《基因組學(xué)》課件第7章 PCR技術(shù)及其相關(guān)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用-2015

1、1第7章PCR技術(shù)及其發(fā)展和應(yīng)用鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院馬珊珊目錄PCR技術(shù)簡(jiǎn)介PCR技術(shù)的衍生技術(shù)實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)PCR技術(shù)的應(yīng)用3一、PCR技術(shù)簡(jiǎn)介聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction, PCR）是一種模擬天然DNA復(fù)制過程的核酸體外擴(kuò)增技術(shù)。它是在體外條件下，利用DNA聚合酶通過多次循環(huán)的合成反應(yīng)催化一端特異DNA片段的合成。1.PCR的基本原理和步驟 The Nobel Prize in Chemistry 1993 for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) methodMullis F

2、4一、PCR技術(shù)簡(jiǎn)介1.PCR的基本原理和步驟（1）變性（denaturation）：模板DNA經(jīng)熱變性，雙鏈被解開，成為兩條單鏈。（2）退火（annealing）：溫度下降，變性DNA復(fù)性，使寡核苷酸引物即與模板DNA中所要擴(kuò)增序列兩端的堿基配對(duì)。（3）延伸（extension）： 在適宜條件下（包括DNA聚合酶和核苷酸單體），引物3 端向前延伸，合成與模板堿基序列完全互補(bǔ)的DNA鏈。PCR類似于體內(nèi)DNA復(fù)制過程。變性、退火和延伸。PCR Cycle Step1變性（95 ）Target SequenceTarget Sequence模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93左右一定時(shí)間后，

3、使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；Target SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 253553533模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；PCR Cycle Step2退火（低溫 ）Target SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 253553533Taq DNAPolymerase引物的延伸：模板-引物結(jié)合物在DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模

4、板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA互補(bǔ)的鏈。PCR Cycle Step3延伸（72 ）End of the 1st PCR Cycle Results in two copies of target sequenceTarget SequenceTarget SequenceTarget AmplificationNo. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target121=2222=4323=8424=16525=326 26=6420 220302301 cycle = 2 Amplicon2 cycle = 4 Amplicon3 cy

5、cle = 8 Amplicon4 cycle = 16 Amplicon5 cycle = 32 Amplicon6 cycle = 64 Amplicon7 cycle = 128 Amplicon10一、PCR技術(shù)簡(jiǎn)介2.PCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)條件：10X緩沖液 10 L4種dNTP混合物 各200umol/LTaq DNA聚合酶 2.5UMg2+ 1.5mmol/L引物 各10100pmol模板DNA 0.12g水 補(bǔ)足體積2Mix11一、PCR技術(shù)簡(jiǎn)介2.PCR反應(yīng)12一、PCR技術(shù)簡(jiǎn)介2.PCR反應(yīng)131234522557294時(shí)間（min）溫度（）適溫延伸3高溫變性1低溫退火

6、2重復(fù)13步2530輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA95一、PCR技術(shù)簡(jiǎn)介2.PCR反應(yīng)14PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)9550引物1引物2DNA引物15PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)50引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶16PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72第1輪結(jié)束95第2輪開始17PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)955072TaqTaqTaqTaq18PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72第2

7、輪結(jié)束19PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)重復(fù)30輪后230=1,073,741,824模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增理想拷貝數(shù)=2n n 循環(huán)次數(shù)實(shí)際拷貝數(shù)=(1+x)n X 平均效率,約為0.85 n 循環(huán)次數(shù) 20 PCR產(chǎn)物的積累規(guī)律示意圖21靈敏度高皮克(pg=10-12)量級(jí)擴(kuò)增到微克(ug=10-6)水平簡(jiǎn)便、快速一次性加好反應(yīng)液，24 小時(shí)完成擴(kuò)增對(duì)標(biāo)本的純度要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等組織的粗提DNA一、PCR技術(shù)簡(jiǎn)介2.1 PCR反應(yīng)的特點(diǎn)CK(ul)1#(ul)模板01引物10.50.5引物2

