分子標(biāo)記輔助選擇育種課件

1、第十八章 分子標(biāo)記輔助選擇育種 第一節(jié) 分子標(biāo)記的類型和作用原理 第二節(jié) 重要農(nóng)藝性狀基因連鎖標(biāo)記的篩選技術(shù) 第三節(jié) 作物MAS育種第1頁，共61頁。DNA RNA Protein Phenotype育種工作的關(guān)鍵：如何提高選擇效率傳統(tǒng)育種一般是首先通過各種途徑創(chuàng)造遺傳變異，然后從分離群體的后代中進(jìn)行優(yōu)化選擇和評(píng)價(jià)，這種選擇是建立在植株的表現(xiàn)型基礎(chǔ)之上的，這就要求育種家必須具有豐富的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，而且費(fèi)時(shí)、費(fèi)力。 作物的許多重要農(nóng)藝性狀為數(shù)量性狀，或?yàn)槎嗷蚩刂频馁|(zhì)量性狀為表型難以準(zhǔn)確鑒定的性狀。此時(shí)根據(jù)表現(xiàn)型來對(duì)性狀進(jìn)行評(píng)價(jià)是不確切的，因而選擇是低效的。 第十七章 分子標(biāo)記輔助選擇育種 第2頁，

2、共61頁。遺傳標(biāo)記：可以穩(wěn)定遺傳的，易于識(shí)別的特殊的遺傳多態(tài)性形式。在經(jīng)典遺傳學(xué)中，遺傳多態(tài)性是指等位基因的變（差）異；在現(xiàn)代遺傳學(xué)中，遺傳多態(tài)性是指基因組中任何座位上的相對(duì)差異或者是DNA序列的差異。第十七章 分子標(biāo)記輔助選擇育種 第3頁，共61頁。形態(tài)標(biāo)記(morphological markers)： 指植物的外部形態(tài)特征，如矮稈、白化、黃化、變態(tài)葉、雄性不育等。不足： （1）數(shù)量有限，而人工培育形態(tài)標(biāo)記材料的周期長；（2）一些形態(tài)標(biāo)記的多態(tài)性差，易受環(huán)境因素的影響；（3）一些形態(tài)標(biāo)記對(duì)植株的表型影響太大，與不良性狀連鎖第十七章 分子標(biāo)記輔助選擇育種 第4頁，共61頁。細(xì)胞學(xué)標(biāo)記(cyt

3、ological markers) 細(xì)胞內(nèi)染色體的變化，包括染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)的變異可通過染色體核型（染色體數(shù)目、大小、隨體有無、著絲粒位置等）和帶型（C、N、G帶等）分析來測(cè)定基因所在的染色體及相對(duì)位置，或通過染色體代換等遺傳操作來進(jìn)行基因定位。不足： （1）細(xì)胞學(xué)標(biāo)記材料的選育需要花費(fèi)大量的人力和較長的時(shí)間；（2）某些物種對(duì)染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)變異反應(yīng)敏感或適應(yīng)變異的能力差而難以獲得這類標(biāo)記；（3）一些不涉及染色體數(shù)目、結(jié)構(gòu)變異或帶型變異的性狀則難以用細(xì)胞學(xué)方法檢測(cè)；第十七章 分子標(biāo)記輔助選擇育種 第5頁，共61頁。生化標(biāo)記(biochemical markers) 利用基因的表達(dá)產(chǎn)物，主要包括

4、貯藏蛋白、同工酶（具有同一底物專一性的不同分子形式的酶）和等位酶（由一個(gè)位點(diǎn)的不同等位基因編碼的同種酶的不同類型，其功能相同但氨基酸序列不同）等， 可以直接反映基因表達(dá)產(chǎn)物的差異，受環(huán)境的影響較小。 不足：標(biāo)記數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足實(shí)際的需要；存在組織和器官特異性。第十七章 分子標(biāo)記輔助選擇育種 第6頁，共61頁。分子標(biāo)記 (molecular markers) 指基因組DNA分子水平上可標(biāo)識(shí)的相對(duì)差異。特點(diǎn) （1）直接以DNA的形式表現(xiàn)，表現(xiàn)穩(wěn)定。 （2）數(shù)量多（理論上遍及整個(gè)基因組）； （3）多態(tài)性高 ；（4）表現(xiàn)為中性，不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)； （5）許多標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性的特點(diǎn)，能區(qū)別純合體和雜

