雜交瘤技術(shù)和單克隆抗體技術(shù)

1、第四講 雜交瘤細(xì)胞和單克隆抗體技術(shù)第一節(jié)、免疫的基本知識一、免疫系統(tǒng)：分非適應(yīng)性免疫和適應(yīng)性免疫兩類。 1、非適應(yīng)性免疫是由非特異性反應(yīng)的細(xì)胞介導(dǎo)的。如：巨噬細(xì)胞的吞噬作用，泌細(xì)胞分泌的溶菌酶，以及中性細(xì)胞造成的細(xì)胞裂解機(jī)制。 2、適應(yīng)性免疫：是針對特定分子，而且可經(jīng)反復(fù)暴露于外源分子使之加強(qiáng)淋巴細(xì)胞合成細(xì)胞表面受體或分泌特異性蛋白結(jié)合外源分子。這些分泌的蛋白稱為抗體；可與抗體結(jié)合的分子被稱為抗原。當(dāng)一個分子被用于誘導(dǎo)適應(yīng)性反應(yīng)時，這個分子就被叫做免疫原。13、免疫系統(tǒng)含有109以上淋巴細(xì)胞遍布全身，保證了它們在任何部位都能迅速反應(yīng)。淋巴細(xì)胞由骨髓中的原始干細(xì)胞不斷產(chǎn)生，經(jīng)血液及淋巴系統(tǒng)循環(huán)，

2、暫時停頓并積聚于稱作淋巴器官的特異化的結(jié)構(gòu)中，在哺乳動物中就是淋巴結(jié)和肝臟。在免疫反應(yīng)過程中，免疫原積聚于一個淋巴器官中，這個淋巴器官就變成了免疫反應(yīng)的焦點(diǎn)。 B細(xì)胞：分泌抗體，并在細(xì)胞表面攜帶同一抗體的修飾型，功能相當(dāng)于受體。 毒性T細(xì)胞：攜帶結(jié)合抗原的細(xì)胞表面受體。 輔助T細(xì)胞：在控制B細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)方面起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。2 體液介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫反應(yīng)：體液反應(yīng)引發(fā)產(chǎn)生可結(jié)合外來抗原的循環(huán)抗體，由B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，由輔助T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)是抗體技術(shù)的基礎(chǔ)。 細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫反應(yīng)：毒性T淋巴細(xì)胞結(jié)合于外來或感染的細(xì)胞，隨后將這些細(xì)胞裂解，輔助T細(xì)胞參與該反應(yīng)。二、免疫系統(tǒng)能特異性地對無

3、數(shù)種分子反應(yīng)。 免疫系統(tǒng)持續(xù)地受無數(shù)抗原刺激。免疫系統(tǒng)的一個主要形式是它能合成大量的抗體及細(xì)胞表面受體。各個帶有不同抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體和T細(xì)胞受體與外來分子的結(jié)合提供了免疫反應(yīng)特異性的基礎(chǔ)。3三、個別淋巴細(xì)胞識別個別抗原一個細(xì)胞識別一個抗原，因?yàn)閱我涣馨图?xì)胞上的所有抗原受體是相同的。在成熟淋巴細(xì)胞表面的所有受體都是糖蛋白，體細(xì)胞基因重組、突變及基因轉(zhuǎn)錄后加工等使受體產(chǎn)生107個以上的結(jié)合位點(diǎn)?？乖禺愋酝ㄟ^確保只有一個類型的受體在一個細(xì)胞內(nèi)被合成的過程來維持。雖然B細(xì)胞表面抗體和T細(xì)胞表面受體都具有類似的結(jié)構(gòu)，但它們是由不同的基因家族編碼的，其表達(dá)具有細(xì)胞型的特異性。B細(xì)胞上的表面抗體能結(jié)合可

