《基因組學(xué)》課件第11章 生物芯片技術(shù)-2015

1、第11章生物芯片蛋白質(zhì)二維凝膠電泳（2-D-gel）生物芯片（Biochip）技術(shù)生物芯片是信息時代的產(chǎn)物橫跨：生命科學(xué)、 物理學(xué)、 計(jì)算機(jī)科學(xué)、微電子技術(shù)光電技術(shù)、 材料科學(xué)等現(xiàn)代高技術(shù)。“人類基因組計(jì)劃”的迫切需求： 30億個堿基對、幾萬個基因的信息分析理想的解決方案 生物芯片：新的快速價廉的基因測序和功能研究方法1992年第一張基因芯片：美國Affymetrix（全球唯一擁有成熟的商品化的高密度芯片制造技術(shù)的公司），半導(dǎo)體照相平板技術(shù)和光脫保護(hù)原位合成技術(shù)（專利），已知序列的基因集成到硅片表面，批量處理一、生物芯片簡介發(fā)展歷史1995年第一張以玻璃為載體的基因芯片： Stanford大學(xué)

2、P.Brown實(shí)驗(yàn)室，將cDNA密集點(diǎn)樣在玻璃片上，進(jìn)行基因表達(dá)譜研究和SNP分析1996年第一張實(shí)用型基因芯片：Affymetrix，首批實(shí)用型DNA芯片及其成套系統(tǒng)，由此引發(fā)了繼工業(yè)革命、信息技術(shù)革命后的第三次基因組革命 此后系列生物芯片相繼問世：噴墨點(diǎn)樣芯片、寡核苷酸點(diǎn)樣芯片、蛋白原位合成以及多肽點(diǎn)樣芯片、細(xì)胞和組織芯片、芯片實(shí)驗(yàn)室、液相芯片等一、生物芯片簡介發(fā)展歷史基因芯片發(fā)展歷史Southern & Northern BlotDot BlotMacroarrayMicroarray一、生物芯片簡介生物芯片(Biochips)是將大量生物識別分子按預(yù)先設(shè)置的排列固定于一種支持物（如硅片

3、、玻片及高聚物載體等）表面，利用與被標(biāo)記的樣品生物分子的特異性親和反應(yīng)（分子雜交）來分析樣品中靶分子存在的量的一種技術(shù)。一、生物芯片簡介“探針”：載玻片或尼龍膜的表面原位合成寡核苷酸（DNA或cDNA以高密度點(diǎn)陣固定排列在經(jīng)處理過的載玻片或尼龍膜的表面）“樣品”：標(biāo)記了熒光或同位素待測靶分子DNA、cDNA或RNA、蛋白質(zhì)或多肽一、生物芯片簡介工作原理：生物分子之間特異性的相互作用。如DNA-DNA、DNA-RNA、抗原-抗體、受體-配體之間可發(fā)生的復(fù)性與特異性結(jié)合。 設(shè)計(jì)一方為探針，并固定在微小的載體表面，通過分子之間的特異性反應(yīng)，檢測另一方的有無、多少、結(jié)構(gòu)改變等。一、生物芯片簡介二、生物

4、芯片的分類 基因芯片（DNA芯片）：將DNA分子固定于支持 物上，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對，與被標(biāo)記的樣品分 子雜交、檢測和分析。 蛋白質(zhì)芯片：蛋白質(zhì)在載體上的有序排列，依 據(jù)蛋白質(zhì)之間相互作用的原理進(jìn)行雜交、檢測 和分析。 芯片實(shí)驗(yàn)室：將一個實(shí)驗(yàn)的各個步驟微縮于一 個芯片上。二、生物芯片的分類二、生物芯片的分類芯片實(shí)驗(yàn)室（Lab-on-a-chip）或稱微全分析系統(tǒng)（Micro Total Analysis System， or microTAS）是指把生物和化學(xué)等領(lǐng)域中所涉及的樣品制備、生物與化學(xué)反應(yīng)、分離檢測等基本操作單位集成或基本集成于一塊幾平方厘米的芯片上，用以完成不同的生物或化學(xué)反應(yīng)過程，

5、并對其產(chǎn)物進(jìn)行分析的一種技術(shù)。功能化芯片實(shí)驗(yàn)室大體包括三個部分：芯片；分析儀，包括驅(qū)動源和信號檢測裝置；含有實(shí)現(xiàn)芯片功能化方法和試劑盒。三、基因芯片的原理 基因芯片技術(shù)是建立在Southern blot基礎(chǔ)之上的，可以說它是Southern blot的改進(jìn)和發(fā)展，它的原理是：變性DNA 加入探針后在一定溫度下退火，同源片段之間通過堿基互補(bǔ)形成雙鏈雜交分子。S； DNA-DNA/RNA； N：RNA-DNA/RNA；W：Protein-protein/DNA E:蛋白質(zhì)翻譯后修飾的雜交基因芯片的基本原理與Southern blot技術(shù)一脈相承基因芯片技術(shù)是基因功能研究領(lǐng)域的一次革命，是生命科學(xué)研