5、合體。 （6）成本不太高。目前已在作物遺傳圖譜構(gòu)建、重要農(nóng)藝性狀基因的標(biāo)記定位、種質(zhì)資源的遺傳多樣性與品種指紋圖譜及純度鑒定等方面得到廣泛應(yīng)用。第十七章 分子標(biāo)記輔助選擇育種 第7頁，共61頁。顯性標(biāo)記(dominant markers)：指F1的多態(tài)性片段與其親本之一完全相同。如RAPD、AFLP、ISSR等。 共顯性標(biāo)記(co-dominant markers)：指雙親的兩個(gè)以上分子量不同的多態(tài)性片段均在F1中表現(xiàn)。如RFLP、SSR、SCAR等。F1 P1 P2F1 P1 P2第十七章 分子標(biāo)記輔助選擇育種 第8頁，共61頁。一、分子標(biāo)記的類型和特點(diǎn)分 子 標(biāo) 記以分子雜交為基礎(chǔ)的DNA

6、標(biāo)記技術(shù)（RFLP標(biāo)記）以PCR技術(shù)為核心的DNA標(biāo)記技術(shù) （RAPD標(biāo)記、SSR標(biāo)記、SSLP標(biāo)記、SCAR標(biāo)記 、AFLP標(biāo)記、STS標(biāo)記 ） 以測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)的新型的分子標(biāo)記（SNP標(biāo)記、EST標(biāo)記 ） 第一節(jié) 分子標(biāo)記的類型和作用原理第9頁，共61頁。標(biāo)記名稱RFLPRAPDAFLPSSRISSRSCARSTSCAPs主要原理限制酶切Southern雜交隨機(jī)PCR擴(kuò)增限制性酶切結(jié)合PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增隨機(jī)PCR擴(kuò)增特異PCR擴(kuò)增特異PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增產(chǎn)物限制性酶切多態(tài)性水平中等較高非常高高高中等檢測(cè)基因組區(qū)域單/低拷貝區(qū)整個(gè)基因組整個(gè)基因組重復(fù)序列重復(fù)序列間隔的單拷貝區(qū)整個(gè)基因組單拷貝區(qū)

7、整個(gè)基因組可靠性高中高高高高高高遺傳特性共顯性顯性/共顯性共顯性/顯性共顯性顯性/共顯性共顯性顯性/共顯性 共顯性DNA質(zhì)量要求高，5-30g中，10-100ng很高，50-100ng中，10-100ng中， 2-50ng中，5-10ng高，50-100ng實(shí)驗(yàn)周期長短較長短短短短短開發(fā)成本高低高高低高高高第一節(jié) 分子標(biāo)記的類型和作用原理各種分子標(biāo)記特征特性的比較第10頁，共61頁。二、分子標(biāo)記的原理和遺傳特性(一)RFLP（限制性片斷長度多態(tài)性）標(biāo)記 特定生物類型的基因組DNA經(jīng)某一種限制性內(nèi)切酶完全酶解后，會(huì)產(chǎn)生分子量不同的同源等位片段，或稱限制性等位片段。通過電泳的方法分離和檢測(cè)這些片段

8、。凡是可以引起酶解位點(diǎn)變異的突變，如點(diǎn)突變（新產(chǎn)生和去除酶切位點(diǎn)）和一段DNA的重新組織（如插入和缺失造成酶切位點(diǎn)間的長度發(fā)生變化）均可導(dǎo)致限制性等位片段的變化，從而產(chǎn)生RFLP。1、RFLP標(biāo)記原理第一節(jié) 分子標(biāo)記的類型和作用原理第11頁，共61頁。ABAB限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)與放射性探針 結(jié)合部位限制性內(nèi)切酶酶切后； 電泳分離DNA片段； 轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素薄膜； 與放射性探針Southern雜交 放射性自顯影或酶學(xué)檢測(cè)分析陽性條帶?？娠@示出不同材料對(duì)該探針的限制性片段多態(tài)性情況。 1、RFLP標(biāo)記原理第一節(jié) 分子標(biāo)記的類型和作用原理第12頁，共61頁。第一節(jié) 分子標(biāo)記的類型和作用原理第13頁，

9、共61頁。（1）遍布于整個(gè)基因組，數(shù)量幾乎是無限的； （2）無表型效應(yīng)，不受發(fā)育階段器官特異性限制； （3）共顯性，可區(qū)分純合子和雜合子； （4）結(jié)果穩(wěn)定、可靠； （5）DNA需要量大，檢測(cè)技術(shù)繁雜， 難以用于大規(guī)模的育種實(shí)踐中。2、RFLP標(biāo)記的特點(diǎn)第一節(jié) 分子標(biāo)記的類型和作用原理第14頁，共61頁。PCR技術(shù)的原理 1.變性：在加熱或堿性條件下可使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA，稱之為變性。 2.退火：是模板與引物的復(fù)性。引物是與模板某區(qū)序列互補(bǔ)的一小段DNA片段。 3.延伸：從結(jié)合在特定DNA模板上的引物為出發(fā)點(diǎn)，將四種脫氧核苷酸以堿基配對(duì)形式按53的方向沿著模板順序合成新的DN