4、溶性抗原，而T細(xì)胞受體僅僅識別在其它細(xì)胞表面展示的抗原4四、免疫系統(tǒng)能將外來微生物和分子與自身成分區(qū)別開來。五、系統(tǒng)記憶每一次與外來抗原的遭遇 免疫反應(yīng)遇到同一抗原時一次比一次強(qiáng)，具有特異性。免疫記憶可以延續(xù)動物終生。六、免疫反應(yīng)的許多性質(zhì)是通過克隆選擇確定的 一種抗原活化一種淋巴細(xì)胞。當(dāng)淋巴細(xì)胞表面受體結(jié)合抗原時，B淋巴細(xì)胞就被活化，分泌抗體被刺激而增殖（急劇分裂克隆）。七、一個有效免疫系統(tǒng)的成熟是由廣泛的細(xì)胞間信息交換來調(diào)節(jié)的。5第二節(jié)、抗體分子抗體是具有共同結(jié)構(gòu)和功能形式的一大類糖蛋白?？贵w分成五類：IgG、IgM、IgA、IgE和IgD（見表2-1）。一、IgG類抗體有兩個相同的抗原結(jié)

5、合位點(diǎn)含有抗原結(jié)合位點(diǎn)的兩個區(qū)域被稱作Fab片段，涉及到免疫調(diào)節(jié)的蛋白區(qū)稱作Fc片段，在Fab和Fc片段之間的部分稱作鉸鏈區(qū)。重鏈分子量為5.5kDlt；輕鏈分子量為2.5kDlt。二、不同類型抗體的區(qū)別IgG、IgM、IgA、IgE和IgD因重鏈形式不同而有所區(qū)別。它們的重鏈分別稱作、和。重鏈的不同使這些蛋白具有不同形式的免疫功能，并且在完成反應(yīng)成熟的不同階段發(fā)揮作用。這些差異主要是由于Fc片段上的蛋白序列不同所致。輕鏈只有兩種：、。 6三、抗體輕鏈的分子結(jié)構(gòu)比較輕鏈的氨基酸結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，輕鏈有一個恒定區(qū)和一個可變區(qū)。輕鏈由220個氨基酸組成，分為兩個區(qū)，每個區(qū)由大約110個氨基酸組成。-NH2

6、末端那半部分是異源性的，稱為可變區(qū)（V）；羧基末端那部分稱為恒定區(qū)（C）。恒定區(qū)有兩種類型：一種是決定輕鏈的，另一種是決定輕鏈的。輕鏈基因位于第6染色體上，而輕鏈的基因則位于第16染色體上。四、抗體重鏈的分子結(jié)構(gòu)重鏈的序列也存在可變區(qū)和恒定區(qū)（圖2-1）。IgG重鏈含有一個可變區(qū)和三個恒定區(qū)，每區(qū)含110個氨基酸，其它重鏈含有附加的恒定區(qū)。IgG重鏈序列也顯示鏈有四種亞類，即：IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3。鼠重鏈多肽編碼區(qū)在第12染色體上。 789五、重鏈和輕鏈的可變區(qū)形成抗原結(jié)合位點(diǎn)一個重鏈的可變區(qū)和一個輕鏈的可變區(qū)結(jié)合形成一個抗原結(jié)合位點(diǎn)。可變區(qū)的異質(zhì)性提供了動物有效進(jìn)行免疫

7、反應(yīng)所需的無數(shù)結(jié)合位點(diǎn)的基礎(chǔ)。序列異質(zhì)性并不是由整個可變區(qū)的每一部分決定的，而是集中在與抗原接觸的位點(diǎn)上。多數(shù)可變性決定于每一個鏈的三個短區(qū)，它們形成輕鏈的三個超變區(qū)和重鏈的三個超變區(qū)。這些超變區(qū)形成抗原抗體結(jié)合的接觸殘基的主體，同時這些超變區(qū)位于擴(kuò)展進(jìn)入抗原反應(yīng)區(qū)的短環(huán)上。由于它們是實(shí)際的抗原結(jié)合位點(diǎn)，故被認(rèn)為是互補(bǔ)決定區(qū)。六、功能性、輕鏈和重鏈基因的一個明顯特征是在所有細(xì)胞中這些基因轉(zhuǎn)錄后的選擇性剪接是不同的（見圖2）。200個V區(qū)，4個功能性J區(qū)。七、形成輕鏈pre-mRNA外顯子也要重排（圖3）。V-J-C-J-C。八、形成功能性重鏈基因需要pre-mRNA外顯子的重排（圖4）。501

