PCR檢測方法分析性能評價教學(xué)課件

1、 PCR檢測系統(tǒng)分析性能驗證 第1頁，共35頁。1 相關(guān)規(guī)定醫(yī)學(xué)實(shí)驗室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在基因擴(kuò)增檢驗領(lǐng)域的指南CNAS-GL xx 5.5.2) 實(shí)驗室應(yīng)在應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢驗之前驗證所使用的檢驗方法和程序的分析性能.對于定量檢測項目內(nèi)容至少包括正確度、精密度、可報告(或線性)范圍.對于定性檢測項目內(nèi)容應(yīng)包括靈敏度、特異性或符合率及重復(fù)性上海市醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗技術(shù)審核辦法 臨床基因擴(kuò)增檢驗實(shí)驗室在技術(shù)審核前應(yīng)完成擬開展檢測項目方法學(xué)驗證。方法學(xué)驗證實(shí)驗應(yīng)包括但不限于：精密度、正確度、檢測限、線性范圍、可報告范圍、特異性試驗第2頁，共35頁。2 什么情況下要做性能驗證開展新項目更換檢測系統(tǒng):

2、更換儀器或試劑第3頁，共35頁。3 分析性能驗證項目對配套系統(tǒng),一般驗證以下指標(biāo) 精密度 準(zhǔn)確度 可報告范圍 參考區(qū)間對非配套系統(tǒng)除驗證上述指標(biāo)外 分析靈敏度 分析特異性第4頁，共35頁。4 依據(jù)文件(CLSI 文件)EP5-A2:定量測量方法的精密度性能評價EP6-A:定量測量方法的線性評價EP7-A:臨床化學(xué)的干擾實(shí)驗EP9-A2:用患者樣本進(jìn)行方法學(xué)比對及偏倚評估EP12-A2:定性實(shí)驗方法評價用戶協(xié)議EP15-A2: 用戶對精密度和準(zhǔn)確度核實(shí)試驗EP17-A: 檢出限和定量檢出限確定方案C28-A2: 醫(yī)學(xué)實(shí)驗室參考區(qū)間的定義和確定第5頁，共35頁。5 性能驗證前的準(zhǔn)備應(yīng)熟悉待驗證的檢

3、測系統(tǒng)應(yīng)熟悉驗證方案的步驟(PCR檢測項目成本高、陽性標(biāo)本來源困難,精密度和正確度驗證可以采用EP15-A2 文件)制定質(zhì)量保證措施確保足夠的樣本數(shù)量和覆蓋較寬檢測范圍確定比較方法第6頁，共35頁。6 EP15-A2:精密度和準(zhǔn)確度性能的用戶驗證實(shí)驗室驗證方法的操作與廠家的申明一致為驗證重復(fù)性、實(shí)驗室內(nèi)精密度的申明提供方案和數(shù)據(jù)分析其他的 CLSI 文件為廠家做出精密度(EP5-A2)和準(zhǔn)確度(EP9-A2)的申明提供指南第7頁，共35頁。7 精密度驗證重復(fù)性:指在相同條件 (時間、操作者、儀器)下獲得的精密度,也稱批內(nèi)精密度實(shí)驗室內(nèi)精密度:同一實(shí)驗室內(nèi)，使用相同的設(shè)備, 在不同時間內(nèi)獲得的精

4、密度,也稱總精密度.(不包括大的設(shè)備維護(hù)、儀器校準(zhǔn)和更換試劑批號等)第8頁，共35頁。8 實(shí)驗要求試劑:同一批號實(shí)驗樣本 以前分析過的病人樣本 其他已知值的物質(zhì) 濃度要求: 醫(yī)學(xué)決定水平 廠家說明書精密度指標(biāo)所用濃度 內(nèi)容 重復(fù)性 實(shí)驗室內(nèi)精密度第9頁，共35頁。9 實(shí)驗步驟根據(jù)廠家申明的精密度比例關(guān)系可分為3種情況: 1)如果批內(nèi)2/3 總:每天分析1批次,2個濃度,每個濃度重復(fù)測定3次,連續(xù)3天. 3)如果批內(nèi)與 總相對關(guān)系未知:每天分析1批次,2個濃度,每個濃度重復(fù)測定4次,連續(xù)5天. 每天做室內(nèi)質(zhì)控,如果失控,剔除數(shù)據(jù),重新進(jìn)行測定實(shí)驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)處理:批內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差、實(shí)驗室內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差第10