10、A鏈。第一節(jié) 分子標(biāo)記的類型和作用原理第15頁，共61頁。第一節(jié) 分子標(biāo)記的類型和作用原理第16頁，共61頁。二、分子標(biāo)記的原理和遺傳特性(二)RAPD（隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA）標(biāo)記 Williams等于1990年創(chuàng)立。其基本原理與PCR技術(shù)一致。RAPD標(biāo)記技術(shù)就是用一個(gè)（有時(shí)用兩個(gè)）隨機(jī)引物（一般8-10個(gè)堿基）非定點(diǎn)地?cái)U(kuò)增基因組DNA，然后用凝膠電泳分開擴(kuò)增片段。遺傳材料的基因組DNA如果在特定引物結(jié)合區(qū)域發(fā)生DNA片段插入、缺失或堿基突變，就有可能導(dǎo)致引物結(jié)合位點(diǎn)的分布發(fā)生相應(yīng)的變化，導(dǎo)致PCR產(chǎn)物增加、缺少或發(fā)生分子量變化。若PCR產(chǎn)物增加或缺少，則產(chǎn)生RAPD標(biāo)記。 第一節(jié) 分子標(biāo)記

11、的類型和作用原理第17頁，共61頁。primer A B C 1、RAPD標(biāo)記原理第一節(jié) 分子標(biāo)記的類型和作用原理第18頁，共61頁。（1）不需DNA探針，設(shè)計(jì)引物也無須知道序列信息； （2）顯性遺傳（極少數(shù)共顯性）不能鑒別雜合子和純合子； （3）技術(shù)簡便，不涉及分子雜交和放射性自顯影等技術(shù)； （4）DNA樣品需要量少，引物價(jià)格便宜，成本較低； （5）實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較差，結(jié)果可靠性較低。 RAPD標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)條件摸索和引物的選擇是十分關(guān)鍵 而艱巨的工作。只要實(shí)驗(yàn)條件標(biāo)準(zhǔn)化，可以提高RAPD 標(biāo)記的再現(xiàn)性。2、RAPD標(biāo)記的特點(diǎn)第一節(jié) 分子標(biāo)記的類型和作用原理第19頁，共61頁。二、分子標(biāo)記的原理和遺

12、傳特性(三)AFLP（擴(kuò)增片斷長度多態(tài)性）標(biāo)記 AFLP即擴(kuò)增片段長度多態(tài)性，是1993年由Marc 和Pieter 發(fā)明創(chuàng)造的一種DNA分子標(biāo)記。該技術(shù)是對(duì)限制性酶切片段的選擇性擴(kuò)增，又稱基于PCR的RFLP。鑒于AFLP標(biāo)記的多態(tài)性強(qiáng)，一次可檢測(cè)到100150個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物，因而非常適合繪制品種指紋圖譜及進(jìn)行分類研究。第一節(jié) 分子標(biāo)記的類型和作用原理第20頁，共61頁。1、AFLP標(biāo)記原理對(duì)基因組DNA進(jìn)行雙酶切，在使用的兩種限制性酶中，一種為酶切識(shí)別位點(diǎn)為4堿基的酶，另一種為識(shí)別位點(diǎn)為6堿基的酶。進(jìn)一步將酶切片段和含有與其粘性末端相同的人工接頭連接，連接后的接頭序列及臨近內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)就作為

13、以后PCR反應(yīng)的引物結(jié)合位點(diǎn)，通過選擇在末端上分別添加13個(gè)選擇性堿基的不同引物，選擇性地識(shí)別具有特異配對(duì)順序的酶切片段與之結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)特異性擴(kuò)增，最后用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物。 第21頁，共61頁。第一節(jié) 分子標(biāo)記的類型和作用原理第22頁，共61頁。2、AFLP標(biāo)記的特點(diǎn) （1）結(jié)合了PFLP穩(wěn)定性和PCR技術(shù)高效性的特點(diǎn)，不需要事先知道DNA序列的信息，可以用于任何動(dòng)植物基因組的研究。 （2）多態(tài)性豐富； （3）標(biāo)記多數(shù)具有共顯性表達(dá)，無復(fù)等位效應(yīng)，表現(xiàn)孟德爾方式遺傳。 （4）分析成本較高，對(duì)DNA的純度和內(nèi)切酶的質(zhì)量要求也較高。第一節(jié) 分子標(biāo)記的類型和作用原理第23頁，共6