8、0.50.510 PCR Buffer22Taq酶0.20.2dNTPs0.50.5ddH O216.315.3Total2020（1）在0.2 ml PCR管內(nèi)配置20ul反應(yīng)體系：一、PCR技術(shù)簡(jiǎn)介2.2 PCR反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)步驟（2）PCR反應(yīng)程序(1) 94變性5min，(2) 94變性1min，(3) 52 退火1min，(4) 72 延伸1min。(5) 72 延伸10min。(6) 4 保存。重復(fù)(2)-(4)30次一、PCR技術(shù)簡(jiǎn)介2.2 PCR反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)步驟PCR結(jié)果：1、對(duì)照(無模板)；26、PCR產(chǎn)物（5ul樣品）（3）PCR產(chǎn)物的電泳鑒定一、PCR技術(shù)簡(jiǎn)介2.2 PCR反應(yīng)

9、的實(shí)驗(yàn)步驟Lambda DNA，模板量分別為100 pg, 10pg, 1pg, 100fg , 10fg25一、PCR技術(shù)簡(jiǎn)介3. PCR的影響因素3.1 DNA模板單、雙鏈DNA均可，多種來源。質(zhì)量要求不高，但不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。一般人基因組100 ng DNA模板（100L）。模板濃度過高會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。26一、PCR技術(shù)簡(jiǎn)介3.2 引物27一、PCR技術(shù)簡(jiǎn)介3.2 引物引物設(shè)計(jì)的原則：引物長(zhǎng)度在1530堿基。引物中堿基的分布是隨機(jī)的，G+C含量宜在4555左右。引物內(nèi)部避免形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)；引物間避免形成二聚體。引物3端為關(guān)鍵堿基；5端無

10、嚴(yán)格限制引物的特異性，避免在模板內(nèi)存在較高的相似性序列。28一、PCR技術(shù)簡(jiǎn)介3.2 引物引物設(shè)計(jì)的常用軟件：Primer Premier 5.0Oligo 6primer 5The Primer GeneratorNet Primer1. 將序列輸入軟件中（2）在表中粘貼序列（1）新序列兩個(gè)方法選擇序列文件所在位置（2）打開原有的序列文件在對(duì)話框中輸入待擴(kuò)增序列點(diǎn)擊左上角的“Primer”按鈕2. 設(shè)置相關(guān)參數(shù)3. 得到的引物結(jié)果Hairpin: 引物自身是否會(huì)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)Dimer: 同一種引物是否會(huì)形成二聚體False primiring: 引物在待擴(kuò)增序列中其他位置是否有配對(duì)Cross

11、 Dimer: 正向與反向引物間是否會(huì)形成二聚體正向和反向引物的評(píng)價(jià)正向和反向引物的信息每點(diǎn)擊左邊紅色的按鈕，就出現(xiàn)相應(yīng)的內(nèi)容對(duì)正向和反向引物進(jìn)行編輯正向和反向引物的互換可對(duì)引物進(jìn)行增加或減少堿基用鍵盤輸入5個(gè)堿基引物的信息改動(dòng)后引物的信息重新回到雙引物的界面“Edit”“Copy”“Sense Primer”5 CGCCTCGAGAAAAGACAGGACTCCACCTCA 34. 輸出引物序列39一、PCR技術(shù)簡(jiǎn)介3.3 耐熱DNA聚合酶1）Taq DNA聚合酶（Taq polymerase） ：95的半衰期為40min，最適溫度（72）時(shí)每個(gè)酶分子每秒可催化合成150個(gè)核苷酸。酶活性（受多

12、種因素影響）：53方向的聚合酶活性，53方向的外切酶活性和逆轉(zhuǎn)錄酶活性，非模板依賴性活性，使PCR產(chǎn)物的3端突出一個(gè)單A核苷酸尾40Tth DNA聚合酶：用于一步法RT-PCR。Vent DNA聚合酶：其保真性較Taq DNA聚合酶高一倍。該酶擴(kuò)增長(zhǎng)片斷（12kb）的功能較強(qiáng)。Pfu DNA聚合酶：其保真性比Taq聚合酶高12倍，是已知的保真性最高的聚合酶。但不適于2kb的片斷擴(kuò)增。2）其他的耐熱聚合酶一、PCR技術(shù)簡(jiǎn)介3.3 耐熱DNA聚合酶41一、PCR技術(shù)簡(jiǎn)介3.4 dNTPdNTP濃度取決于擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度，四種dNTP濃度應(yīng)相等 濃度過高易產(chǎn)生錯(cuò)誤堿基的摻入，濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量，終

