定(H2SO4H2O2消煮,釩鉬黃比色法)試劑:釩鉬酸銨溶液(25.0g鉬酸銨(NH4)6Mo7O244H2O分析純?nèi)苡?00ml水中，另將1.25g偏釩酸銨(NH4VO3，分析純)溶于300ml沸水中，冷卻后加入250ml濃HNO3(分析純)。將鉬酸銨溶液緩緩注入釩酸銨溶液中，不斷攪勻，最后加水稀釋到1L，貯入棕色瓶中)、6mol/LNaOH溶液（24gNaOH溶于水，稀釋至10

40、0ml）、0.2%二硝基酚指示劑（0.2g2，6二硝基酚或2，4二硝基酚溶于100ml水中）、磷標(biāo)準(zhǔn)液50mg/LP（0.2195g干燥的KH2PO4(分析純)溶于水，加入5ml濃H2SO4，于1L容量瓶中定容，裝入塑料瓶中低溫保存。 操作步驟：吸取定容后的消煮液10.00ml放入50ml容量瓶中，加2滴二硝基酚指示劑，滴加6mol/LNaOH中和至剛呈黃色，加入10.00ml釩鉬酸銨試劑，用水定容50ml。15分鐘后在波長450mm處進(jìn)行測定，以空白溶液(空白試驗(yàn)消煮液按上述步驟顯色)調(diào)節(jié)儀器零點(diǎn)。 標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確吸取50ug/LP標(biāo)準(zhǔn)液0、1、2.5、5、7.5、10、15ml分別放入50

41、ml容量瓶中，按上述步驟顯色，即得0、1.0、2.5、5.0、7.5、10、15ug/ml P的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，與待測液一起測定，讀取吸光度，然后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線或求直線回歸方程。結(jié)果計(jì)算：P（%）=Vts10-4/m顯色液P的質(zhì)量濃度ug/ml V顯色液體積(ml) ts分取倍數(shù)m干樣品質(zhì)量(g)104將ug/L濃度單位換算為百分含量的換算因數(shù)植物全鉀的測定(H2SO4H2O2火焰光度法)試劑:K標(biāo)準(zhǔn)溶液100ug/L（0.1907gKCl，在105110干燥2h，溶于水，于1L容量瓶中定容，存于塑料瓶中）操作步驟：吸取定容后的消煮液10.00ml放入50ml容量瓶中，用水定容50ml。直接在火焰

42、光度計(jì)上測定，讀取檢流計(jì)讀數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確吸取100ug/L標(biāo)準(zhǔn)溶液0，0.5，1.0，2.5，5.0，10，20ml，分別放入50ml容量瓶中，加入定容后的空白消煮液5或10ml(使標(biāo)準(zhǔn)溶液中的離子成分和待測液相近)，加水定容。即得0，1，2，5，10，20，40ug/mlK的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。以濃度最高的標(biāo)準(zhǔn)溶液定火焰光度計(jì)檢流計(jì)的滿度,然后從稀到濃依次進(jìn)行測定，記錄檢流計(jì)讀數(shù)，以檢流計(jì)讀數(shù)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果計(jì)算：全K（%）=Vts10-4/m顯色液P的質(zhì)量濃度ug/ml V顯色液體積(ml) ts分取倍數(shù)m干樣品質(zhì)量(g)104將甲醛的測定GB/T 5009.49-2003 發(fā)酵酒

43、衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了發(fā)酵酒中各項(xiàng)衛(wèi)生指標(biāo)的分析方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于以含糖或淀粉的物質(zhì)為原料，經(jīng)糖化發(fā)酵后不經(jīng)蒸餾而制成的酒中各項(xiàng)衛(wèi)生指標(biāo)的分析。2 規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB 2758 發(fā)酵酒衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.12 食品中鉛的測定GB/T 5009.22 食品中黃曲霉毒素B1的測定GB/T 5009.26 食品中N-亞硝胺類的測定