14、1頁。二、分子標(biāo)記的原理和遺傳特性(四)SSR（簡單重復(fù)序列）標(biāo)記 又稱微衛(wèi)星DNA(Micro-satellite DNA)標(biāo)記；它是一類由1-6個(gè)堿基組成的基序串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列，其長度一般較短，它們廣泛分布于基因組的不同位置。如(CA)n、(AT)、(GGC)n等重復(fù)，重復(fù)區(qū)大多幾十幾百bp，分散在基因組中，大多不存在于編碼序列內(nèi)，具有較高的多態(tài)性。呈現(xiàn)孟德爾式遺傳。目前微衛(wèi)星DNA已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了萬余個(gè)位點(diǎn)。第一節(jié) 分子標(biāo)記的類型和作用原理第24頁，共61頁。盡管微衛(wèi)星DNA分布于整個(gè)基因組的不同位置上，但其兩端的序列多是相對(duì)保守的單拷貝序列。根據(jù)微衛(wèi)星DNA兩端的單拷貝序列設(shè)計(jì)一對(duì)特

15、異引物，利用PCR技術(shù)，擴(kuò)增每個(gè)位點(diǎn)的微衛(wèi)星DNA序列，通過電泳分析核心序列的長度多態(tài)性。1、SSR標(biāo)記的原理第一節(jié) 分子標(biāo)記的類型和作用原理第25頁，共61頁。微衛(wèi)星分子標(biāo)記對(duì)18份山羊草基因型的擴(kuò)增結(jié)果 第一節(jié) 分子標(biāo)記的類型和作用原理第26頁，共61頁。2、SSR標(biāo)記的特點(diǎn)（1）數(shù)量豐富，廣泛分布于整個(gè)基因組；數(shù)量幾乎無限， （2） SSR技術(shù)一般檢測(cè)到的是一個(gè)單一的多等位基因位點(diǎn)。 （3）共顯性標(biāo)記，可鑒別出雜合子和純合子； （4）實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，結(jié)果可靠； （5）由于創(chuàng)建新的標(biāo)記時(shí)需知道重復(fù)序列兩端的序列信息，因此其開發(fā)有一定困難，費(fèi)用也較高。 第一節(jié) 分子標(biāo)記的類型和作用原理第27頁

16、，共61頁。DNA分子標(biāo)記在植物生物技術(shù)中的應(yīng)用 DNA分子標(biāo)記是現(xiàn)代植物生物技術(shù)中應(yīng)用的重要工具，其應(yīng)用主要包括以下幾個(gè)方面： 構(gòu)建高密度的遺傳連鎖圖 ：在經(jīng)典遺傳學(xué)中由于遺傳標(biāo)記的數(shù)量較少，只能建立稀疏且分布不均勻的遺傳連鎖圖。DNA分子標(biāo)記數(shù)量豐富，為高密度遺傳圖譜的制作提供了可能，促進(jìn)DNA指紋的分析。 進(jìn)行基因定位：基因定位就是尋找與目的的基因緊密連鎖的遺傳標(biāo)記并確定其在染色體上的位置，高密度遺傳連鎖圖的建立使目的基因的定位更為方便。 第一節(jié) 分子標(biāo)記的類型和作用原理第28頁，共61頁。遺傳多樣性和物種親緣關(guān)系：分子圖譜的構(gòu)建和基因定位更加有利于遺傳多樣性和物種親緣關(guān)系的研究。植物的

17、遺傳多樣性是品種遺傳改良的基礎(chǔ)。 DNA標(biāo)記可以覆蓋整個(gè)基因組，能客觀、準(zhǔn)確地檢測(cè)物基因組DNA水平的差異。 種質(zhì)鑒定和遺傳背景分析：利用DNA分子標(biāo)記可以鑒別品種，評(píng)估品種純度，分析農(nóng)藝性狀基因，分離和鑒別遺傳材料，確定染色體同源性，對(duì)異源染色體和染色體結(jié)構(gòu)畸變的檢測(cè)。育種中的分子標(biāo)記輔助選擇：長期以來，植物育種都是依植株的表型性狀進(jìn)行選擇的。DNA標(biāo)記的出現(xiàn)使植物育種從表型選擇過渡到分子育種的新階段。 第29頁，共61頁。第二節(jié) 重要農(nóng)藝性狀基因連鎖標(biāo)記的篩選技術(shù) 目標(biāo)基因的標(biāo)記篩選是進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇（MAS）育種的基礎(chǔ)。 分子標(biāo)記與目標(biāo)基因緊密連鎖 標(biāo)記實(shí)用性強(qiáng)，重復(fù)性好，而且能夠經(jīng)