13、濃度一般在100-200uM。 dNTP可與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性。42一、PCR技術(shù)簡(jiǎn)介3.5 Mg2+濃度 Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。 0.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系。 Mg2+濃度過低會(huì)使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降；Mg2+過高影響反應(yīng)特異性。 Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合，所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。43一、PCR技術(shù)簡(jiǎn)介3.6 反應(yīng)參數(shù)（1）變性：90-95 ，30-60s（2）退火：溫度由引物長(zhǎng)度和GC含量決定。一般30s即可。（3）延伸：一般72 ，延伸時(shí)間由擴(kuò)增片段長(zhǎng)度決定，

14、一般1kb/min.（4）循環(huán)次數(shù)：主要取決于模板DNA的濃度，一般為25-35次。44一、PCR技術(shù)簡(jiǎn)介4. PCR產(chǎn)物的檢測(cè)瓊脂糖凝膠電泳：最常用的方法。分辨率高，可測(cè)出1ng DNA。聚丙烯酰胺凝膠電泳：靈敏度比瓊脂糖凝膠電泳高，主要用于分離小于1kb的片段，因此特別適用于合成的片段的分離和檢測(cè)。層析技術(shù)：廣泛應(yīng)用于DNA的合成及其擴(kuò)增后的分離純化。分子雜交：包括點(diǎn)雜交和Southern印跡雜交。45二、PCR技術(shù)的衍生技術(shù)逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）反向PCR（inverse PCR）巢氏PCR（nesting PCR）原位PCR（i

15、n situ PCR）突變PCR（mutation PCR）多重等位基因PCR（multiplex allele PCR）不對(duì)稱PCR（asymmertric PCR）實(shí)時(shí)定量PCR（real time PCR）二、PCR技術(shù)的衍生技術(shù)47二、PCR技術(shù)的衍生技術(shù)1.逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR) RT-PCR是擴(kuò)增RNA的PCR反應(yīng)，包括兩個(gè)步驟：在單引物的介導(dǎo)下以RNA為模板利用逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成RNA的互補(bǔ)鏈cDNA，即逆轉(zhuǎn)錄。以cDNA為模板，在特異性引物引導(dǎo)下，擴(kuò)增合成靶DNA分子，即普通PCR。48二、PCR技術(shù)的衍生技術(shù)1.逆轉(zhuǎn)錄

16、PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)49二、PCR技術(shù)的衍生技術(shù)1.逆轉(zhuǎn)錄PCR的應(yīng)用測(cè)定基因表達(dá)的強(qiáng)度鑒定已轉(zhuǎn)錄序列是否發(fā)生突變,呈現(xiàn)mRNA多態(tài)性,克隆mRNA的5和3末端序列，從非常少量的mRNA樣品構(gòu)建大容量的cDNA文庫(kù)。50二、PCR技術(shù)的衍生技術(shù)1.逆轉(zhuǎn)錄PCR的影響因素（1）模板對(duì)RT-PCR的影響對(duì)RNA制品的純度和完整性要求都極為嚴(yán)格。RNA分子必需完整，其次RNA樣品中不能含有DNA、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。（2）逆轉(zhuǎn)錄酶對(duì)RT-PCR的影響MLV逆轉(zhuǎn)錄酶能合成大于2kb的較長(zhǎng)cDNA，但對(duì)熱的穩(wěn)定 性較AMV逆轉(zhuǎn)錄酶差。51（3）逆轉(zhuǎn)錄引物

17、對(duì)RT-PCR的影響 隨機(jī)引物：原核細(xì)胞多用， 6-10bp，含有四種堿基的任意組合，可在RNA多個(gè)位點(diǎn)與之結(jié)合，引導(dǎo)合成長(zhǎng)短不一的cDNA。 oligo(dT)：真核細(xì)胞多用， 12-18bp的oligo(dT)與真核生物的mRNA的polyA尾巴特異結(jié)合，引導(dǎo)全長(zhǎng)mRNA的合成?；蛱禺愋缘囊?GSP)：特異性強(qiáng)，廣譜性低， GSP一次只針對(duì)一個(gè)基因，不適合多基因檢測(cè)或表達(dá)差異比較的研究。二、PCR技術(shù)的衍生技術(shù)1.逆轉(zhuǎn)錄PCR的影響因素52二、PCR技術(shù)的衍生技術(shù)1.逆轉(zhuǎn)錄PCR-舉例RNA提取RT-PCR電泳分析53二、PCR技術(shù)的衍生技術(shù)2.反向PCR（inverse PCR） 用

