腫瘤學課件：第二部分 腫瘤標記物及其應用-細胞周期調(diào)控異常與腫瘤-腫瘤的細胞與分子診斷

1、腫瘤學-2（oncology）第二部分 腫瘤標記物及其應用細胞周期調(diào)控異常與腫瘤腫瘤的細胞與分子診斷第一節(jié) 腫瘤標記物及其應用序 腫瘤標記物（tumor marker）的概念是1978年Herberman在美國人類腫瘤免疫診斷會議上提出的，次年被公認運用。 腫瘤標記物是指一類由腫瘤細胞所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或核酸等生物大分子物質(zhì)。存在于腫瘤細胞的胞漿、胞膜和胞核內(nèi)，正常組織不存在或甚微。作用：腫瘤的診斷；提示腫瘤細胞的特征和起源；判斷腫瘤的預后；協(xié)助指導腫瘤的治療；監(jiān)測腫瘤的復發(fā)一、腫瘤標記物研究的歷史及范圍二、腫瘤標記物的分類1、癌胚蛋白：指胚胎時存在于胎兒正常細胞的蛋白成分，出生后迅速減少，成人中

2、測不到。代表的AFP,CEA。2、胚胎性酶與同工酶：同工酶是指功能相同，但分子結(jié)構(gòu)不完全相同的酶蛋白，細胞癌變時分化不全，蛋白趨向胚胎化，出現(xiàn)胚胎性酶。3、激素或異位性激素：可以是原位性，診斷各種內(nèi)分泌器官腫瘤，或為異位性，對某些特定腫瘤有診斷價值。4、免疫球蛋白與白細胞膜標記：診斷各種白血病與淋巴瘤。5、中間絲標記：不同胚葉起源的腫瘤，含有不同的中間絲?？婆袛嗟头只[瘤的性質(zhì)及起源。6、致瘤病毒的抗原或抗體：如EB抗體及EBNA的檢測有助于鼻煙癌的診斷。7、單克隆抗體識別的腫瘤抗原：如CA19-9診斷胰腺及結(jié)腸腫瘤；CA125診斷卵巢腺癌。8、癌基因、抗癌基因與其它腫瘤相關基因：用免疫組化和

3、分子雜交進行診斷。三、組織細胞中腫瘤標記物的檢測（一）免疫組織化學技術(shù)的特點1、發(fā)展微量檢測技術(shù)2、所檢測的物質(zhì)多為蛋白或核酸3、具有高特異性和敏感性4、各種單克隆抗體與基因探針的標記已經(jīng)商品化供應5、提供了多種多樣的方法檢測放射免疫技術(shù)；免疫熒光技術(shù)；免疫酶組織化學技術(shù)；免疫酶聯(lián)吸附實驗（二）免疫組織化學技術(shù)的發(fā)展1、免疫熒光技術(shù) 它是以熒光素（FITC或羅丹明）為標記物標記腫瘤標記物抗體后的免疫組化技術(shù)。直接和間接法，操作簡便，熒光清晰，易于觀察，但不易長期保存。2、免疫酶技術(shù) 它是以酶標記抗體。常用辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AKP）與組織中的腫瘤標記物進行免疫反應，再以酶底物

4、顯色。方法多種多樣，常用的方法：親和素生物素復合物（ABC）鏈霉親和素生物素復合物（sABC）ABC法原理示意圖結(jié)果判斷3、免疫膠體金技術(shù)用膠體金為標記物標記抗體，與抗原或一抗結(jié)合后成紅色，與金增強試劑盒作用將吸附銀離子，呈棕黑色。4、免疫電鏡技術(shù)若將電鏡標本用膠體金或鐵蛋白標記抗體染色，電子流不能透過這些重金屬，電鏡標本便顯示黑色顆粒，幫助定位。5、親和組織化學技術(shù) 它是以一些對組織中某些成分具有特殊親和力的物質(zhì)為標記物，進行組織抗原的定位。（1）凝集素 一種凝集素只對某一種特定糖基進行特異性結(jié)合，而另一端可以與熒光素、生物素、酶、膠體金或鐵蛋白結(jié)合。（2）葡萄球菌蛋白A 一端可以與IgG的