44、GB/T 5009.34 食品中亞硫酸鹽的測定GB/T 5009.35 食品中合成著色劑的測定3 感官檢查3.1 量取30mL樣品,置于50mL清潔干燥無色玻璃燒杯中，觀察其顏色，應(yīng)透明無沉淀，無雜質(zhì)。3.2 嘗其味應(yīng)有該種酒特有的芳香味和滋味，不應(yīng)有霉味、酸味、異味。應(yīng)符合GB 2758 的規(guī)定。4 理化檢驗(yàn)4.1 鉛按GB/T 5009.12 操作。4.2 黃曲霉毒素B1 按GB/T 5009.22 操作。4.3 二氧化硫按GB/T 5009.34 操作。如果加四氯汞鈉吸收的溶液有色，可加人少量活性炭脫色，過濾，濾液備用。4.4 N-亞硝胺類（啤酒）按GB/T 5009.26 操作。4.5

45、 著色劑按GB/T 5009.35 操作。4.6 甲醛 原理甲醛在過量乙酸胺的存在下，與乙酰丙酮和氨離子生成黃色的3,5-二乙?；?1,4-二氫吡啶化合物。在波長415nm 處有最大吸收，顏色的深淺與甲醛的含量成正比，相應(yīng)可得出試樣中甲醛的含量。4.6.2 試劑4.6.2.1 乙酰丙酮溶液：稱取0.4g新蒸餾乙酰丙酮和25g 乙酸銨、3 mL乙酸溶于水中，定容至200mL 備用。（用時(shí)配制）GB/T 5009.49-2003 4.6.2.2 百分之36-百分之35甲醛。4.6.2.3 0.1000 mol/L 硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液。4.6.2.4 0.1 mol/L 碘標(biāo)準(zhǔn)溶液。4.6.2.5

46、50g/L 淀粉指示劑。4.6.2.6 1 mol/L 硫酸溶液。4.6.2.7 1 mol/L 氫氧化鈉溶液。4.6.2.8 200 g/L 磷酸溶液。4.6.2.9 甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和標(biāo)定：吸取百分之36-百分之38甲醛溶液7.0 mL，加人0.5mL 1 mol/ L硫酸，用水稀釋至250 mL 。吸此溶液10.0mL于100mL容量瓶中，加水稀釋定容。再吸10.0 mL稀溶液于250 mL 碘量瓶中，加90mL水；20mL 0.1 mol/L的碘溶液和15mL 1mol/L 氫氧化鈉溶液，搖勻，放置15 min 。再加人20mL 1 mol/L 硫酸溶液酸化，用0.1000 mol/

47、L 硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至淡黃色，然后加約1mL 5 g/L 淀粉指示劑，繼續(xù)滴定至藍(lán)色褪去即為終點(diǎn)。同時(shí)做試劑空白試驗(yàn)。甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度按式（l）計(jì)算：X 等于（V1-V2） X c1 X 15 （1） 式中：X 甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，單位為毫克每毫升（mg/mL）； V1 空白試驗(yàn)所消耗的硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，單位為毫升（mL）； V2 滴定甲醛溶液所消耗的硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，單位為毫升（mL） , c1 硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，單位為摩爾每升（mol/L）； 15 與1.0mL 碘標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.000 mol/L）相當(dāng)?shù)募兹┑馁|(zhì)量，單位為毫克（mg）。用上述己標(biāo)定甲醛濃度的

48、溶液，用水配制成含甲醛1 ug/mL 的甲醛標(biāo)準(zhǔn)使用液。4.6.3 儀器4.6.3.1 分光光度計(jì)4.6.3.2 水蒸氣蒸餾裝置。4.6.3.3 500mL 蒸餾瓶。4.6.4 分析步驟4.6.4.1 試樣處理吸取已除去二氧化碳的啤酒25mL 移入500mL 蒸餾瓶中，加20mL 200 g/L 磷酸溶液于蒸餾瓶，接水蒸氣蒸餾裝置中蒸餾，收集餾出液于100mL容量瓶中（約100mL）冷卻后加水稀釋至刻度。4.6.4.2 測定精密吸取0.00 , 0.50 , 1.00 , 2.00 , 300 , 4.00 , 8.00 ml , l ug/mL的甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液于25mL比色管中，加水至10mL

