微生物檢測實驗指導(dǎo)(XXXX版)

1、.：.； PAGE 69食品微生物實驗指點劉后偉、林丹瓊、劉旭光適宜專業(yè)：綠色食品加工專業(yè) 食品營養(yǎng)與檢測專業(yè) 農(nóng)產(chǎn)品檢測專業(yè)實訓(xùn)一 顯微鏡的操作與運用實驗1: 顯微鏡的構(gòu)造、性能和運用方法目的要求(1) 熟習(xí)普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造及各部分的功能。(2) 學(xué)習(xí)并掌握油鏡的原理和運用方法。根本原理顯微鏡由機械安裝和光學(xué)系統(tǒng)兩大部分組成。 油鏡物鏡的根本原理 微生物學(xué)研討用的顯微鏡的物鏡通常有低倍物鏡16mm，10、高倍物鏡4mm，4045和油鏡18 mm，95100三種。油鏡通常標(biāo)有黑圈或紅圈，也有的以“OI字樣表示，它是三者中放大倍數(shù)最大的。根據(jù)運用不同放大倍數(shù)的目鏡，可使被檢物體放大10002

2、 000多倍。油鏡的焦距和任務(wù)間隔 標(biāo)本在焦點上看得最明晰時，物鏡與樣品之間的間隔 最短，光圈那么開得最大，因此，在運用油鏡察看時，鏡頭離標(biāo)本非常近，需特別小心。運用時，油鏡與其他物鏡的不同是載玻片與物鏡之間不是隔一層空氣，而是隔一層油質(zhì)，稱為油浸系。這種油常選用香柏油，因香柏油的折射率n=152，與玻璃一樣。當(dāng)光線經(jīng)過載玻片后，可直接經(jīng)過香柏油進(jìn)入物鏡而不發(fā)生折射。假設(shè)玻片與物鏡之間的介質(zhì)為空氣，那么稱為枯燥系，當(dāng)光線經(jīng)過玻片后，遭到折射發(fā)生散射景象，進(jìn)入物鏡的光線顯然減少，這樣就減低了視野的照明度。 利用油鏡不但能添加照明度，更主要的是能添加數(shù)值孔徑，由于顯微鏡的放大效能是由其數(shù)值孔徑?jīng)Q議

3、的。所謂數(shù)值孔徑，即光線投射到物鏡上的最大角度稱為鏡口角的一半正弦，乘上玻片與物鏡間介質(zhì)的折射率所得的乘積，可用以下公式表示：NAnsin 式中 NA=數(shù)值孔徑； n=介質(zhì)折射率； =最大入射角的半數(shù)，即鏡口角的半數(shù)。 因此，光線投射到物鏡的角度愈大，顯微鏡的效能就愈大圖-5，該角度的大小決議于物鏡的直徑和焦距。同時，的實際限制為90，sin90=1，故以空氣為介質(zhì)時n=1，數(shù)值孔徑不能超越1，如以香柏油為介質(zhì)時，那么n增大，其數(shù)值孔徑也隨之增大。如光線入射角為120，其半數(shù)的正弦為sin60=087，那么： 以空氣為介質(zhì)時： NA=1087=087 以水為介質(zhì)時： NA=133087=115

4、 以香柏油為介質(zhì)時： NA=152087=132 顯微鏡的分辨力是指顯微鏡可以區(qū)分兩點之間最小間隔 的才干。它與物鏡的數(shù)值孔徑成正比，與光波長度成反比。因此，物鏡的數(shù)值孔徑愈大，光波波長越短，那么顯微鏡的分辨力愈大，被檢物體的細(xì)微構(gòu)造也愈能明晰地域別出來。因此，一個高的分辨力意味著一個小的可分辨間隔 ，這兩個要素是成反比關(guān)系的，通常有人把分辨力說成是多少微米或納米，這實踐上是把分辨力和最小分辨間隔 混淆起來了。顯微鏡的分辨力是用可分辨的最小間隔 來表示的。 式中=光波波長。 我們?nèi)庋鬯芨惺艿墓獠ㄆ骄L度為055m，假設(shè)數(shù)值孔徑為065的高倍物鏡，它能區(qū)分兩點之間的間隔 為042m。而在042

