植物組織培養(yǎng)實驗室組成儀器設(shè)備以及基本操作精要

1、關(guān)于植物組織培養(yǎng)實驗室的組成儀器設(shè)備及基本操作精要第一張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月一、植物組織培養(yǎng)實驗室的結(jié)構(gòu)及設(shè)計要求： 完整的植物組織培養(yǎng)室通常包括洗滌室、化學實驗室、接種室、培養(yǎng)室、細胞學實驗室等部分?？梢愿鶕?jù)實際需要和條件進行設(shè)計。 但從功能上至少包括準備室（化學實驗室）、接種室以及培養(yǎng)室三部分，并且按順序排列。 在化學實驗室與接種室之間應(yīng)留有緩沖空間。第一節(jié) 實驗室結(jié)構(gòu)、儀器設(shè)備及操作技術(shù)第二張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（一）準備室（化學實驗室）： 1. 主要功能： 用于培養(yǎng)器皿的清洗、干燥、培養(yǎng)基的配制、分裝和滅菌、試管苗的出瓶及整理等工作。 第三張，P

2、PT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月2. 主要儀器設(shè)備及用品： 藥品柜、實驗臺、水槽、超聲波洗滌儀、涼干架、干燥箱、各種玻璃器皿（燒杯、量筒、容量瓶、試劑瓶、三角瓶等）、蒸餾水制造裝置。 天平、移液器、 pH計、水浴鍋、微波爐、電爐、磁力攪拌器、蠕動泵、及培養(yǎng)基分裝用品等、高壓滅菌鍋、 冰箱。第四張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）接種室（無菌操作室）： 1、功能： 接種材料的滅菌、接種以及培養(yǎng)物的繼代轉(zhuǎn)接等。 接種室要求保持潔凈，與化學實驗室之間應(yīng)設(shè)置緩沖室。第五張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月2、儀器設(shè)備及用品： 超凈工作臺、紫外燈、小推車、擱架、磁盤、接種工具（各種

3、鑷子、解剖刀、手術(shù)剪、普通剪刀接種針、酒精燈、手持噴霧器、細菌過濾器等）等。第六張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）培養(yǎng)室： 1、功能： 主要用于植物材料的培養(yǎng)。 要求室內(nèi)潔凈并能保持一定的溫度、光照以及濕度，以促進植物材料的生長和分化。第七張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月2、儀器設(shè)備及用品： 培養(yǎng)架及燈管、搖床（振蕩器）、空調(diào)、自動定時器、加濕及除濕器、光照培養(yǎng)箱等。第八張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（四）細胞學實驗室： 1、功能： 主要用于培養(yǎng)材料的顯微觀察及照相等。第九張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月2、儀式設(shè)備及用品： 體視顯微鏡、普通顯微鏡

4、、倒置顯微鏡、熒光顯微鏡、配套顯微照相裝置、普通相機或數(shù)碼相機、切片機及配套制片及染色用品等。第十張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月體視顯微鏡用途：放大倍數(shù)580倍主要用于植物形態(tài)分化的觀察、莖尖的切取。第十一張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月普通光學顯微鏡用途：用于植物切片觀察，確定植物的發(fā)育進程，如：不定芽、不定胚的分化過程以及其它器官組織的分化等。第十二張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月倒置顯微鏡用途：主要用于細胞、原生質(zhì)體的細胞分裂和細胞團形成的觀察。第十三張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（一）洗滌： 1. 普通器皿：采用洗衣粉、洗潔精等中性洗滌劑洗滌

5、。 2. 難清洗器皿及移液管等：用水清洗后再用重鉻酸鉀洗液浸泡，最后清水沖洗，或用超聲波儀清洗。 重鉻酸鉀洗液的配制方法：43g重鉻酸鉀溶于1000ml蒸餾水中，將濃硫酸緩慢倒入重鉻酸鉀溶液中，濃度比例為1：1。二、實驗室基本操作：第十四張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 1、器具滅菌：培養(yǎng)皿、解剖刀、鑷子等用品。 （1）干熱滅菌：鋁箔包好后，放于恒溫干燥箱內(nèi)，150 保溫2小時，成本較高。 （2）高壓蒸汽滅菌：高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)120 1520分鐘 。 （3）灼燒滅菌：接種時，解剖刀及鑷子等浸入95乙醇，然后取出在酒精燈火焰上灼燒殺菌。（二）滅菌： 滅菌 是指用物理和化學方法殺死物體表