49、 。吸取樣品餾出液10mL移入25mL比色管中。標(biāo)準(zhǔn)系列和樣品的比色管中，各加人2mL乙酰丙酮溶液，搖勻后在沸水浴中加熱10 min ，取出冷卻，于分光光度計(jì)波長420nm 處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出試樣的含量。4.6.5 結(jié)果計(jì)算見式（2）： X 等于 A/V（2）式中：X 試樣中甲醛的含量，單位為毫克每升（mg/L）； A 從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出的相當(dāng)?shù)募兹┑馁|(zhì)量，單位為微克（ug）； V 測定樣液中相當(dāng)?shù)脑嚇芋w積，單位為毫升（mL）。土壤微生物測定方法1 微生物純培養(yǎng)傳統(tǒng)的土壤生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落多樣性及結(jié)構(gòu)分析大多是將微生物進(jìn)行分離培養(yǎng)，然后通過一般的生物化學(xué)性狀，或者特定

50、的表現(xiàn)型來分析，局限于從固體培養(yǎng)基上分離微生物。隨著人們對土壤中微生物的原位生存狀態(tài)研究，越來越發(fā)現(xiàn)常規(guī)的分離培養(yǎng)方法很難全面地估價(jià)微生物群落多樣性。從土壤中簡單提取和平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)不能得到土壤微生物在土壤生態(tài)系統(tǒng)中的生活特征和生態(tài)功能1的信息。純培養(yǎng)方法和原理大多從醫(yī)藥微生物引過來的，有些方法對土壤微生物研究并不很適合，譬如在自然土壤生態(tài)環(huán)境下許多土壤微生物處于貧營養(yǎng)，而在實(shí)驗(yàn)室用營養(yǎng)豐富的牛肉汁蛋白胨來測定土壤活細(xì)菌的總數(shù)，大量的貧營養(yǎng)微生物不適宜生長，測定結(jié)果誤差大；一般實(shí)驗(yàn)室在分離培養(yǎng)土壤細(xì)菌時(shí)通常只是在28 下培養(yǎng)。盡管土壤中存在高溫型細(xì)菌，但土壤中的低溫型細(xì)菌則被忽視了。由于傳統(tǒng)的平

51、板培養(yǎng)方法只能反映極少數(shù)微生物的信息，這些研究不能充分了解土壤微生物生態(tài)功能，也埋沒了大量有很大應(yīng)用價(jià)值的微生物資源。2 土壤酶用生物化學(xué)技術(shù)能快速地檢測土壤酶活性，使土壤酶學(xué)研究在60年代后期至80年代比較熱門，其中尿酶2、磷酸酶3、脫氫酶4在土壤中的含量和變化規(guī)律研究較多。但土壤酶測定方法用于土壤微生物研究的一個(gè)致命弱點(diǎn)是不能直接的反映土壤實(shí)際微生物狀況。Visser 等對酶檢測用于土壤微生物群落和土壤質(zhì)量評價(jià)提出了懷疑5。Skujins(1978)認(rèn)為脫氫酶本身的生物化學(xué)特征決定了它不可能以胞外酶狀態(tài)存在于土壤中6。為了解決土壤酶測定中的評判問題，Beck（1984）提出了土壤微生物如微

52、生物量（microbialbiomass）、還原酶（reductase）、水解酶（hydrolase）的適宜指標(biāo)，然而，這些指標(biāo)從來沒有被廣泛采用。Beck（1984）和Trasar-Cepeda et al.（1998）認(rèn)為把酶用于土壤質(zhì)量評價(jià)指標(biāo)是值得懷疑的，而且缺乏常規(guī)可行的酶測定手段，存在藥品昂貴等問題7，8。Community-level physiological profiling (CLPP)是由Garland and Mills （1991）提出的另一種酶分析方法9，微生物群落降解95種不同單一碳源的能力可一次分析，其中BIOLOG GN微平板較多應(yīng)用于研究土壤和環(huán)境微生物區(qū)