5、m以下的兩點之間的間隔 就分辨不出，即使用倍數(shù)更大的目鏡，使顯微鏡的總放大率添加，也依然分辨不出。只需改用數(shù)值孔徑更大的物鏡，添加其分辨力才行。例如用數(shù)值孔徑為125的油鏡時，能區(qū)分兩點之間的 因此，我們可以看出，假設(shè)采用放大率為40倍的高倍物鏡NA=065，和放大率為24倍的目鏡，雖然總放大率為960倍，但其分辨的最小間隔 只需042m。假設(shè)采用放大率為90倍的油鏡NA=125，和放大率為9倍的目鏡，雖然總的放大率為810倍，但卻能分辨出022m間的間隔 。資料及器材顯微鏡、擦鏡紙、二甲苯、香柏油、微生物制片標(biāo)本等。方法與步驟(1) 察看前的預(yù)備置顯微鏡于平穩(wěn)的實驗臺上，鏡座距實驗臺邊沿約3

6、4cm。鏡檢者姿態(tài)要端正，普通用左眼察看，右眼便于繪圖或記錄，兩眼必需同時睜開，以減少疲勞，亦可練習(xí)左右眼均能察看。調(diào)理光源，對光時應(yīng)防止直射光源，因直射光源影響物像的明晰，損壞光源安裝和鏡頭，并刺激眼睛。如陰暗天氣，可用日光燈或顯微鏡燈照明。 調(diào)理光源時，先將光圈完全開放，升高聚光鏡至與載物臺同樣高，否那么運用油鏡光陰線較暗。然后轉(zhuǎn)下低倍鏡察看光源強弱，調(diào)理反光鏡，光線較強的天然光源宜用平面鏡；光線較弱的天然光源或人工光源宜用凹面鏡。在對光時，要使全視野內(nèi)為均勻的亮堂度。凡檢查染色標(biāo)本時，光線應(yīng)強；檢查未染色標(biāo)本時，光線不宜太強?？山?jīng)過擴展或減少光圈、升降聚光器、旋轉(zhuǎn)反光鏡調(diào)理光線。(2)

7、低倍鏡察看 檢查的標(biāo)本需先用低倍鏡察看，由于低倍鏡視野較大，易發(fā)現(xiàn)目的和確定檢查的位置。 將金黃色葡萄球菌染色標(biāo)本置鏡臺上，用標(biāo)本夾夾住，挪動推進(jìn)器，使察看對象處在物鏡正下方，轉(zhuǎn)動粗調(diào)理器，使物鏡降至距標(biāo)本約 05cm處，由目鏡察看，此時可適當(dāng)?shù)販p少光圈，否那么視野中只見光亮一片，難見到目的物，同時用粗調(diào)理器漸漸升起鏡筒，直至物像出現(xiàn)后再用細(xì)調(diào)理器調(diào)理到物像清楚時為止，然后挪動標(biāo)本，仔細(xì)察看標(biāo)本各部位，找到適宜的目的物，并將其移至視野中心，預(yù)備用高倍鏡察看。(3) 高倍鏡察看 將高倍鏡轉(zhuǎn)至正下方，在轉(zhuǎn)換物鏡時，需用眼睛在側(cè)面察看，防止鏡頭與玻片相撞。然后由目鏡察看，并仔細(xì)調(diào)理光圈，使光線的亮堂