6、面和內(nèi)部的所有微生物（包括芽胞），使之呈無菌狀態(tài)。經(jīng)過滅菌的物品稱“無菌物品”。第十五張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月2、培養(yǎng)基滅菌： 采用高壓蒸汽滅菌。120 1520分鐘。 培養(yǎng)基體積越大，滅菌時間越長。第十六張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月高溫高壓滅菌對培養(yǎng)基成分的影響：a.pH值普遍下降。b.產(chǎn)生混濁或沉淀，這主要是由于一些離子發(fā)生化學反應(yīng)而產(chǎn)生混濁或沉淀。例如Ca+2與PO4-3化合，就會產(chǎn)生磷酸鈣沉淀。c.不少培養(yǎng)基顏色加深。d.體積和濃度有所變化。e.營養(yǎng)成分有時受到破壞。第十七張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月3、不耐高溫材料的滅菌： 采用過濾滅菌，

7、如IAA、ZT、天然有機添加物等。第十八張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月4、外植體的表面滅菌： 采用7075乙醇（10-30秒）、有效氯1的次氯酸鈉（5-30分鐘）、0.10.2%的氯化汞（2-15分鐘）等殺菌劑中加入幾滴吐溫20或80（Tween20或80）效果較好。第十九張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）無菌操作： 1、保持接種室的無污染環(huán)境，定期熏蒸或噴霧處理。接種前打開超凈工作臺及紫外燈照射20-30分鐘，關(guān)閉紫外等燈后使氣體散出后開始操作。 2、保持超凈工作臺的潔凈：接種前用70乙醇擦拭臺面或用噴壺噴霧，操作前，將手和手臂用70乙醇消毒，所需試驗用品用乙醇擦拭

8、后放入超凈工作臺。第二十張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月3、點燃酒精燈，進行操作，接種材料前后，灼燒瓶口，工具要灼燒徹底，防止交叉污染。4、保持培養(yǎng)室的潔凈，發(fā)現(xiàn)污染及時挑出，以減少污染源。5、操作中穿工作服、戴口罩、工作帽，出入接種室換拖鞋以保持接種室的潔凈。第二十一張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月第二章 植物組織培養(yǎng)實驗室的組成、儀器設(shè)備及基本操作第一節(jié) 實驗室結(jié)構(gòu)、儀器設(shè)備及操作技術(shù) 一、植物組織培養(yǎng)實驗室的結(jié)構(gòu)及設(shè)計要求 二、 實驗室基本操作第二十二張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月第二章 植物組織培養(yǎng)實驗室的組 成、儀器設(shè)備及基本操作第二節(jié) 培養(yǎng)基的組成、

9、配制與滅菌第二十三張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月一、培養(yǎng)基（medium）的組成和作用 通常植物組織培養(yǎng)所用培養(yǎng)基包括以下六大類成分，即礦質(zhì)營養(yǎng)、有機成分、植物生長調(diào)節(jié)劑、碳源、瓊脂以及其他附加物等。培養(yǎng)基的主要指標是: 營養(yǎng)成分的濃度 植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的濃度第二十四張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（一）礦質(zhì)營養(yǎng)： 礦質(zhì)營養(yǎng)又稱無機營養(yǎng)，是指植物生長發(fā)育所需要的各種化學元素。 第二十五張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月礦質(zhì)元素的生理作用：（1）組成各種化合物，成為結(jié)構(gòu)物質(zhì)；（2）許多酶和附酶的組成部分，參與代謝；（3）維持離子平衡、膠體穩(wěn)定及電荷平衡等電化學作用；

10、（4）影響形態(tài)發(fā)生和組織、器官的建成等。 第二十六張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 根據(jù)植物對元素的吸收量，可以把植物必需元素分為大量元素和微量元素。 國際植物生理學會規(guī)定植物所需濃度大于0.5 mmol/l的的元素稱為大量元素。低于0.5 mmol/l的元素稱為微量元素。 大量元素：C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S 分別占植物干重的百分數(shù)為18、10、70、0.3%、0.07、0.3%、0.3 、0.07%、0.05。 微量元素：Fe、B、Mn、Zn、Mo、Cu、Co、Cl等。第二十七張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月1、大量元素： N、P、K、Ca、Mg、S等6種大

11、量元素依靠各種無機鹽提供。 不同植物種類和不同試驗?zāi)康膶υ氐氖褂昧恳蟛煌?，需?jīng)試驗確定。 目前已選擇出多種培養(yǎng)基配方用于植物組織培養(yǎng)。其中以MS應(yīng)用最廣泛。 以MS為例6中礦質(zhì)元素分別由KNO3、NH4NO3、KH2PO4、MgSO47H2O、CaCl24H2O提供。 第二十八張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十九張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 大量元素中的氮通常采用硝態(tài)氮或銨態(tài)氮，但銨態(tài)氮濃度過高會對有些植物的培養(yǎng)物造成傷害，不適宜使用過高的濃度，可以用谷氨酸、絲氨酸等來代替。第三十張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月2、微量元素： 植物組織的對其需要量極少