8、00種可變區(qū)，12個D區(qū)，4個J區(qū)。101112131415九、這些重組及其它機(jī)制產(chǎn)生了無數(shù)的抗原結(jié)合位點(diǎn)。十、等位基因排斥確保在任一B細(xì)胞中只有重新排列的一個輕鏈和一個重鏈被表達(dá)。產(chǎn)生不同重鏈和輕鏈的基因重組不總是產(chǎn)生一個功能基因，在B細(xì)胞分化過程中，輕鏈重排開始于區(qū)內(nèi)。然后，若二倍體基因中的一個首先重排，產(chǎn)生一個功能性等位基因，另一個拷貝則進(jìn)行重組。若二個重組都產(chǎn)生非功能性等位基因，那么重組就要位點(diǎn)開始，以同樣的機(jī)制產(chǎn)生功能性重鏈。一旦重組產(chǎn)生一個功能性抗體，一個未知的機(jī)制就制止進(jìn)一步重組。將抗原性結(jié)合位點(diǎn)固定，直到細(xì)胞死亡。這個機(jī)制叫等位基因排斥。它可以解釋為什么B淋巴細(xì)胞分泌的只有一種

9、抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體和抗體只有一種類型的輕鏈。十一、其它：重組被用于生產(chǎn)各種類和亞類的抗體。 16淋巴細(xì)胞雜交瘤與單克隆抗體技術(shù) 1960年，法國的Barski等首先發(fā)現(xiàn)，兩種不同類型的細(xì)胞在混合培養(yǎng)的過程中會自發(fā)融合形成融合細(xì)胞。與此同時，日本的Okada也發(fā)現(xiàn)紫外線滅活的仙臺病毒(Sandai virus)可以誘發(fā)艾氏腹水瘤細(xì)胞相互融合，在此基礎(chǔ)上用滅活的仙臺病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生了第一個種間的雜交細(xì)胞。 1976年Kohler和Milstein創(chuàng)建了一個方法，他們將分泌一種特異性抗體的B細(xì)胞和體外持續(xù)生長的漿細(xì)胞瘤融合，產(chǎn)生的雜交細(xì)胞克隆表達(dá)了抗體生成的正常B細(xì)胞和漿細(xì)胞瘤細(xì)胞的免疫球蛋白基因，同時

10、也具有在體外無限增殖的能力。為此創(chuàng)造了雜交瘤(hybridoma)這個名詞，以描述一個正?？贵w生成細(xì)胞和一個漿細(xì)胞瘤細(xì)胞的融合產(chǎn)物。由于他們的重要科學(xué)貢獻(xiàn)，Kohler和Milstein在1984年榮獲了諾貝爾醫(yī)學(xué)生理獎。 1718一、免疫原性 許多外源分子、病毒或細(xì)胞單純注射在實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)能引起強(qiáng)的抗體反應(yīng)，而一些物質(zhì)卻不能，對于這些情況，?？赏ㄟ^修飾抗原或改變宿主而使免疫系統(tǒng)反應(yīng)增加。 好的免疫原分子必須具備以下條件： 1、抗原結(jié)合于原始B細(xì)胞表面抗體分子對于抗體反應(yīng)是絕對必要的。這個結(jié)合決定了產(chǎn)生抗體的特異性。因?yàn)楸砻婵贵w分子上的抗原決定位點(diǎn)與分泌抗體的結(jié)合位點(diǎn)是一致的。 2、它必須能促

11、進(jìn)B細(xì)胞與輔助T細(xì)胞間的信息交換。這要求在兩個細(xì)胞間有物理連接。即有一個位點(diǎn)被II級蛋白及T細(xì)胞受體所識別。 3、通常它必須可被降解。19二、抗原來源 開始一個免疫程序之前，對制備抗原的考慮主要于抗原所需的劑量和純度。這應(yīng)基于預(yù)計產(chǎn)生抗體的用途。如果僅僅需要識別相應(yīng)抗原的高特異性抗體，那么抗原必須要相當(dāng)純，或抗原制備物用于制備單克隆抗體。 1、純抗原 2、從聚丙烯酰胺凝膠中純化抗原。 3、半抗原：半抗原若被偶聯(lián)于大的蛋白分子上就能被用于誘發(fā)抗體。半抗原起抗原決定簇作用，與B細(xì)胞表面抗體結(jié)合，載體提供II級T細(xì)胞受體結(jié)合位點(diǎn)?？傊?，半抗原應(yīng)被偶聯(lián)于可溶性載體上，如BSA。 4、合成多肽也要連接到

