乙肝表面抗原及乙肝兩對半檢測課件

1、乙肝表面抗原及乙肝兩對半檢測(ppt)（優(yōu)選）乙肝表面抗原及乙肝兩對半檢測檢測的方法及原理檢測方法及原理膠體金免疫層析法Part 1 膠體金免疫層析法 將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在膜上，膠體金標記試劑（抗體或單克隆抗體）吸附在結(jié)合墊上，當待檢樣本加到試紙條一端的樣本墊上后，通過毛細作用向前移動，溶解結(jié)合墊上的膠體金標記試劑后相互反應(yīng)，再移動至固定的抗原或抗體的區(qū)域時待檢物與金標試劑的結(jié)合物又與之發(fā)生特異性結(jié)合而被截留，聚集在檢測帶上，可通過肉眼觀察到顯色結(jié)果。檢測方法及原理膠體金免疫層析法Part 2酶免疫技術(shù) 以酶標記的抗體（或抗原）作為主要試劑，將抗原抗體的特異性和酶高效催化反應(yīng)的專

2、一性相結(jié)合的一種免疫檢測技術(shù)。酶結(jié)合物既保留抗體（或抗原）的免疫學活性，又保留酶對底物的催化活性。特點：靈敏度高、特異性強、準確性好、試劑穩(wěn)定、方法簡便易行檢測方法及原理Part 2兩對半ELISA檢測原理 ELISA是以免疫學反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗技術(shù)。由于抗原、抗體的反應(yīng)在一種固相載體聚苯乙烯微量滴定板的孔中進行，每加入一種試劑孵育后，可通過洗滌除去多余的游離反應(yīng)物，從而保證試驗結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。在實際應(yīng)用中，通過不同的設(shè)計，具體的方法步驟可有多種。即:用于檢測抗體的間接法、用于檢測抗原的雙抗體夾心法以及用于檢測小分

3、子抗原或半抗原的抗原競爭法等等。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法。檢測方法及原理Part 2兩對半ELISA檢測原理 1 HBsAg：雙抗體夾心法 正比 單克隆HBsAbHBsAg多克隆HBsAbHRP 2 HBsAb：雙抗原夾心法 正比 HBsAgHBsAbHBsAgHRP 檢測原理Part 2兩對半ELISA檢測原理 3 HBeAg：雙抗體夾心法 正比 單克隆HBeAbHBeAg多克隆HBeAbHRP 4 HBeAb：競爭抑制法 反比 多克隆HBeAbHBeAgHBeAbHRP / HBeAb（標本） 5 HBcAb：競爭抑制法 反比 HBcAgHBcAbHRP / H

4、BcAb（標本）檢測方法及原理Part 3免疫定量分析方法 近年來，隨著抗病毒藥物的不斷問世，以及抗病毒藥物療效與乙肝病毒及其血清標志物水平之間關(guān)系的相關(guān)研究不斷深入，單純HBsAg定性檢測在療效的監(jiān)測，特別是根據(jù)其早期變化對遠期療效進行預(yù)測方面，顯得越來越難以滿足要求。而且，很多學者對一些新藥上市注冊臨床試驗結(jié)果進行分析發(fā)現(xiàn)，HBsAg的定量檢測在抗病毒治療療效的監(jiān)測方面確有非常重要的意義。因此，HBsAg的定量檢測就顯得十分重要。檢測方法及原理Part 3免疫定量分析方法 要想完成HBsAg定量檢測，必須滿足以下條件： 采用自動分析系統(tǒng)， 有可溯源的標準品， 測定結(jié)果與標準品之間有線性關(guān)系

5、。檢測方法及原理Part 3免疫定量分析方法 化學發(fā)光技術(shù)是近二十年來發(fā)展非常迅速的非放射性免疫分析技術(shù)。 化學發(fā)光免疫測定（Chemiluminesent Immunoassay，CLIA）是免疫測定技術(shù)繼酶免技術(shù)（EIA）、放免技術(shù)（RIA）、熒光免疫技術(shù)（FIA）之后發(fā)展的一項新興測定技術(shù)。由于這種測定具備很高的特異性和很小的干擾，因此，如同RIA、FIA等一樣利用免疫反應(yīng)的特異性和化學發(fā)光本身的信號特異性形成了目前所說的化學發(fā)光免疫測定（CLIA）技術(shù)。檢測方法及原理Part 3免疫定量分析方法 原理： 化學發(fā)光免疫分析儀是通過檢測患者血清從而對人體進行免疫分析的醫(yī)學檢驗儀器。將定量的