5、Fc段結(jié)合，不受動物種族的限制；另一端可以與熒光素、生物素、酶、膠體金或鐵蛋白結(jié)合。（3）激素 如雌激素或孕激素在用熒光或酶標記后，利用其與雌激素或孕激素受體的高度親和性進行檢測。6、雜交組織化學技術(shù)它是利用放射性核酸或生物素標記的DNA或RNA探針，進行原位分子雜交，測定腫瘤組織中的基因改變（三）中間絲及其單克隆抗體在低分化腫瘤診斷中的應用1、中間絲的結(jié)構(gòu)、功能與分布 在細胞骨架中，除了微絲（7nmm）、微管（24nm）以外，還有一類叫中間絲（10nm）。中間絲與微絲和微管的差異：（1）纖維直徑居于微絲和微管之間（2）其蛋白肽鏈繞成a螺旋，再反復繞成索狀（3）結(jié)構(gòu)穩(wěn)定（EM圖）（4）與細胞膜

6、緊密結(jié)合。功能是強有力的支撐細胞膜，與運動無關（5）核周分布多（熒光圖）（6）具有組織來源的特異性，常用于低分化腫瘤的組織起源判斷2、中間絲的分類五種：角蛋白（keratin, K）結(jié)蛋白（desmin, D）波形蛋白（vimentin, V）膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）神經(jīng)微絲（NF）注：上述五種分別對上皮、肌肉、間葉、神經(jīng)膠質(zhì)、神經(jīng)微絲具有特異性，且都分布于胞漿內(nèi)。3、中間絲在低分化腫瘤診斷中的應用（1）腫瘤中間絲診斷（2）中間絲分類法診斷四、血清中腫瘤標記物的檢測主要采用放射免疫法和酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）（一）基本原理與方法ELISA中的雙抗體夾心法是最常用的方法方法：1、先將腫

7、瘤標記物抗體包被微孔板待用2、應用時加入待檢血清（內(nèi)含抗原）3、再加HRP標記的抗體，作用一定的時間4、再加HRP的可溶性底物（OPD，鄰本二胺）進行顯色5、讀取OD495，從標準曲線求得其在血清中的濃度（二）舉例1、血清AFP（甲胎蛋白）的檢測2、血清PSA（前列腺特異抗原）的檢測3、血清CA19-9（糖蛋白抗原）的檢測4、血清CA125（糖蛋白抗原）的檢測第二節(jié) 細胞周期調(diào)控異常與腫瘤一、細胞周期及其調(diào)控的分子機制（一）歷史的回顧 從1655年用放大鏡觀察到的軟木切片的基本單位（小室，cells）到20世紀70年代，應用流式細胞術(shù)進行細胞周期分析成為可能。 細胞生長分裂時，依次經(jīng)過G1,S

8、,G2,M期，一分為二周而復始的過程，稱為細胞分裂周期。 80年代，建立了多參數(shù)流式細胞術(shù)DNA/RNA同步分析法分析細胞周期，除能將G2,M期分開外，在分析圖上還能看到G0,G1,S,G2.M.O（靜止期）細胞。 細胞周期的飛躍發(fā)展，為細胞分子生物學研究展現(xiàn)了無限的空間，將腫瘤發(fā)生發(fā)展的研究迅速地推進到一個完全嶄新的階段。 （二）惡性腫瘤 細胞增殖周期障礙性疾病細胞增殖（cell proliferation）是指細胞分裂和再生的過程。 生命從受精卵開始，通過細胞分裂增加細胞數(shù)，同時通過分化形成特定功能的細胞而逐漸發(fā)育成胚胎，個體生長與成熟，最后衰老和死亡。1、細胞周期的概念 是指單個母細胞分