18、濟(jì)簡便地檢測(cè)大量個(gè)體。 不同遺傳背景選擇有效。用于MAS育種的分子標(biāo)記須具備三個(gè)條件：第30頁，共61頁。一、遺傳圖譜的構(gòu)建與重要農(nóng)藝性狀基因的標(biāo)記 第二節(jié) 重要農(nóng)藝性狀基因連鎖標(biāo)記的篩選技術(shù)1、構(gòu)建遺傳圖譜的意義： 確定不同分子標(biāo)記在染色體上的相對(duì)位置或排列情況，為作物種質(zhì)資源收集、目標(biāo)基因定位、基因克隆、育種規(guī)模大小及相應(yīng)育種方法的確定等提供理論依據(jù)。但是，由于分子標(biāo)記數(shù)目的限制，目前作圖親本的選用首先考慮親本間的多態(tài)性水平，育種目標(biāo)性狀考慮較少。第31頁，共61頁。2、遺傳作圖的原理 與經(jīng)典連鎖檢測(cè)一致，即基于染色體的交換與重組。用重組率來表示基因間的遺傳距離。第二節(jié) 重要農(nóng)藝性狀基因連

19、鎖標(biāo)記的篩選技術(shù)第32頁，共61頁。3、遺傳圖譜構(gòu)建的主要環(huán)節(jié)建立作圖群體群體中不同植株或品系的標(biāo)記基因型的分析 借助計(jì)算機(jī)程序建立標(biāo)記之間的連鎖群 第二節(jié) 重要農(nóng)藝性狀基因連鎖標(biāo)記的篩選技術(shù) 構(gòu)建遺傳圖譜，首先要選擇合適的親本及分離群體，親本之間的差異不宜過大，否則會(huì)降低所建圖譜的準(zhǔn)確度和適用性。而親本間適度的差異范圍因不同物種而異。第33頁，共61頁。第二節(jié) 重要農(nóng)藝性狀基因連鎖標(biāo)記的篩選技術(shù)4、用于分子標(biāo)記的遺傳作圖群體1）暫時(shí)性分離群體：包括F2群體、BC1等。這類群體中分離單位是個(gè)體，一經(jīng)自交或近交其遺傳組成就會(huì)發(fā)生變化，無法永久使用，由于每個(gè)單株所提供的DNA有限，且只能使用一代，

20、限制了該群體的作圖能力； 2）永久性分離群體：包括重組自交系群體（RIL）（由F2經(jīng)多代自交一粒傳后使后代基因組相對(duì)純合的群體）、加倍單倍體群體（DHL）等。這類群體中分離單位為株系，不同株系之間存在基因型的差異，而株系內(nèi)個(gè)體之間的基因型是相同且純合的，自交后不會(huì)發(fā)生分離，因此可通過自交或近交繁殖后代，而不會(huì)改變?nèi)后w的遺傳組成，可以永久使用。 第34頁，共61頁。F2BC1DHRIL群體 形成 F1自交后代F1回交后代F1花粉分化個(gè)體F2個(gè)體自交后代性狀研究對(duì)象個(gè)體個(gè)體品系品系準(zhǔn)確度低低高高必要的群體規(guī)模大大中中分離比例1:2:3或3:11:11:11:1不同作圖群體的特點(diǎn)第二節(jié) 重要農(nóng)藝性狀

21、基因連鎖標(biāo)記的篩選技術(shù)第35頁，共61頁。（一）質(zhì)量性狀的分子標(biāo)記 二、分子標(biāo)記與基因定位 尋找與質(zhì)量性狀緊密連鎖的DNA標(biāo)記主要有兩個(gè)目的： 在育種中對(duì)質(zhì)量性狀進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇， 對(duì)質(zhì)量性狀基因進(jìn)行圖位克隆。主要途徑 ：近等基因系分析法（Near Isogenic Lines Analysis， NIL） 群體分離分析法（Bulked Segregation Analysis，BSA）第二節(jié) 重要農(nóng)藝性狀基因連鎖標(biāo)記的篩選技術(shù)第36頁，共61頁。1、NIL（近等基因系）分析法NIL分析法的原理： 如果一對(duì)近等基因系在目標(biāo)性狀上表現(xiàn)差異，那么凡是能在這對(duì)近等基因系之間揭示多態(tài)性的分子標(biāo)記就可能

22、位于目標(biāo)基因的附近。 因此利用NIL材料，可以尋找與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。第二節(jié) 重要農(nóng)藝性狀基因連鎖標(biāo)記的篩選技術(shù)第37頁，共61頁?；静襟E： 1）篩選與目標(biāo)基因連鎖的分子標(biāo)記：利用分子標(biāo)記技術(shù)分析一對(duì)近等基因系，篩選在兩者間表現(xiàn)出多態(tài)性的引物或探針。 2）進(jìn)行標(biāo)記與目的基因連鎖的驗(yàn)證：利用多態(tài)性標(biāo)記/探針對(duì)近等基因系間雜交分離群體中的單株進(jìn)行篩選，確定每個(gè)單株的標(biāo)記基因型。同步對(duì)分離群體中單株的目標(biāo)性狀進(jìn)行調(diào)查。 3）基因定位：利用Mapmaker等軟件確定目標(biāo)性狀與標(biāo)記之間的連鎖關(guān)系，并計(jì)算遺傳距離和繪制連鎖圖。 1、NIL分析法第二節(jié) 重要農(nóng)藝性狀基因連鎖標(biāo)記的篩選技術(shù)第38頁