18、反向的互補(bǔ)引物來擴(kuò)增兩引物以外的DNA片段，對(duì)某個(gè)已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增。已知序列未知序列未知序列54已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶連接酶二、PCR技術(shù)的衍生技術(shù)2.反向PCR（inverse PCR）55探索鄰接已知DNA片段的序列；用于僅知部分序列的全長(zhǎng)cDNA的克隆-RACE；建立基因組步移文庫(kù)-Gene Walking。56二、PCR技術(shù)的衍生技術(shù)2.反向PCR（inverse PCR）應(yīng)用：（1）用于測(cè)序的DNA大片段的克?。?）獲得啟動(dòng)子序列（3）小質(zhì)粒的定點(diǎn)突變（4）鑒定插入失活基因或體內(nèi)誘導(dǎo)基因57二、PCR技術(shù)的衍生技術(shù)3.巢式PCR（Nest PCR）

19、巢式PCR是一種變異的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，使用兩對(duì)（而非一對(duì)）PCR引物擴(kuò)增完整的片段。第一對(duì)PCR引物擴(kuò)增片段和普通PCR相似。第二對(duì)引物稱為巢式引物（因?yàn)樗麄冊(cè)诘谝淮蜳CR擴(kuò)增片段的內(nèi)部）結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴(kuò)增片段短于第一次擴(kuò)增。5859巢式PCR的優(yōu)點(diǎn)：特異性高。如果第一次擴(kuò)增產(chǎn)生了錯(cuò)誤片斷，則第二次能在錯(cuò)誤片段上進(jìn)行引物配對(duì)并擴(kuò)增的概率極低。 由于第二套引物位于第一輪PCR產(chǎn)物內(nèi)部，而非目的片斷包含兩套引物結(jié)合位點(diǎn)的可能性極小，因此第二套引物不可能擴(kuò)增非目的片斷。這種巢式PCR擴(kuò)增確保第二輪PCR產(chǎn)物幾乎或者完全沒有引物配對(duì)特異性不強(qiáng)造成的非特異性擴(kuò)增的污

20、染。60二、PCR技術(shù)的衍生技術(shù)4.突變PCR 突變是改變DNA序列的最基本的方法，用以鑒定一個(gè)基因或DNA片段的功能，研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系。主要分為： 隨機(jī)突變：在目的基因的任意位點(diǎn)引入點(diǎn)突變，建立突變文庫(kù)。 定點(diǎn)突變：在選定的位點(diǎn)對(duì)DNA序列進(jìn)行修改，主要通過引物點(diǎn)突變、堿基或小片段的插入或刪除。61（1）隨機(jī)突變：應(yīng)用：構(gòu)建突變體文庫(kù)，繼而可從中篩選出具有特殊性質(zhì)的突變個(gè)體策略：易錯(cuò)PCR（error-prone PCR）。利用Taq DNA聚合酶等耐熱DNA聚合酶不具有35校對(duì)功能的特性，在PCR擴(kuò)增反應(yīng)中可能摻入錯(cuò)誤的核苷酸，從而產(chǎn)生隨機(jī)錯(cuò)誤的擴(kuò)增產(chǎn)物。二、PCR技術(shù)的衍生技術(shù)4

21、.突變PCR62（2）定點(diǎn)突變A. 5端引入突變：通過修飾上游引物的5端，即可引入標(biāo)記的堿基、限制性酶切位點(diǎn)、啟動(dòng)子序列等。B. 序列中的單位點(diǎn)突變：采用重疊延伸PCR(Overlap Extension PCR，OE PCR)二、PCR技術(shù)的衍生技術(shù)4.突變PCR63（A）為5端引入突變 （B）為單堿基突變二、PCR技術(shù)的衍生技術(shù)（B）Site-directed Mutagenesis (Kit)65大多數(shù)大腸桿菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶，來自大腸桿菌的質(zhì)粒99發(fā)生甲基化；PCR產(chǎn)物是去甲基化的產(chǎn)物；DpnI識(shí)別甲基化位點(diǎn)并切割DNA，而去甲基化擴(kuò)增產(chǎn)物不會(huì)被降解；經(jīng)過轉(zhuǎn)化，