6、患者血清和辣根過氧化物（HRP）加入到固相包被有抗體的白色不透明微孔板中，血清中的待測分子與辣根過氧化物酶的結(jié)合物和固相載體上的抗體特異性結(jié)合。分離洗滌未反應(yīng)的游離成分。然后，加入魯米諾Luminol發(fā)光底液 ，利用化學反應(yīng)釋放的自由能激發(fā)中間體，從基態(tài)回到激發(fā)態(tài)，能量以光子的形式釋放。此時，將微孔板置入分析儀內(nèi)，通過儀器內(nèi)部的三維傳動系統(tǒng)，依次由光子計數(shù)器讀出各孔的光子數(shù)。樣品中的待測分子濃度根據(jù)標準品建立的數(shù)學模型進行定量分析。最后，打印數(shù)據(jù)報告，以輔助臨床診斷。方法步驟 實驗步驟 備注：因各廠家生產(chǎn)試劑操作方法不同，故參見試劑盒說明書結(jié)果判斷及臨床意義一、結(jié)果判斷結(jié)果判斷Part 1膠體

7、金免疫層析法結(jié)果判斷 以艾康生物檢測試劑盒為例：陽性（+）：兩條紅色條帶出現(xiàn)，一條位于測試區(qū)（T）內(nèi)，另一條位于質(zhì)控區(qū)（C）。陽性結(jié)果表明：標本中含有待測物質(zhì)。陰性（-）：僅質(zhì)控區(qū)（C）出現(xiàn)一條紅色條帶，在測試區(qū)（T）內(nèi)無紅色條帶出現(xiàn)。陰性結(jié)果表明：標本中檢測不出待測物質(zhì)。無效：質(zhì)控區(qū)（C）未出現(xiàn)紅色條帶，表明不正確的操作過程或試紙條已變質(zhì)損壞。在任何情況下，應(yīng)重新測試。如果問題仍然存在，應(yīng)立即停止使用此批號產(chǎn)品，并與當?shù)毓?yīng)商聯(lián)系。注意：測試區(qū)（T）內(nèi)的紅色條帶可顯現(xiàn)出顏色深淺的現(xiàn)象。但是，在規(guī)定的觀察時間內(nèi)，不論該色帶顏色深淺，即使只有非常弱的色帶也應(yīng)判為陽性結(jié)果。結(jié)果判斷Part 1膠體

8、金免疫層析法結(jié)果判斷陽性（+）：僅質(zhì)控區(qū)（C）出現(xiàn)一條紅色條帶，在測試區(qū)（T）內(nèi)無紅色條帶出現(xiàn)。陽性結(jié)果表明：標本中含有待測抗體。弱陽性（+）：質(zhì)控區(qū)（C）出現(xiàn)一條紅色條帶，在測試區(qū)（T）內(nèi)有非常弱的紅色條帶出現(xiàn)。弱陽性結(jié)果表明：標本中含有少量待測抗體。陰性 （-）：兩條紅色條帶出現(xiàn)，一條位于測試區(qū)（T）內(nèi)，另一條位于質(zhì)控區(qū)（C）。陰性結(jié)果表明：標本中檢測不出待測抗體。無效：質(zhì)控區(qū)（C）未出現(xiàn)紅色條帶，表明不正確的操作過程或試紙條已變質(zhì)損壞。在任何情況下，應(yīng)重新測試。如果問題仍然存在，應(yīng)立即停止使用此批號產(chǎn)品，并與當?shù)毓?yīng)商聯(lián)系。結(jié)果判斷Part 2酶免疫技術(shù) 以上海科華試劑盒為例：1 HBs

9、Ag： COV=陰性對照平均OD值+0.1 樣本OD值/COV值1.0為陽性 樣本OD值/COV值1.0為陰性2 HBsAb、HBeAg： COV=陰性對照平均OD值2.1（OD0.05按0.05計算） 當樣本OD值COV值為陽性 當樣本OD值COV值為陰性結(jié)果判斷Part 2酶免疫技術(shù) 3 HBeAb：COV（陰性對照平均OD值陽性對照平均OD值）0.5 標本OD值COV為陰性，COV為陽性4 HBcAb：原倍血清COV陰性對照平均OD值0.3 1:30稀釋血清COV陰性對照平均OD值0.5 標本OD值COV為陰性，COV為陽性二、臨床意義臨床意義 臨床意義 臨床意義 HBsAg的定量檢測是