5、頁，共35頁。10 結(jié)果判斷重復(fù)性驗證:批內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差廠家申明,則通過計算驗證值進(jìn)行差異的顯著性檢驗, 批內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差驗證值驗證通過實(shí)驗室內(nèi)精密度驗證:實(shí)驗室內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差廠家申明,則通過計算驗證值進(jìn)行差異的顯著性檢驗, 實(shí)驗室內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差驗證值,驗證通過 第11頁，共35頁。11 準(zhǔn)確度與正確度、精密度的關(guān)系準(zhǔn)確度正確度均值與真值的接近程度系統(tǒng)誤差偏倚(bias)精密度重復(fù)測量結(jié)果之間的接近程度隨機(jī)誤差標(biāo)準(zhǔn)差(SD)第12頁，共35頁。12 正確度驗證比對方法:用臨床病人樣本進(jìn)行方法學(xué)比對,類似EP9- A2文件參考物質(zhì) 第13頁，共35頁。13 兩種方法間病人標(biāo)本結(jié)果的比較實(shí)驗設(shè)計: 1)收集20份病人樣本

6、,其濃度分布整個線性范圍,不使 用超出線性范圍的標(biāo)本 2)在3-4天時間內(nèi),每天用實(shí)驗和比對方法測定5-7份樣本 3)每天做室內(nèi)質(zhì)控,如果失控,剔除,問題糾正后重新測定該批標(biāo)本 第14頁，共35頁。14 實(shí)驗數(shù)據(jù)處理 計算每個標(biāo)本兩種方法間結(jié)果的差異 偏倚bi=實(shí)驗方法結(jié)果i-比較方法結(jié)果i 偏倚%=100%(實(shí)驗方法結(jié)果i-比較方法結(jié)果i)/比較方法結(jié)果I畫出每個標(biāo)本兩種方法結(jié)果的偏倚或百分比偏倚圖,比較兩種方法間在檢測的濃度范圍內(nèi)標(biāo)本結(jié)果差異是否一致計算兩種方法間的平均偏倚計算偏倚或百分比偏倚的標(biāo)準(zhǔn)差 第15頁，共35頁。15 結(jié)果判斷如果偏倚廠家指標(biāo)(實(shí)驗室指標(biāo)),則通過計算驗證值進(jìn)行差

7、異的顯著性檢驗, 在驗證限范圍內(nèi),驗證通過 第16頁，共35頁。16選擇廠家申明中使用的比較方法為本方案的比較方法如兩種方法在檢測的濃度范圍內(nèi)標(biāo)本結(jié)果差異不一致,應(yīng)參考EP9-A2文件(用病人標(biāo)本進(jìn)行方法學(xué)比對和偏倚評估)來進(jìn)行實(shí)驗第17頁，共35頁。17 使用參考物質(zhì)的正確度方案參考物質(zhì) 1)新鮮冰凍人血清或其他一些未摻入成分的人體物質(zhì): 已用參考方法或決定性方法定值 2)從能力比對實(shí)驗中獲得的參考物 3)廠家提供的正確度確認(rèn)物或質(zhì)控物 4)實(shí)驗室室間質(zhì)評物被眾多的實(shí)驗室分析,他們的均值可用于評估一致性 5)由第三方提供的已用一些不同方法定值的物質(zhì)第18頁，共35頁。18 實(shí)驗步驟至少2個物