23、，共61頁。2、BSA（群體分離）分析法 BSA法是從近等基因系分析法演化而來的，它克服了許多作物沒有或難以創(chuàng)建相應(yīng)的NIL的限制，對(duì)于尚無連鎖圖或連鎖圖飽和程度較底的植物，利用BSA法也是快速獲得與目標(biāo)基因連鎖的分子標(biāo)記的有效方法。第二節(jié) 重要農(nóng)藝性狀基因連鎖標(biāo)記的篩選技術(shù)第39頁，共61頁。2、BSA分析法BSA分析法的原理 在作圖群體中，依據(jù)目標(biāo)性狀表型的相對(duì)差異（如抗病與感病、可育與不育等），將個(gè)體或株系分成兩組，分別將兩組中的個(gè)體或株系的DNA等量混合，形成相對(duì)的DNA池（DNA pool）。這兩個(gè)DNA池之間除了在目標(biāo)基因座所在染色體區(qū)域的DNA組成上存在差異外，來自基因組其它部分

24、的DNA組成應(yīng)該是完全相同或基本相同的，即兩DNA池間差異相當(dāng)于兩近等基因系基因組之間的差異，或者說構(gòu)成了一對(duì)近等基因DNA池。因此在這兩個(gè)DNA池之間表現(xiàn)出多態(tài)性的DNA標(biāo)記，就有可能與目標(biāo)基因連鎖。第二節(jié) 重要農(nóng)藝性狀基因連鎖標(biāo)記的篩選技術(shù)第40頁，共61頁?；静襟E1）根據(jù)目標(biāo)性狀表型或基因型的相對(duì)差異構(gòu)建兩個(gè)近等DNA池或代表群，尋找在兩者之間表現(xiàn)多態(tài)性的標(biāo)記。 2）利用分離群體驗(yàn)證候選標(biāo)記是否與目標(biāo)基因緊密連鎖。 3）根據(jù)標(biāo)記基因型的分離比例和單株目標(biāo)性狀分離比例進(jìn)行遺傳作圖。第二節(jié) 重要農(nóng)藝性狀基因連鎖標(biāo)記的篩選技術(shù)第41頁，共61頁。（二）數(shù)量性狀的分子標(biāo)記 數(shù)量性狀的遺傳是受多

25、基因控制的，遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜，易受環(huán)境因素影響，表現(xiàn)為連續(xù)變異，表現(xiàn)型與基因型之間沒有明確的對(duì)應(yīng)關(guān)系。因此長期以來對(duì)數(shù)量性狀的遺傳研究只能借助于數(shù)理統(tǒng)計(jì)的手段，將控制數(shù)量性狀的多基因系統(tǒng)作為一個(gè)整體來研究，使人們無法了解單個(gè)基因在基因組中的位置和效應(yīng)，制約了人們?cè)谟N中對(duì)數(shù)量性狀的遺傳操縱能力。而分子標(biāo)記的出現(xiàn)為深入研究數(shù)量性狀的遺傳基礎(chǔ)提供了可能。第二節(jié) 重要農(nóng)藝性狀基因連鎖標(biāo)記的篩選技術(shù)第42頁，共61頁。（二）數(shù)量性狀的分子標(biāo)記 控制數(shù)量性狀的基因在基因組中的位置稱為數(shù)量性狀基因座（QTL）。借助與QTL連鎖的分子標(biāo)記，在育種中人們就能夠?qū)τ嘘P(guān)QTL的遺傳進(jìn)行追蹤，提高對(duì)數(shù)量性狀優(yōu)良基因型選

26、擇的準(zhǔn)確性和預(yù)見性。主要途徑：基于性狀的分析法（trait-based analysis，TB） 以數(shù)量性狀表型為依據(jù)進(jìn)行分組。 基于標(biāo)記的分析法（marker-based analysis，MB） 以標(biāo)記基因型為依據(jù)進(jìn)行分組第二節(jié) 重要農(nóng)藝性狀基因連鎖標(biāo)記的篩選技術(shù)第43頁，共61頁。（三）QTL定位的主要方法 常用的主要有區(qū)間作圖法、復(fù)合區(qū)間作圖法、多元回歸法、已知完整連鎖圖作圖法等，并開發(fā)出一些功能很強(qiáng)的軟件包，如Map Manager、 Mapmaker/QTL、Linkage、WinQTLCart等。這些程序包都可以從因特網(wǎng)上免費(fèi)下載（/biosci/linkage.html）。利用