10、目前監(jiān)測和預(yù)測抗乙肝病毒治療后應(yīng)答的新工具，結(jié)合HBV DNA及乙肝病毒e抗原（HBeAg）的陰轉(zhuǎn)和血清轉(zhuǎn)換，我們能更準確地預(yù)測患者的近期和遠期抗病毒治療的療效。因此，該檢測已在臨床上得以廣泛開展，特別是被用于判定抗病毒治療療效，以及根據(jù)早期下降的速度和幅度來預(yù)測遠期療效及決定療程上。臨床意義 聚乙二醇干擾素（Peg IFN） -2a治療乙肝患者的研究結(jié)果顯示，治療12周時HBsAg定量20000 IU/ml（約占治療人群的16%）,則治療結(jié)束停藥1年時的HBeAg血清轉(zhuǎn)換率僅為19%（8/43例）。 臨床意義 此外，研究還發(fā)現(xiàn)，患者治療后HBsAg下降速度和幅度還與其長期清除率有關(guān)。在治療2

11、4周HBsAg1500 IU/ml且同時出現(xiàn)HBeAg血清轉(zhuǎn)換的患者中，有20%可獲得HBsAg清除。因此，HBsAg定量可以用于指導(dǎo)治療。而且，治療結(jié)束時HBsAg水平越低，停藥后隨訪的HBsAg清除率越高。臨床意義 布魯內(nèi)托（Brunetto）研究顯示，無論是HBeAg（+）還是HBeAg（-）的慢性乙肝患者，在接受干擾素治療48周后，若其HBsAg定量10 IU/ml（占88%，171/194例），隨訪3年，僅有2%（4/174例）的患者出現(xiàn)HBsAg消失。同樣，治療48周時HBsAg下降2 log的患者， 隨訪3年，HBsAg消失率高達42%；下降2 log患者中，僅有3%的HBsAg

12、消失。因此，在治療結(jié)束時，對于那些HBV DNA 陰轉(zhuǎn)并出現(xiàn)HBeAg血清轉(zhuǎn)換的患者，如果HBsAg水平下降不明顯，可考慮延長療程，以進一步提高HBeAg血清轉(zhuǎn)換率和HBsAg清除率。臨床意義檢測模式分析Part 4檢測結(jié)果模式分析HBsAgHBsAbHBeAgHBeAbHBcAbPreS1AgPreS1Ab簡要意義乙肝表面抗原乙肝表面抗體乙肝E抗原乙肝E抗體乙肝核心抗體乙肝前S1抗原乙肝前S1抗體HBsAg陽性提示乙肝攜帶；HBeAg、pre-S1Ag、陽性提示病毒復(fù)制,傳染性強；HBsAb、HBeAb陽性提示機體具備免疫力，趨于恢復(fù)，pre-S1Ab陽性提示肝細胞有阻斷乙肝病毒感染的功能。

13、-沒有乙肝病毒感染，不具備免疫力。-+-接種疫苗，乙肝恢復(fù)，具備免疫力。-+急性乙肝恢復(fù)或接種進口疫苗，具備免疫力。-+-+接種疫苗或少量乙肝病毒感染后恢復(fù)，免疫力強。+-表面抗原攜帶；急性乙肝病毒感染潛伏期后期。+-+-+-急性乙肝早期，病毒復(fù)制，有傳染性。+-+-+-急慢性乙肝，病毒復(fù)制，有傳染性（即大三陽）。+-+-+-+急慢性乙肝，恢復(fù)期或治療有效，有傳染性。+-+-急慢性乙肝，傳染性弱或沒有傳染性。臨床意義HBsAgHBsAbHBeAgHBeAbHBcAbPreS1AgPreS1Ab簡要意義乙肝表面抗原乙肝表面抗體乙肝E抗原乙肝E抗體乙肝核心抗體乙肝前S1抗原乙肝前S1抗體HBsAg

14、陽性提示乙肝攜帶；HBeAg、pre-S1Ag、陽性提示病毒復(fù)制,傳染性強；HBsAb、HBeAb陽性提示機體具備免疫力，趨于恢復(fù)，pre-S1Ab陽性提示肝細胞有阻斷乙肝病毒感染的功能。+-+-急慢性乙肝，病毒復(fù)制有傳染性，乙肝E抗原變異。+-+-急慢性乙肝，沒有傳染性或傳染性弱（即小三陽）。+-+-+急慢性乙肝或乙肝治療后恢復(fù)期，傳染性弱。+-+-急慢性乙肝，病毒復(fù)制有傳染性，乙肝E抗原變異。-+-乙肝核心抗隱性攜帶，有乙肝既往有感染史。-+-急性乙肝恢復(fù)期或既往有感染史。-+-+-+乙肝恢復(fù)期或急性乙肝既往有輕度乙肝病毒感染史。+-+-慢乙肝病毒感染攜帶，傳染性弱或沒有傳染性。+-+-急