8、質(zhì),濃度為可報告范圍中高和低的測量范圍在3-5天內(nèi)每天測定一次,每次重復(fù)2次將結(jié)果與設(shè)定要求進(jìn)行比較,比如與能力比對實(shí)驗組織者的接受標(biāo)準(zhǔn)或醫(yī)學(xué)允許總誤差來比較第19頁，共35頁。19定量檢出限的驗證(EP17-A)第20頁，共35頁。20 概念能可靠檢出分析物的最低實(shí)際濃度,并在該濃度下的總誤差符合準(zhǔn)確度要求總誤差目標(biāo)來源:實(shí)驗室的需求、室間質(zhì)評結(jié)果、廠家的申明第21頁，共35頁。21 實(shí)驗樣本低濃度參考物質(zhì)已知濃度或活性的樣品適當(dāng)稀釋成3-5個低濃度實(shí)驗樣品第22頁，共35頁。22 實(shí)驗步驟至少25個重復(fù)測量每個樣品重復(fù)測量的結(jié)果與該樣品的參考值比較,以確定是否超出目標(biāo)誤差,超過誤差目標(biāo)的結(jié)

9、果數(shù)量可用于評價此方法在該濃度是否合適.第23頁，共35頁。2320-1000個檢測值符合超出LoB預(yù)期95%比例的下限 檢測數(shù) 觀察比例的下限(%)檢測數(shù) 觀察比例的下限(%）20 8530 8740 8850 8860 8870 8980 8990 90100 90 150 91200 92250 92300 92400 93500 931000 94第24頁，共35頁。24 分析測量范圍:概念分析測量范圍(線性范圍):指患者樣本未經(jīng)任何處理(稀釋、濃縮或其他預(yù)處理),由檢測系統(tǒng)直接測量得到的可靠結(jié)果范圍,在此范圍內(nèi)一系列不同樣本分析物的測量值與其實(shí)際濃度(真值)呈線性比例關(guān)系.臨床可報告

10、范圍:指定量檢測項目向臨床能報告的檢測范圍,患者樣本可經(jīng)稀釋、濃縮或其他預(yù)處理.線性:檢測樣本時,在一定范圍內(nèi)可以直接按比例關(guān)系得出分析物含量的能力.第25頁，共35頁。25 實(shí)驗樣品準(zhǔn)備選擇與臨床樣本同樣的基質(zhì),不含干擾物質(zhì); 或廠家推薦的產(chǎn)品數(shù)量 驗證實(shí)驗:5-7個不同濃度的樣本,高值樣本應(yīng)高于線性上限30%,低值樣本低于線性下限, 第26頁，共35頁。26 實(shí)驗方法上限的高值樣本按一定比例稀釋為至少5種濃度,按試劑說明書操作,將每一濃度樣本重復(fù)檢測2次,計算線性相關(guān)系數(shù)第27頁，共35頁。27 結(jié)果判斷線性范圍應(yīng)符合制造商規(guī)定的要求,且線性相關(guān)系數(shù)|r|0.97第28頁，共35頁。28定

11、性檢測項目的性能驗證第29頁，共35頁。29 兩種方法診斷明確的定性檢測性能評估:靈敏度、特異性診斷不明確的定性檢測性能評估:結(jié)果的一致性, Kappa值表示第30頁，共35頁。30 診斷明確的定性檢測比較方法:目前正在使用的、”金標(biāo)準(zhǔn)”方法、某種定量方法或臨床診斷樣本要求:量足夠大,穩(wěn)定樣本數(shù)量:取決于評價者的目的結(jié)果不一樣標(biāo)本的處理:用金標(biāo)準(zhǔn)或參考方法明確結(jié)果第31頁，共35頁。31 檢測方法與明確診斷比較2*2列聯(lián)表檢測方法 明確診斷 陽性 陰性 總數(shù)陽性 A B A+B陰性 C D C+D總數(shù) A+C B+D A+B+C+D靈敏度=100%A/(A+C) 特異性=100%B/(B+D)陽性預(yù)測值=100%A/(A+B)陰性預(yù)測值=100%A/(A+C)檢驗效能=100%(A+D)/N第32頁，共35頁。32 診斷不明確的定性檢測項目性能評估 檢測方法、可比較方法一致程度比較 可比較方法 檢測方法 陽性 陰性 總計陽性 a b a+b陰性