9、裂變成下一代子細胞的過程。按細胞生長分裂的能力將細胞分為：（1）結(jié)構(gòu)功能高度特異的細胞（如RBC）（2）通常情況下不分裂但受刺激時可被誘導開始DNA合成的某些細胞（如淋巴細胞，肝細胞）（3）正常情況下即具有較高的分裂活性的細胞（如生殖細胞、上皮細胞和造血干細胞等）2、細胞周期的分期細胞周期包括兩個時相：有絲分裂期（M期）和分裂間期增殖細胞的周期分為四個期（周期的長短因細胞而異）注：周期時間約24h，M期較短，在3060分鐘；分裂間期時間長。分裂間期包括：S,G1,G2三個期S期：母細胞遺傳物質(zhì)DNA復制合成的時期（10h）G2期：DNA合成結(jié)束到細胞有絲分裂開始前的特定時間（4.5h）G1期：

10、為M期后到細胞開始DNA復制合成前（612h）見下圖3、細胞周期的特點（1）單向性 即細胞沿G1 S G2 M方向推進（2）階段性 各期細胞的形態(tài)、代謝特點和功能有明顯差異，細胞可因某種原因而停滯于某時相，待生長條件合適后，細胞才過度到下一個時相。（3）時相交界處存在chk（check point，關鍵的時間限制點）（4）細胞周期的順利推進與細胞外信號等密切相關（三）細胞周期的調(diào)控環(huán)節(jié) 細胞周期的調(diào)控系通過細胞的周期素，也稱周期蛋白（cyclins）進行合成和降解，CDK有序的磷酸化和去磷酸化。1、cyclins 它是一組結(jié)構(gòu)類似能結(jié)合并調(diào)節(jié)CDK（蛋白質(zhì)磷酸化激酶）活性的蛋白家族。目前有14

11、各成員，cyclinA, B1, B2, C, D1, D2, D3, E, F, G1, G2, H, I, K。 它決定細胞自身是停留在分裂間期還是開始分裂的機制有非常重要的細胞生物學意義。如腫瘤就與細胞分裂分自我調(diào)控機制喪失有關。（1） cyclins的合成（2） cyclins的分解（3） cyclins的轉(zhuǎn)錄調(diào)控2、CDK CDK的激活，依賴于與cyclin的結(jié)合及其分子中某些氨基酸殘基的磷酸化狀態(tài)。即CDK需cyclin提供調(diào)節(jié)亞基，方能顯示活性。3、調(diào)節(jié)細胞周期進程的蛋白質(zhì)底物 Rb（視網(wǎng)膜母細胞瘤基因）蛋白和E2F（轉(zhuǎn)錄因子） CDK通過磷酸化某些蛋白質(zhì)底物，推動細胞周期進程。

12、G1期細胞內(nèi)，被CDK磷酸化的蛋白質(zhì)底物中，由Rb編碼的Rb蛋白是調(diào)控細胞由G1到S期的主要核磷酸蛋白。4、泛酸依賴性的蛋白水解與細胞周期調(diào)控5、周期素依賴性激酶抑制物（CKI） 它是一組分子量較小的能抑制CDK活性的功能蛋白。CKI主要包括INK4（CDK4抑制劑）和KIP等。 在細胞周期的適當時間點，能負調(diào)控CDK活性而控制細胞周期進程，從而抑制腫瘤的發(fā)生。屬于抑癌基因，目前發(fā)現(xiàn)的有：p21（WAFI / GIPI / SdiI / PIGI）p20（CAP）p27（KIPI）p16（INK4A / CDKN2 / MTS2）p15（INK4B / MTS2）（四）細胞分裂的控制1、細胞周

13、期驅(qū)動機制調(diào)控細胞周期的蛋白質(zhì)及其過程極為保守，至少有8種不同的cyclins和6種CDKs調(diào)控細胞周期。2、細胞周期進程的監(jiān)控機制細胞周期檢查點（chk）起到檢查站的管制作用。3、細胞周期與DNA修復周期運行中的細胞，發(fā)生DNA損傷、錯誤，將導致下一個細胞周期事件不能開始。DNA修復有切除修復：發(fā)現(xiàn)單個異常的堿基或核苷酸并予以替換。錯配修復：將局部一段重復錯配的寡核苷酸鏈切除，重新加以合成。4、胞外信號對細胞周期的調(diào)控機制細胞外部環(huán)境明顯的影響著細胞周期。細胞外信號包括增殖和抑制信號。（五）細胞增殖周期時相調(diào)控的分子機制1、G1期（1）細胞周期的起動位于G0-G1早期交界處的chk，決定細胞