22、PCR產(chǎn)物鏈經(jīng)過修復(fù)形成環(huán)狀，從而完成突變 66（3）多位點(diǎn)突變策略：多次重疊PCR關(guān)鍵：重疊引物的設(shè)計(jì)（每對(duì)突變引物需要部分重疊，方向相反）。二、PCR技術(shù)的衍生技術(shù)67二、PCR技術(shù)的衍生技術(shù)5.原位PCR（in situ PCR）原位PCR是由Hasse等于1990年首創(chuàng)。 它是利用完整的細(xì)胞作為一個(gè)微小的反應(yīng)體系來擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)的目的片段。 在不破壞細(xì)胞的前提下，利用一些特定的檢測(cè)手段來檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物。 直接用細(xì)胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個(gè)細(xì)胞中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位。 適用于檢測(cè)病理切片中含量較少的靶序列。68操作步驟：1. 細(xì)胞或組織固定：細(xì)胞經(jīng)固定和乙醇通透化處理后

23、便適于一般PCR試劑（包括引物和Taq酶）進(jìn)入2. 原位PCR擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)目的片段3. 原位雜交檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物A.陽性對(duì)照B.陰性對(duì)照C.原位檢測(cè)mRNA表達(dá)二、PCR技術(shù)的衍生技術(shù)69 實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，能夠?qū)CR反應(yīng)的全過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，并且自動(dòng)化程度高，成為分子生物學(xué)領(lǐng)域不可或缺的一項(xiàng)重要技術(shù)。三、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù) 熒光定量PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)隨著PCR反應(yīng)的積累來實(shí)時(shí)監(jiān)控PCR反應(yīng)的進(jìn)程，并通過軟件對(duì)PCR反應(yīng)中起始模板進(jìn)行定量及定性的分析。 系統(tǒng)組成：定量PCR儀、電腦、分析軟件、試劑及耗材。 三、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)1.實(shí)時(shí)定量PCR

24、技術(shù)原理71 PCR擴(kuò)增時(shí)，通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。三、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)1.實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)原理72三、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)2. 常用熒光標(biāo)記試劑和方法非特異性熒光染料標(biāo)記 SYBR Green I特異性熒光探針標(biāo)記 TaqMan Probe73三、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)2.1 熒光染料 SYBR Green I是目前定量PCR最常用的一種熒光染料。SYBR Green I是一種結(jié)合于所有雙鏈DNA雙螺旋小溝中具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)的染料。

25、與雙鏈DNA結(jié)合后，其熒光大大增強(qiáng)，熒光強(qiáng)度與雙鏈DNA分子的數(shù)量有關(guān)，因此可根據(jù)熒光信號(hào)檢測(cè)出PCR反應(yīng)體系中雙鏈DNA分子的數(shù)量。SYBR Green I74熱 變 性引物退火延伸反應(yīng)三、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)2.1 熒光染料-作用機(jī)理75 使用方便，不必設(shè)計(jì)復(fù)雜 探針 具有價(jià)格優(yōu)勢(shì)優(yōu) 點(diǎn) 無模板特異性 對(duì)引物特異性要求較高 不能進(jìn)行多重定量 靈敏度相對(duì)較低缺 點(diǎn)三、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)2.1 熒光染料-優(yōu)缺點(diǎn)76三、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)2.2 熒光探針（1）Taqman探針原理 5端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter, R)，如FAM、VIC等 3端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher, Q) 探

26、針完整，R發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收，無熒光;R與Q分開，發(fā)熒光 Taq酶有53外切核酸酶活性，可水解探針77熱變性引物和探針與模板退火延伸反應(yīng)探針報(bào)告基團(tuán)淬滅基團(tuán)探針DNA聚合酶引物RRRR三、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)（1）Taqman探針工作機(jī)理78 高度特異性 重復(fù)性好 靈敏度高 可進(jìn)行多重定量?jī)?yōu) 點(diǎn) 只適合一個(gè)特定的目標(biāo) 委托公司標(biāo)記，價(jià)格較高 不易找到本底低的探針缺 點(diǎn)三、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)（1）Taqman探針優(yōu)缺點(diǎn)79三、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)2.2 熒光探針（2）其他探針 分子信標(biāo) 雙雜交探針 蝎型探針 自身淬滅熒光探針80三、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)3.實(shí)時(shí)定量PCR常用的三個(gè)概念 擴(kuò)增曲線