53、系。作者采用BIOLOG GN微平板培養(yǎng)分析施用生態(tài)有機(jī)肥對土壤微生物多樣性和番茄青枯病的影響，結(jié)果表明，連作地施用生態(tài)有機(jī)肥后，番茄青枯病顯著降低，土壤微生物多樣性顯著提高10。由于真菌、放線菌的代謝反應(yīng)不能分解四氮疊茂，此方法只能檢測微生物群落細(xì)菌（主要是革蘭氏陰性菌）中快速生長的那部分微生物信息。不同的微生物對同一碳源的利用能力是有差異的，微生物對不同單一碳源的代謝指紋差異并不能簡單地歸納為微生物群落數(shù)量和結(jié)構(gòu)的差異，而且土壤微生物在BIOLOG系統(tǒng)中生長時(shí)，由于溫育環(huán)境的改變引起微生物對碳底物實(shí)際利用能力的改變，同時(shí)在溫育過程中存在適應(yīng)性問題如代謝補(bǔ)償、代謝適應(yīng)等。但CLPP方法因快速

54、、簡便而受到人們的歡迎，因而有專用于土壤和環(huán)境微生物生態(tài)研究的生態(tài)微平板（EcoPlates）（Insam，1997）11。土壤酶測定方法至今沒有一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的參數(shù)和測定標(biāo)準(zhǔn)，不能對土壤微生物生態(tài)功能一個(gè)準(zhǔn)確的答案，若要充分分析土壤特征，了解不同土壤之間的差異，一定要與其他的方法相配合。3 流（fluxs）土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中庫（pool）和流的一個(gè)巨大的原動(dòng)力。土壤酶測定一般要在適宜的條件下測定，不能作為土壤物流的原位評價(jià)。庫和流的計(jì)算對土壤微生物學(xué)家來說很重要，測定土壤微生物呼吸（CO2的釋放量），是較好的微生物群落總代謝活性指標(biāo)12。N、NO3輸入引起土壤酸化，甚至引起地下水的N污染。

55、氮的分配（N2O、NO等）對氣候變化和臭氧層破壞有極大影響，生物固氮對緩解矛盾有重要的意義，同時(shí)也提高農(nóng)作物產(chǎn)量和減少人類饑餓。從1970年以來，共生和非共生固氮研究很熱烈。土壤微生物學(xué)家應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)在轉(zhuǎn)基因作物和轉(zhuǎn)基因工程菌方面研究，大大提高了生物固氮效果。許多傳統(tǒng)方法，如N礦化測定，硝化潛力或用于反硝化測定的乙炔抑制方法仍然廣泛使用。應(yīng)用15N放射性標(biāo)記方法可詳細(xì)地了解土壤中或土壤微生物群落中的N分配和去向。土壤具有復(fù)雜的空間異質(zhì)性，大多數(shù)養(yǎng)分流測定方法不適于田間測定，局限于實(shí)驗(yàn)室模擬，目前有較好的地理信息系統(tǒng)軟件來統(tǒng)計(jì)和分析這些數(shù)據(jù)。Bruckner等（1999）測定土壤理化和生物

56、指標(biāo)，研究了溫帶松果類森林土壤的的空間差異，發(fā)現(xiàn)土壤中某些養(yǎng)分轉(zhuǎn)化過程需要在一定的生態(tài)點(diǎn)進(jìn)行，如僅在一定團(tuán)粒粒級范圍內(nèi)進(jìn)行13。Rasiah等（1999）研究發(fā)現(xiàn)不同農(nóng)業(yè)措施會引起土壤緊實(shí)度、質(zhì)地和有機(jī)質(zhì)特性變化14。Stenberg等（1998）研究26種不同性質(zhì)土壤的微生物狀況，也證明土壤有巨大的異質(zhì)性15。4 庫(pools)在生物地球化學(xué)循環(huán)中，常用“庫”表示物質(zhì)在生態(tài)系統(tǒng)中的滯留，生物量（如植物根系和動(dòng)物區(qū)系生物量）和其它有機(jī)物（動(dòng)植物凋謝物，土壤有機(jī)質(zhì)）都是土壤生態(tài)系統(tǒng)最重要的“庫”。土壤微生物生物量和土壤微生物區(qū)系、土壤呼吸強(qiáng)度、土壤酶活性、土壤微生物多樣性等，常被研究者進(jìn)行比較