14、是否進入G1期G1-S期交界處的chk則檢查DNA是否損傷，決定細胞能否進入S期胞外信號通過這兩個chk啟動DNA合成基因轉(zhuǎn)錄（2）G1期調(diào)控G1期的推動主要靠cyclinD，而后者的產(chǎn)生則依賴于有絲分裂原等的持續(xù)存在。如果去除有絲分裂原的刺激，細胞可從細胞增殖周期退回G0期或被阻滯于G1期。D或E型cyclin基因表達過高，可使G1期縮短cyclinD形成快，衰變?nèi)~快2、S期（1）DNA的合成S期的任務是進行DNA的復制與合成復制過程中需要cyclinE和A與CDK2結(jié)合形成cyclin/CDK復合物（2）S期的調(diào)控具有“開啟”和“關閉”精確的復制調(diào)控機制。以確保每段DNA在一個細胞周期中只

15、復制一次。（3）S期調(diào)控的影響因素有:cdc46,cdc6,DBF4,cdc7等影響因素Cdc46為細胞自G1晚期進入S期所必需，在M未期至下一細胞周期的S期間濃度較高。Cdc6有ATP/GTP酶的活性，可能與DNA解旋有關。缺乏cdc6的細胞，不能進行DNA復制。但能繼續(xù)細胞周期，而進入假有絲分裂狀態(tài)，使M期縮短。3、M期（1）有絲分裂（2）M期的調(diào)控主要與MPF和紡錘體裝配chk等功能有關二、細胞周期的調(diào)控異常與腫瘤細胞周期調(diào)控障礙，引起細胞增殖過度，甚至異常細胞的出現(xiàn)，從而導致腫瘤的發(fā)生。（一）細胞周期驅(qū)動機制障礙1、cyclins的異常cyclinD 和E過度表達與腫瘤發(fā)生有關。 cy

16、clinD 和E能縮短細胞G1期更快進入S期，而準備細胞分裂。2、CDKs的異常主要表現(xiàn)未CDK4和CDK6的過量表達。CDK4可能是TGF-介導增殖抑制的靶蛋白（二）細胞周期監(jiān)控機制障礙 周期調(diào)控相關蛋白的過表達或缺陷，特別是決定細胞G1-S期轉(zhuǎn)換的蛋白異常，使細胞周期進程超越或突破細胞周期chk，細胞不能發(fā)生周期阻滯、分化、衰老或凋亡，從而造成抑制后果，即惡性腫瘤形成。1、chk功能障礙2、CKI表達不足和突變（三）細胞周期界面聯(lián)系及其障礙 正負生長信號整合后，啟動G0期細胞進入增殖周期，經(jīng)過各chk后，將面臨三種主要選擇與歸宿：分裂、分化、死亡。1、細胞周期與細胞生長信號調(diào)控失常2、細胞

17、周期與癌基因/抑癌基因3、細胞周期與去分化4、細胞周期與凋亡失常以及腫瘤發(fā)生三、細胞周期調(diào)控與抗腫瘤治療各類cyclins, CDKs, CKIs和chk等因素作為細胞周期的調(diào)控機制，對細胞的增殖、；和凋亡具有關鍵的作用。腫瘤使一類細胞周期疾病，細胞啟動程序、檢查機制或信號傳導通路等任何一環(huán)節(jié)出現(xiàn)故障，都可使細胞周期進程失控，可使細胞不斷增殖和生長，最終可能發(fā)展未腫瘤，并可出現(xiàn)耐藥性。（一）限制CDKs的活性，抑制腫瘤細胞的過度生長（二）抑制cyclins的表達，阻抑瘤細胞的異常增殖（三）抑制E2F的活性，阻止腫瘤細胞的增殖（四）提高CKI的水平，減輕腫瘤細胞的增殖失控（五）增強p53的作用，