27、這些方法，可將控制某一數(shù)量性狀的多個(gè)QTL進(jìn)行分解，像研究質(zhì)量性狀一樣，將它們分別定位于染色體上，并分析各個(gè)QTL的單個(gè)效應(yīng)及互作效應(yīng)。第二節(jié) 重要農(nóng)藝性狀基因連鎖標(biāo)記的篩選技術(shù)第44頁，共61頁。第三節(jié) 作物MAS育種一、作物MAS育種須具備的條件分子標(biāo)記與目標(biāo)基因共分離或緊密連鎖，一般要求兩者間的遺傳距離小于5cM,最好1cM或更小。 具有在大群體中利用分子標(biāo)記進(jìn)行篩選的有效手段，主要是應(yīng)用PCR技術(shù)。 篩選技術(shù)在不同實(shí)驗(yàn)室間重復(fù)性好，且具有經(jīng)濟(jì)、易操作的特點(diǎn)。 具有實(shí)用化程度高并能協(xié)助育種家作出抉擇的計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理軟件。第45頁，共61頁。（一）回交育種 二、MAS育種方法 由單基因或寡

28、基因等質(zhì)量性狀基因控制的主要農(nóng)藝性狀，若利用分子標(biāo)記輔助選擇，針對(duì)每一回交世代結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇，篩選出含目標(biāo)基因的優(yōu)異品系，進(jìn)一步培育成新品種。第三節(jié) 作物MAS育種第46頁，共61頁。 受體親本 供體親本 (不含優(yōu)質(zhì)基因) (含優(yōu)質(zhì)基因)F1 受體親本BC1目標(biāo)基因定位標(biāo)記輔助選擇 中選BC1 受體親本 (含優(yōu)質(zhì)基因)BC2BC3標(biāo)記輔助選擇標(biāo)記輔助選擇中選BC3(含優(yōu)質(zhì)基因) 新育成的優(yōu)質(zhì)品種 (受體親本遺傳本背景+優(yōu)質(zhì)基因)自 交目標(biāo)基因的定位 與標(biāo)記輔助回交 育種相結(jié)合程序圖 中選BC1 受體親本 (含優(yōu)質(zhì)基因)第47頁，共61頁。（二）大范圍群體內(nèi)的單目標(biāo)基因（SLS-MAS）分

29、析方法 基本原理在一個(gè)隨機(jī)雜交的混合群體中，首先在一個(gè)很大群體中利用分子標(biāo)記輔助選擇目標(biāo)性狀，盡可能使選擇群體足夠大，使中選的植株就目標(biāo)位點(diǎn)純合，而在目標(biāo)位點(diǎn)以外的其它基因位點(diǎn)上保持有大的遺傳多樣性，最好仍呈孟德爾分離，這樣，分子標(biāo)記篩選后，仍有很大遺傳多樣性供育種家通過傳統(tǒng)育種方法選擇，產(chǎn)生新的品種和雜交種。這種方法對(duì)于分子標(biāo)記輔助選擇質(zhì)量性狀或數(shù)量性狀均適用。 第三節(jié) 作物MAS育種第48頁，共61頁。1）利用傳統(tǒng)育種方法結(jié)合DNA指紋圖譜選擇用于MAS的優(yōu)異親本，特別對(duì)于數(shù)量性狀而言，不同親本針對(duì)同一目標(biāo)性狀要具有不同的重要的QTL。即具有更多的等位多樣性。 2）確定某重要農(nóng)藝性狀QTL

30、標(biāo)記。利用中選親本與測(cè)驗(yàn)系雜交，將F1自交產(chǎn)生分離群體，一般200-300株，結(jié)合F2-3株行田間調(diào)查結(jié)果，以確定主要QTL的分子標(biāo)記。 3）結(jié)合篩選的QTL標(biāo)記，對(duì)上述分離群體中單株進(jìn)行SLS-MAS。 4）根據(jù)標(biāo)記有無選擇目標(biāo)材料。由于連鎖累贅，除中選QTL標(biāo)記外，使其附近其它位點(diǎn)保持最大的遺傳多樣性。通過中選單株自交，根據(jù)本地生態(tài)需要進(jìn)行系統(tǒng)選擇，育成新的優(yōu)異品系。或?qū)⒅羞x單株與測(cè)驗(yàn)系雜交產(chǎn)生新雜種。 基本步驟第三節(jié) 作物MAS育種第49頁，共61頁。（三）MAS聚合育種 在實(shí)際育種工作中，通過聚合雜交將多個(gè)有利目標(biāo)基因聚集到同一品種材料中，培育成一個(gè)具多種有利性狀的品種，如多個(gè)抗性基因