57、研究。隨著研究的深入，土壤學(xué)者發(fā)展了一系列的土壤微生物量測定方法，如直接鏡檢法、ATP分析法、熏蒸培養(yǎng)法、熏蒸提取法、底物誘導(dǎo)呼吸法。其中直接鏡檢法是在顯微鏡下計(jì)數(shù)一定面積下的微生物個(gè)數(shù)、體積及密度（一般采用1.18 g/cm3），計(jì)算出單位干土質(zhì)量中所含的微生物生物量。該法的主要缺陷是技術(shù)難度大，誤差大，操作復(fù)雜、不適合批量分析。Jenkinson（1976）提出了一種間接微生物量測定方法，即氯仿熏蒸殺死和溶解土樣中微生物，重新培養(yǎng)土壤10 d，然后測定土壤呼吸。根據(jù)熏蒸與未熏蒸土樣釋放CO2量的差值，計(jì)算土壤微生物量C，此方法稱為熏蒸培養(yǎng)法（fumigationincubation，F(xiàn)I）

58、16。但測定要花10 d，不適用于風(fēng)干土樣，對鈣質(zhì)土、淹水土壤，其結(jié)果均不可靠。Brookes et al.（1982，1985）提出了一種更直接的估計(jì)微生物P、N的方法（FE），土樣經(jīng)氯仿熏蒸后，用硫酸鉀溶液浸提，從而測定微生物P、N，也可測定微生物C、S。此方法是目前較好的微生物量測定方法，F(xiàn)E方法針對不同的土壤、不同的要素制定不同的參數(shù)，這些參數(shù)的確定要慎重。此方法適合批量測定，適用土壤范圍廣，但值得一提的是熏蒸后氯仿必須被抽盡，否則，氯仿本身的C素被作為微生物C提取，使結(jié)果偏高。Anderson and Domsch（1978）提出了另一種微生物分析方法底物誘導(dǎo)呼吸方法（substra

59、te-induced respiration，SIR）17，此方法起源于純培養(yǎng)研究，微生物對易利用底物的反映強(qiáng)度與微生物量存在線性關(guān)系，可用于土壤微生物量的測定。但計(jì)算參數(shù)目前還存在爭議18。目前FE和SIR方法作為一些國家（如德國）土壤普查的標(biāo)準(zhǔn)方法。生態(tài)系統(tǒng)演替過程中的能量最優(yōu)化性是生態(tài)系統(tǒng)進(jìn)化的Odum理論的主要精髓（Odum，1969）11，根據(jù)此理論，系統(tǒng)的成熟程度增加，生態(tài)系統(tǒng)的呼吸效率/生物量的比值隨之相應(yīng)降低。既然所有初級生產(chǎn)力C最終都進(jìn)入土壤C庫，土壤微生物庫的大小可作為土壤質(zhì)量的一個(gè)可靠指標(biāo)；可用于土壤長期和短期的養(yǎng)分動(dòng)力學(xué)研究，其中微生物生物量是強(qiáng)有力的指標(biāo)，它具有快速、

60、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)；可通過微生物總量比較而認(rèn)識農(nóng)業(yè)措施和污染對土壤質(zhì)量的影響；但它仍存在缺陷，只能反映部分功能和專性微生物，在一定程度上土壤生態(tài)系統(tǒng)物流能流或者微生物群落庫的組成需進(jìn)一步詳細(xì)調(diào)查。5 生物標(biāo)記物（biomakers）盡管企圖測定庫和流來反映土壤微生物狀況，但土壤及其微生物仍是一個(gè)黑箱，只有少量的窗口（如可分離、培養(yǎng)、鑒定的微生物）打開，其微生物總量和物流的決定因子還不清楚。不同的生物體，其細(xì)胞壁和原生質(zhì)的組成成分不一樣，通過測定土壤中某些特有成分的含量，就有可能估價(jià)出土壤中微生物的生物量，如Jenkinson and Ladd指出22，所測定的成分必須符合4個(gè)條件，才能用于估算土壤