12、載體上。20三、動物免疫1、動物選擇 Balb/c小鼠，68周齡；兔子生后約12周。 動物數(shù)：小鼠46只；兔子24只。2、佐劑 免疫反應(yīng)的非特異性刺激物叫做佐劑，誘導(dǎo)對可溶性抗原的抗體反應(yīng)必須使用佐劑。但對顆粒性抗原或全細(xì)胞抗原則不是必須的。 佐劑包含兩種因素：一是佐劑是儲備性物質(zhì)以防止抗原迅速代謝；二是佐劑必須是可以非特異性地刺激免疫反應(yīng)的物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)時一般是將水溶液注入到佐劑中。3、抗原劑量 對于兔，若有大量可溶的純抗原可用，一般認(rèn)為每次免疫于佐劑中有0.51.0mg劑量是可取的；對于小鼠來講，劑量則降10倍，為50100g。214、抗原的形式5、注射途徑：需考慮三個問題。 1）要注射多大劑

13、量； 2）與免疫原同注的是什么緩沖液，還有其它什么成分； 3）免疫原釋放入淋巴系統(tǒng)及循環(huán)系統(tǒng)的速度如何？ 對于兔，大體積注射常采用皮下多點(diǎn)注射。 對于鼠，大體積注射常采用腹腔注射，若需緩慢釋放則采用肌注或皮下注射，若需立即釋放宜采用靜脈注射。 對于鼠來說，第二次和第三次免疫應(yīng)間隔至少3周。 對于兔來說，每36周注射一次。 超免疫化動物血清主要含IgG抗體。其實(shí)質(zhì)部分為特異性抗體?？乖禺惖腎gG水平可達(dá)1mg/ml，這幾乎等于血清中總IgG水平的10%。22DNA合成 氨基酸、核苷酸庫 dGTP、dTTP次黃嘌呤H 肌苷酸 胸腺嘧啶核苷T脫氧核苷酸次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT) 胸腺嘧啶

14、核苷激酶（TK）氨基蝶呤A23 雜種細(xì)胞的篩選：細(xì)胞融合帶有一定的隨機(jī)性，除不同親本細(xì)胞間的融合外，還伴有各親本細(xì)胞的自身融合。因此，在緊隨細(xì)胞融合之后，必須設(shè)法把含有兩親本細(xì)胞染色體的雜種細(xì)胞分離或篩選出來。最簡便的辦法無疑是應(yīng)用選擇培養(yǎng)基，使親本細(xì)胞死亡，而僅讓雜種細(xì)胞存活下來。為此，已先后利用親本細(xì)胞的藥物抗性、營養(yǎng)缺陷型和溫度敏感性等遺傳標(biāo)記，建立了多種選擇系統(tǒng)，并已成功地用于雜種細(xì)胞的篩選。 24由抗藥性細(xì)胞組成的雜種的篩選： Szybslski等（1962）在研究抗藥性時發(fā)現(xiàn)，抗嘌呤類似物8-氮鳥嘌呤或6-巰基鳥嘌呤突變型細(xì)胞缺乏次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT），而抗嘧啶類似物

15、5-溴脫氧尿嘧啶突變型細(xì)胞缺乏胸腺嘧啶核苷激酶TK），它們均可為HAT培養(yǎng)基所殺死。在此基礎(chǔ)上，Littlefield（1964）進(jìn)一步應(yīng)用HAT培養(yǎng)基來篩選HGPRT細(xì)胞與TK細(xì)胞的余種細(xì)胞，獲得成功。從此，根據(jù)抗藥性這一遺傳標(biāo)記設(shè)計選擇系統(tǒng)即日益增多，而發(fā)展成為迄今使用最為普遍的一種篩選方法。其代表性的選擇系統(tǒng)有下列幾種。 25HAT選擇培養(yǎng)基：HAT培養(yǎng)基是指在細(xì)胞培養(yǎng)基中加有次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）或氮絲氨酸（A）和胸腺嘧啶核苷（T）的培養(yǎng)基。細(xì)胞為合成DNA所需要的嘌呤和嘧啶，可由兩條途徑獲得。一條為主要途徑，即從磷酸核糖焦磷酸（PRPP）和谷氨酰胺合成肌苷酸（IMP），進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)槊撗貘B苷三磷酸（dGTP），及從脫氧尿苷酸（dUMP）合成脫氧