31、的品種，在作物抗病蟲育種中保證品種對(duì)病蟲害的持久抗性將有十分重要的作用。但是，由于導(dǎo)人的新基因表現(xiàn)常被預(yù)先存在的基因所掩蓋或者許多基因的表型相似難以區(qū)分、隱性基因需要測(cè)交檢測(cè)、或接種條件要求很高等，導(dǎo)致許多抗性基因不一定在特定環(huán)境下表現(xiàn)出抗性，造成基于表型的抗性選擇將無法進(jìn)行。MAS可利用分子標(biāo)記跟蹤新的有利基因?qū)?，將超過觀測(cè)閾值外的有利基因高效地累積起來，為培育含有多抗、優(yōu)質(zhì)基因的品種提供了重要的途徑。第三節(jié) 作物MAS育種第50頁，共61頁。 受體親本 供體親本A (無優(yōu)質(zhì)基因) (含優(yōu)質(zhì)基因A) 受體親本 供體親本B (無優(yōu)質(zhì)基因) (含優(yōu)質(zhì)基因B) F1(含優(yōu)質(zhì)基因A) F1(含優(yōu)質(zhì)

32、基因B)復(fù)雜雜種(分離群體) 受體親本 供體親本C (無優(yōu)質(zhì)基因) (含優(yōu)質(zhì)基因C) 中選雜種個(gè)體 F1 (含優(yōu)質(zhì)基因A和B) (含優(yōu)質(zhì)基因C)復(fù)雜雜種(分離群體) 中選雜種個(gè)體 受體親本 (含優(yōu)質(zhì)基因A、B和C) 新育成的優(yōu)質(zhì)品種 (受體親本遺傳背景+優(yōu)質(zhì)基因A、B和C)回交12代，標(biāo)記輔助選擇自交標(biāo)記輔助選擇標(biāo)記輔助選擇標(biāo) 記 輔 助 基 因 聚 合與 品 質(zhì) 改 良 相 結(jié) 合 程 序 圖 第51頁，共61頁。進(jìn)行MAS選擇的限制因素 作物基因作圖速度還相當(dāng)緩慢，一些重要性狀的分子標(biāo)記與目標(biāo)性狀間的遺傳距離仍較大，不符合MAS的要求。 已篩選出的分子標(biāo)記在不同遺傳背景中表現(xiàn)不穩(wěn)定，甚至同

33、樣的目標(biāo)基因同樣的標(biāo)記在不同群體中其重組率會(huì)有差異。特別是呈數(shù)量性狀遺傳的性狀的分子標(biāo)記更易受遺傳背景影響。 基于PCR技術(shù)的標(biāo)記數(shù)量有限。特別是已篩選到一些與重要農(nóng)藝性狀基因的分子標(biāo)記大都不是PCR標(biāo)記，因此不易應(yīng)用于MAS中。 利用分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行MAS的成本較高，不能滿足大規(guī)模育種選擇的需要。 生物技術(shù)手段與常規(guī)育種嚴(yán)重脫節(jié)。作物育種學(xué)家與分子遺傳學(xué)家之間的有機(jī)結(jié)合、溝通不夠。第三節(jié) 作物MAS育種第52頁，共61頁。三、提高分子標(biāo)記的篩選效率（一）多重PCR方法 （二）用相斥相分子標(biāo)記進(jìn)行育種選擇 （三）克服連鎖累贅 （四）降低MAS育種的成本第三節(jié) 作物MAS育種第53頁，共61頁。三、提高分子標(biāo)記的篩選效率（一）多重PCR方法 為了增加標(biāo)記的篩選效率，當(dāng)同時(shí)篩選到與2個(gè)或2個(gè)以上目標(biāo)性狀連鎖的幾個(gè)不同的分子標(biāo)記時(shí)，如果這幾個(gè)分子標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物具有不同長度，則一對(duì)以上的引物可在同一PCR條件下同時(shí)反應(yīng)。第三節(jié) 作物MAS育種第54頁，共61頁。三、提高分子標(biāo)記的篩選效率（二）用相斥相分子標(biāo)記進(jìn)行育種選擇 所謂相斥相分子標(biāo)記指與目標(biāo)性狀相斥連鎖的分子標(biāo)記，即有分子標(biāo)記，植株不表現(xiàn)目標(biāo)性狀；無分子標(biāo)記，植株表現(xiàn)目標(biāo)性狀。通過相斥標(biāo)記（特別是顯性標(biāo)記）