12、，過多會產(chǎn)生毒害，如造成蛋白質(zhì)變性、酶失活,代謝障礙等。 各種微量元素均具有特定的生理功能，如硼與蛋白質(zhì)的合成及糖類的運輸有關(guān)；銅能促進離體根的形成；錳參與植物的光合作用和呼吸作用；鉬為氮素代謝的重要元素。 第三十一張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十二張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 微量元素中，鐵的用量較大，它對葉綠素的合成起重要作用，由于在較高pH下，F(xiàn)eCl3極易形成Fe（OH）3沉淀，難以被吸收，所以多用乙二胺四乙酸二鈉鹽與硫酸亞鐵形成的螯合物，并且單獨配制。第三十三張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十四張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（二

13、）有機成分： 主要包括各種維生素和氨基酸 常用的維生素：硫胺素（VB1）、吡哆醇（VB6）、煙酸（VB3）、泛酸鈣（VB5）、生物素、鈷胺素（VB12）、葉酸等。 常用的氨基酸：甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰氨、丙氨酸等。 有時添加水解乳蛋白或水解酪蛋白，為牛乳經(jīng)酶法加工的水解產(chǎn)物，含有20種氨基酸的混合物，用量101000mg/L, 通常用于原生質(zhì)體等培養(yǎng)。 此外肌醇是另外一種重要的有機成分，在維持離子平衡，糖類的轉(zhuǎn)化中起重要作用，此外還參與磷脂代謝及等生理作用。它可以促進愈傷組織的形成，不定芽、不定胚的分化。第三十五張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月第三

14、十六張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)： 植物激素是植物代謝中產(chǎn)生的天然化合物，它能直接影響植物細胞的分化、分裂以及影響植物的形態(tài)建成、開花、結(jié)實、成熟、衰老脫落、休眠、萌發(fā)等生理活動。 在植物組織培養(yǎng)中，主要通過植物激素及生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對離體的組織、器官的形態(tài)發(fā)生進行調(diào)控。包括誘導細胞分裂、愈傷組織的生長、根芽的分化以及體細胞胚胎發(fā)生等。 第三十七張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 常用的植物激素及生長調(diào)節(jié)物涉及五大類植物激素：1、生長素類：2、細胞分裂類：3、赤霉素類：4、脫落酸：5、多胺6、乙烯：第三十八張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月1、生

15、長素類： 組織培養(yǎng)中的功能是：促進細胞伸長生長和細胞分裂，誘導形成愈傷組織，促進生根。 常用的有NAA、IAA、IBA、2,4D等。第三十九張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月2、細胞分裂素類： 功能：誘導芽的分化、促進側(cè)芽萌發(fā)；促進細胞分裂和擴大，促進莖增粗，抑制莖伸長；延緩衰老。 常用細胞分裂素有BA、KT、ZT、2ip等。第四十一張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十二張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十三張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 此外近年來發(fā)現(xiàn)苯基脲衍生物具有非常高的細胞分裂素活性，在多種植物

16、上應(yīng)用。 如TDZ，CPPU，4PU等。第四十四張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十五張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月3、赤霉素類： 主要具有誘導莖的細胞伸長，對根無效；對形成層細胞分化有影響，與生長素協(xié)同作用；可以誘導離體成花；打破休眠等功能。 常用GA3、GA4等。第四十六張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十七張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月4、脫落酸（ABA）： 促進休眠、衰老和脫落。組織培養(yǎng)中較少使用，主要用于種質(zhì)資源的離體保存。第四十八張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十九張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月5、乙烯： 主

17、要促進衰老和脫落，高濃度易形態(tài)變化。第五十張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月第五十一張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（四）碳源： 碳源主要為細胞提供合成新化合物的骨架，為細胞的呼吸代謝提供底物與能源，此外還能維持一定的滲透壓。 常用的碳源主要是蔗糖，使用濃度在1050g/L，此外果糖、葡萄糖、麥芽糖、山梨糖、甘露糖及可溶性淀粉等也常用于植物組織培養(yǎng)。第五十二張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（五）瓊脂： 瓊脂作為固化劑用于組織培養(yǎng)中，起支持植物的作用，不提供營養(yǎng)，為海藻中提取的一種高分子化合物，僅溶于熱水（90 oC以上），成為凝膠，冷卻后（40 oC以下）即凝固為凝