18、介導腫瘤細胞的凋亡（六）利用chk缺陷，加快腫瘤細胞的死亡 隨著對腫瘤研究的深入，人們已認識到腫瘤是一類多基因異常的疾病，無論是癌基因四激活還是抑癌基因的失活，都最終作用于細胞周期的調(diào)控，表現(xiàn)在增殖過快，凋亡過少的失控性生長。第三節(jié) 腫瘤的細胞與分子診斷病理學的發(fā)展始終是建立在新理論、新技術(shù)基礎上的。病理學診斷也由以形態(tài)學觀察為基礎逐步進入到分子水平，即細胞和分子診斷。分子病理學應用細胞分子生物學的理論和技術(shù)方法，將對人類疾病發(fā)生、發(fā)展、發(fā)病原因、發(fā)病機制、疾病的形態(tài)學變化，從傳統(tǒng)病理學的概念深入到從分子或基因水平加以認識。分子病理學研究主要以分子病為目標，其中研究最廣泛的、發(fā)展最快的是腫瘤分

19、子病理研究領域。一、細胞與分子診斷在腫瘤研究中的意義和應用特點： 靈敏度高、特異性強、適用范圍廣、取材一般不受組織和時相限制。應用：（1）人類遺傳病的基因診斷和產(chǎn)前診斷（2）腫瘤（3）感染性疾病病原體（病毒，細菌）（4）多基因?。?）組織器官移植配型（6）性別鑒定（7）法醫(yī)學（8）醫(yī)學分子生物學基礎研究應用1、腫瘤易感基因的檢測 因部分腫瘤的發(fā)生具有遺傳學基礎，故腫瘤遺傳相關的易感基因檢測對于腫瘤高危人群的篩選具有實用價值。2、腫瘤的分類 使用限制性酶切片段長度多態(tài)性，可判斷淋巴細胞增生與淋巴瘤及其克隆起源。3、腫瘤的早期診斷 K-ras基因突變是一些腫瘤（胰腺癌、結(jié)腸癌、肺癌）的早期行為。4

20、、腫瘤的預后判斷 根據(jù)某些相關基因的突變、擴增和過表達來判斷5、腫瘤的個體化和預見性治療 6、腫瘤的預后檢測二、腫瘤基因過表達及其檢測1、基因過表達的形式 以基因產(chǎn)物過表達危重要的形式之一2、基因過表達的檢測（1）表達產(chǎn)物的檢測ELISA，Western blot，流式細胞儀（2）基因擴增的檢測原位雜交，F(xiàn)ISH（熒光原位雜交） PCR Southern雜交（DNA分析），Northern雜交（RNA分析）三、基因突變及其檢測 突變的結(jié)果則使癌基因激活或抑癌基因失活，導致細胞表型發(fā)生變化和腫瘤發(fā)生。1、基因突變的形式（1）點突變：是基因在特定的位置上發(fā)生的一個核苷酸的改變，使相應蛋白質(zhì)的一個氨

21、基酸改變，繼而改變了蛋白質(zhì)的空間構(gòu)型和生物學行為。（2）基因缺失：基因片段的缺失，是另一種主要的突變形式。缺失的范圍差異較大。（3）基因易位或重排：某一基因在腫瘤細胞中從染色體的正常位置轉(zhuǎn)移到其它染色體的某各位置上。（4）其它類型的基因突變 如插入、甲基化、染色體非組蛋白改變等2、基因突變的檢測方法（1）PCRSSCP法（多聚酶鏈反應單鏈構(gòu)象多態(tài)性）（2）HA法（雜合雙鏈分析法）（3）突變體富集PCR法（4）變性梯度凝膠電泳法（DGGE）（5）化學切割錯配法（CCM）（6）等位基因特異性寡核苷酸分析法（ASO）（7）連接酶鏈反應（LCR）（8）等位基因特異性擴增法（ASA）（9）RNA酶A切割法（10）染色體分析（11）DNA序列分析四、生物芯片技術(shù)1991年Fodor