15、性乙肝趨于恢復(fù)，乙肝攜帶，病毒復(fù)制有傳染性。-+-提示乙肝病毒早期感染，有傳染性，建意檢測HBV-DNA。臨床意義 一、何謂PreS1Ag？ PreS1Ag是乙型肝炎病毒基因組前S1區(qū)編碼的前蛋白，具有很強的免疫原性，是病毒表面抗原(HBsAg)的組成成分。它只存在于具有傳染性的完整的乙肝病毒顆粒上，是黏附和侵襲人體肝細胞的主要因子。 臨床意義 二、檢測PreS1Ag的意義 1. PreS1Ag的檢測能夠彌補乙肝五項檢測的不足 PreS1Ag出現(xiàn)在急性乙肝感染的最早期，在轉(zhuǎn)氨酶升高前，即可查出，是早期診斷乙肝病毒感染的標志。 急性乙肝PreS1Ag轉(zhuǎn)陰越早，預(yù)后越好，提示病毒清除和病情好轉(zhuǎn)。反

16、之，PreS1Ag持續(xù)陽性，則提示將發(fā)展成慢性肝炎。 抗HBe()慢性乙肝約占慢肝的30%50%，檢測PreS1Ag()，提示病毒在機體內(nèi)繼續(xù)復(fù)制，具有傳染性，患者容易演變?yōu)楦斡不蚋伟?。加查PreS1Ag，彌補了因HBeAg的缺失造成的診治困難。 在乙肝無癥狀攜帶者中，有一定比例HBeAb()者，如果PreS1Ag()可反映出病毒并沒有被清除，在體內(nèi)復(fù)制仍然活躍，肝臟存在潛在的病理損傷。 抗病毒治療，檢測PreS1Ag可作為治療前的患者篩查(適應(yīng)癥)和治療后的療效判斷。 臨床意義 2. PreS1Ag檢測能夠加強HBVDNA檢測的作用 因病毒基因變異的影響，個別病毒變異株感染的患者HBVDN

17、A檢測為陰性，PreS1Ag的檢測可以防止漏檢，并提示可能存在病毒變異跡象。 PreS1Ag是免疫測定技術(shù)，具有快速、直接、簡便的特點。PreS1Ag的檢測與HBVDNA檢測在乙肝的診斷方面相互補充和加強，就像HBVDNA不能替代乙肝五項的檢測一樣，同樣HBVDNA不能替代PreS1Ag的檢測。臨床意義 三、何謂PreS1Ab？ 是HBV的中和抗體，能阻止HBV侵入肝細胞，抗-PreS1Ab在急性期和恢復(fù)早期出現(xiàn)，預(yù)示病毒正在或已被清除，疾病預(yù)后良好。乙型肝炎病毒 前S1抗體 可作為急性乙型肝炎臨床預(yù)后早期診斷的血清學指標。 臨床意義 四、PreS1Ab意義： 1前S1抗體是急性 HBV 感染

18、最早期出現(xiàn)的抗體比 HBsAb 和抗 HBcIgM 出現(xiàn)早，起到了臨床預(yù)后早期診斷的作用。前S1抗體出現(xiàn)提示預(yù)后良好。前S1抗體參與病毒的清除，前S1抗原/抗體的反轉(zhuǎn)預(yù)示疾病將進入恢復(fù)期，急性乙型肝炎患者前S1抗原陰轉(zhuǎn)越早，前S1抗體陽轉(zhuǎn)越早預(yù)后越好。 2對慢性乙型肝炎患者長期動態(tài)、隨訪 出現(xiàn)血清前S1抗體陽性者，HBVDNA陰轉(zhuǎn)率顯著增高或 HBVDNA 含量顯著下降，預(yù)示疾病恢復(fù)良好。 3乙型肝炎病毒 前S1抗體 可作為臨床抗病毒療效疾病預(yù)后的血清學指標。 4總之，乙型肝炎患者前S1抗體出現(xiàn)與否，與病程的進展以及預(yù)后有較密切的關(guān)聯(lián)。前S1抗體的檢測對乙肝的診斷及治療有較為重要的臨床意義。 三、注意事項注意事項 1 標本采集與處理的影響標本收集后應(yīng)盡快分離出血清或血漿以避免溶血。檢測時應(yīng)盡量使用新鮮的標本