18、膠。 瓊脂的用量通常在410g/L。 第五十三張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（六）有機附加物： 1、椰子汁： 用量為100200g/L。 2、香蕉泥： 使用量為150200g/L。 3、蘋果汁、番茄汁等。第五十四張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（七）其他成分： 1、活性炭：使用量為0 .2-1%。 2、抗生素：常用青霉素、鏈霉素、慶大霉素等，用量在520mg/L。 3、抑制酚類物質(zhì)：抗壞血酸. 4、生長抑制劑： 常用矮壯素、比久（B9）、多效唑（pp333） 、三碘苯甲酸、根皮酚等.第五十五張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月二、培養(yǎng)基的類型：1、高鹽濃度培養(yǎng)基：M

19、S、B5、SH等。 適用于多數(shù)營養(yǎng)需求量較大的植物。2、低鹽培養(yǎng)基：WPM、 White、 Nitsh等。 適用于木本植物的培養(yǎng)。第五十六張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月表1MS培養(yǎng)基的組成配方組成成分數(shù)量(mg/l)組成成分數(shù)量(mg/l)NH4NO31650 Na2-EDTA37.3 KNO31900 FeSO47H2O 27.8 CaCl22H2O 440 CuSO45H2O 0.025 MgSO47H2O 370 蔗糖 30 KH2PO4170 pH 5.8 KI0.83 肌醇 100.0 H3BO36.2 煙酸 0.5 MnSO44H2O22.3 鹽酸吡哆醇 0.5 ZnS

20、O47H2O8.6 甘氨酸 2.0 Na2MoO42H2O0.25 鹽酸硫銨等 0.4 CoCl26H2O0.025 第五十七張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月表2B5培養(yǎng)基的組成和配方組成成分 數(shù)量(mg/l） 組成成分 數(shù)量(mg/l) KNO3 2500 FeSO47H2O 27.8 CaCl22H2O 150 CuSO45H2O 0.025 MgSO47H2O 250 蔗糖40 (NH4)2SO4 134 pH 5.5KI 0.75 肌醇 100 H3BO4 3.0 煙酸 1.0 MnSO44H2O 10 鹽酸吡哆醇 1.0 ZnSO47H2O 2.0 激動素 0.1 Na2M

21、oO42H2O0.25 2,4D 0.11.0 CoCl26H2O0.025 鹽酸硫銨 10 Na2-EDTA37.3 第五十八張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 表3 N6培養(yǎng)基的組成和配方組成成分 數(shù)量(mg/l)組成成分(mg/l) KNO3 2.3 Na2EDTA 37.3 CaCl22H2O 166 FeSO47H2O 27.8 MgSO47H2O 185 蔗糖 50 KH2PO4 400 pH 5.8 (NH4)2SO4 463 煙酸 0.5 KI 0.8 鹽酸吡哆醇 0.5 H3BO3 1.6 甘氨酸 2.0 MnSO44H2O 4.4 鹽酸硫銨 1.0 ZnSO47H2

22、O1.5 第五十九張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月三、培養(yǎng)基母液及激素母液的配制： 由于培養(yǎng)基中元素用量少，種類多，因此每次稱量繁瑣，因此通常將各種營養(yǎng)成分配制成母液保存。 大量元素 微量元素 有機營養(yǎng) 激素 第六十張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月1、器皿和用具的準備 儀器包括萬分之一天平，百分之一天平，pH計 用品包括不同型號的燒杯（2000ml、1000ml、100ml），容量瓶（1000ml、500ml、100ml）、移液管（10ml、5ml、2ml、1ml）、試劑瓶若干（1000ml、250ml）、移液器（1000ul、200ul）、滴管、玻璃棒、試管、各種規(guī)格三角

23、瓶（150ml、100ml、50ml）、培養(yǎng)基分裝器，漏斗、稱量紙、標簽紙、不同范圍pH試紙、鉛筆等。 玻璃器皿用前清洗干凈。 第六十一張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月2、藥品及蒸餾水準備： 藥品采用分析純或化學純試劑。 水利用蒸餾水或去離子水。第六十二張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月3、母液配制： （1）配制母液原則： 相同類型的試劑混合；易形成沉淀的藥品分開；母液濃度要適宜；用量要認真計算和核對； 藥品要準確稱量。第六十三張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 （2）MS培養(yǎng)基母液的配制： MS培養(yǎng)基母液根據(jù)試劑特性通常配成四種母液，即大量元素母液（10或20倍）、微量元素母液（100或1000倍）、Fe鹽（100倍）、有機物（100倍）。 配置前先進行根據(jù)培養(yǎng)基組成和配制體積計算母液試劑用量，然后稱取藥品，大量元素可以用百分之一或千分之一天平，微量元素，鐵鹽和有機物用萬分之一天平稱量。第六十四張，