6、究領(lǐng)域中新近出現(xiàn)的一項(xiàng)嶄新技術(shù)。與Southern blot相比較，基因芯片具有高密度、高通量、并行性、微量化、自動化的特點(diǎn)?；蛐酒cSouthern blot的比較大規(guī)模基因功能研究四、生物芯片的操作流程制備總RNA mRNA經(jīng)RT-PCR用Cy3（正常對照組）和Cy5（實(shí)驗(yàn)組）熒光標(biāo)記目的基因，得到cDNA探針混合標(biāo)記探針與表達(dá)譜芯片上核苷酸片段（或基因）雜交掃描分析雜交結(jié)果結(jié)論基因芯片技術(shù)主要包括四個基本要點(diǎn)：芯片方陣的構(gòu)建樣品的制備生物分子反應(yīng)信號的檢測 1）支持物的預(yù)處理實(shí)性材料：硅芯片、玻片和瓷片需進(jìn)行預(yù)處理，使其表面衍生出羥基、氨基活性基團(tuán)。膜性材料：聚丙烯膜、尼龍膜、硝酸纖維

7、膜通常包被氨基硅烷或多聚賴氨酸目的：使探針分子固定并保持構(gòu)象自然1、芯片的制備四、生物芯片的操作流程2) 芯片的制備合成后點(diǎn)樣：預(yù)先合成DNA或制備基因探針然后打印到芯片上。1、芯片的制備四、生物芯片的操作流程原位合成：由點(diǎn)樣系統(tǒng)將探針的組成部分逐步轉(zhuǎn)移到支持物上，同時實(shí)現(xiàn)探針的合成與轉(zhuǎn)移。樣品的分離純化DNA , mRNA，蛋白質(zhì)標(biāo)記等過程熒光標(biāo)記（常用Cy3、Cy5），生物素、放射性標(biāo)記2、樣品的準(zhǔn)備三、生物芯片的操作流程樣品與DNA芯片上的探針陣列進(jìn)行雜交。與經(jīng)典分子雜交的區(qū)別：雜交時間短，30分鐘內(nèi)完成可同時平行檢測許多基因序列影響雜交反應(yīng)的因素：鹽濃度、溫度、反應(yīng)時間、DNA二級結(jié)構(gòu)

8、等3、分子雜交四、生物芯片的操作流程Affymetrix 640雜交儀激光激發(fā)使含熒光標(biāo)記的DNA片段發(fā)射熒光激光掃描儀或激光共聚焦顯微鏡采集各雜交點(diǎn)的信號軟件進(jìn)行進(jìn)行圖象分析和數(shù)據(jù)處理4、檢測分析四、生物芯片的操作流程GenearrayTM掃描儀1、DNA測序：雜交測序（SBH）五、生物芯片的應(yīng)用一組寡核苷酸探針TATGCAATCTAGCGTTAGATACGTTAGAATACGTTAGATCTACGTTAG由雜交位置確定的一組核酸探針序列GTTAGATC雜交探針組TATGCAATCTAG重組的互補(bǔ)序列靶序列TACGTTAGACGTTAGAATACGTTACGTTAGATGTTAGATC AT

9、ACGTTA2、基因表達(dá)分析五、生物芯片的應(yīng)用3、基因診斷：尋找和檢測與疾病相關(guān)的基因及在RNA水平上檢測致病基因的表達(dá)五、生物芯片的應(yīng)用4、藥物研發(fā)：尋找藥物靶分子五、生物芯片的應(yīng)用 在基因功能研究基礎(chǔ)上，特別是確立了與某些疾病相關(guān)基因的表達(dá)變化情況后，就可針對疾病發(fā)生機(jī)理進(jìn)行藥物篩選工作。 將這些基因特異性片段固定在芯片上，研究病變組織和正常組只在某些藥物刺激下這些基因表達(dá)的變化，可快速判斷藥物作用的效果，并進(jìn)行高通量篩選（high throughout screening），可使新藥開發(fā)獲得技術(shù)上的突破。生物芯片的主要特點(diǎn)：高通量微型化自動化加快實(shí)驗(yàn)進(jìn)程、利于顯示圖譜的快速對照和閱讀減少試劑用量和反應(yīng)液體積，提高樣品濃度和反應(yīng)速率降低成本，保證質(zhì)量 生物芯片的發(fā)展趨勢：微型化：DNA矩陣越來