27、 熒光閾值 Ct值熒光基團(tuán)三、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)A、擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線的兩種形式.左圖反映的是隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行相應(yīng)的熒光信號(hào)的變化，比較直觀，但是指數(shù)期很短；右圖反映的是熒光信號(hào)的變化量的對(duì)數(shù)與PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)的關(guān)系，從右圖可知，指數(shù)期很明顯，在確定閾值線時(shí)具有簡(jiǎn)單明了的特點(diǎn)，所以很多軟件都采用右圖的形式，當(dāng)然了，這兩種實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要相互轉(zhuǎn)換。Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強(qiáng)度）基底期指數(shù)期平臺(tái)期三、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)A、擴(kuò)增曲線83在熒光定量PCR擴(kuò)增的指數(shù)期，畫一條線，在此直線上，所有樣品的熒光強(qiáng)度與其本底熒光強(qiáng)度的差值全部相同。三、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)B、閾值線84 PC

28、R擴(kuò)增過程中，各樣品擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)，所對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。三、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)C、Ct值85橫軸：PCR反映循環(huán)數(shù)縱軸：熒光信號(hào)量Ct值的特點(diǎn)：相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增，終點(diǎn)處產(chǎn)物量不恒定；Ct值極具重現(xiàn)性三、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)Ct值的重現(xiàn)性86Ct值與初始模板含量 Ct值與初始模板濃度的對(duì)數(shù)值成線性關(guān)系 初始模板量越多，C(t)值越小10610510410310210三、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)87定量原理初始 DNA量越多, 熒光達(dá)到某一值（域值）時(shí)所需要的循環(huán)數(shù)越少（Ct值）；利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，只要獲得位置樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起

29、始拷貝數(shù)（模板量）。確定初始模板的濃度三、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)三、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)4.絕對(duì)定量與相對(duì)定量的比較89絕對(duì)定量是用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線來推算未知樣品的量。將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至不同濃度，作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以測(cè)得的CT值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)未知樣品進(jìn)行定量時(shí)，根據(jù)未知樣品的CT值，即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線中得到樣品的拷貝數(shù)。絕對(duì)定量通過標(biāo)準(zhǔn)品定量902. 絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)必須用與擴(kuò)增目的基因相同的引物進(jìn)行擴(kuò)增，并且擴(kuò)增效率相同標(biāo)準(zhǔn)品必須是經(jīng)過準(zhǔn)確定量的（我們通常用的是ASP-3700紫外光/可見光微量分光光度計(jì)）標(biāo)準(zhǔn)品必須是標(biāo)準(zhǔn)化的（例如，同一化

30、的細(xì)胞數(shù)）在每組實(shí)驗(yàn)時(shí)，必須用相同的閾值設(shè)定來確定CT值標(biāo)準(zhǔn)樣品的種類： 含有目的基因的線性化的質(zhì)粒DNA 含有和待測(cè)樣品相同擴(kuò)增片段的cDNA PCR的產(chǎn)物 913. 標(biāo)準(zhǔn)品的制備根據(jù)已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒DNA，做系列稀釋。 一般一條標(biāo)準(zhǔn)曲線取四到五個(gè)點(diǎn)，濃度范圍要能覆蓋樣品的濃度區(qū)間，以保證定量的準(zhǔn)確性。一般一個(gè)點(diǎn)重復(fù)三至五次，對(duì)于常期穩(wěn)定使用的標(biāo)準(zhǔn)品可以適當(dāng)減少重復(fù)的次數(shù)。絕對(duì)定量：從熒光到拷貝數(shù)934. 實(shí)例標(biāo)準(zhǔn)品的制作：將標(biāo)準(zhǔn)品依次進(jìn)行10倍稀釋，ASP-3700 測(cè)得其拷貝數(shù)1.55108copy /ul。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制（1cycle=1min）設(shè)置對(duì)照：濃度為1.55107、1.55106、1.55105、1.55104、1.55103、1.55102、1.55101的標(biāo)準(zhǔn)樣品各一個(gè)，設(shè)空白對(duì)照PCR反應(yīng)：