8、度適宜，同時用粗調(diào)理器漸漸升起鏡筒至物像出現(xiàn)后，再用細(xì)調(diào)理器調(diào)理至物像明晰為止，找到最適宜察看的部位后，將此部位移至視野中心，預(yù)備用油鏡察看。(4) 油鏡察看用粗調(diào)理器將鏡筒提起約2cm，將油鏡轉(zhuǎn)至正下方。在玻片標(biāo)本的鏡檢部位滴上一滴香柏油。從側(cè)面凝視，用粗調(diào)理器將鏡筒小心地降下，使油鏡浸在香柏油中，其鏡頭幾乎與標(biāo)本相接，應(yīng)特別留意不能壓在標(biāo)本上，更不可用力過猛，否那么不僅壓碎玻片，也會損壞鏡頭。從接目鏡內(nèi)察看，進(jìn)一步伐節(jié)光線，使光線亮堂，再用粗調(diào)理器將鏡筒徐徐上升，直至視野出現(xiàn)物像為止，然后用細(xì)調(diào)理器校正焦距。如油鏡已分開油面而仍未見物像，必需再從側(cè)面察看，將油鏡降下，反復(fù)操作至物像看清為止

9、。用同樣的方法察看枯草芽孢桿菌染色標(biāo)本。察看終了，上旋鏡筒。先用擦鏡紙拭去鏡頭上的油，然后用擦鏡紙蘸少許二甲苯香柏油溶于二甲苯擦去鏡頭上殘留油跡，最后再用干凈擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。切忌用手或其他紙擦鏡頭，以免損壞鏡頭。用綢布擦凈顯微鏡的金屬部件。將各部分復(fù)原，反光鏡垂直于鏡座，將接物鏡轉(zhuǎn)成八字形，再向下旋。同時把聚光鏡降下，以免接物鏡與聚光鏡發(fā)生碰撞危險。實驗作業(yè)分別繪出他在低倍鏡、高倍鏡和油鏡下察看到的金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌的形狀，包括在三種情況下視野中的變化，同時注明物鏡放大倍數(shù)和總放大率。在運用高倍鏡和油鏡進(jìn)展調(diào)焦時，應(yīng)將鏡筒徐徐上升還是下降？為什么？用油鏡察看時，為什么要在載玻

10、片上滴加香柏油？實訓(xùn)二 培育基的配制和滅菌實驗?zāi)康?. 明確培育基的配制原理。2. 掌握配制培育基的普通方法和步驟。實驗內(nèi)容學(xué)習(xí)細(xì)菌、放線菌、酵母菌及霉菌四大類微生物培育基的配制。實驗原理培育基是人工配制的適宜微生物生長繁衍或積累代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)基質(zhì)，用以培育、分別、鑒定、保管各種微生物或積累代謝產(chǎn)物。各類微生物對營養(yǎng)的要求不盡一樣，因此培育基的種類繁多。培育細(xì)菌常用牛肉膏蛋白胨培育基，培育放線菌常用高氏I號培育基，培育霉菌常用蔡氏培育基或馬鈴薯培育基，培育酵母菌常用麥芽汁培育基或馬鈴薯葡萄糖培育基。另外還有固體、液體、加富、選擇、鑒別等培育基之分。在這些培育基中，就營養(yǎng)物質(zhì)而言，普通不外乎碳源

11、、氮源、無機鹽、生長因子及水等幾大類。瓊脂只是固體培育基的支持物，普通不為微生物所利用。它在96以上熔化成液體，而在45左右開場凝固成固體。在配制培育基時，根據(jù)各類微生物的特點，就可以配制出適宜不同種類微生物生長發(fā)育所需求的培育基。培育基除了滿足微生物所必需營養(yǎng)物質(zhì)外，還要求有一定的酸堿度和浸透壓。霉菌和酵母菌的pH偏酸；細(xì)菌、放線菌的pH為微堿性。所以每次配制培育基時，都要將培育基的pH值調(diào)到一定的范圍。牛肉膏蛋白胨培育基配方牛肉膏 3.0 g蛋白胨 10.0gNaCl 5.0g水 1000mLpH 7.47.6高氏I號培育基配方可溶性淀粉 20gNaCl 0.5gKNO3 1gK2HPO4

12、3H2O 0.5g MgSO47H2O 0.5gFeSO47H2O 0.01g瓊脂 1525g水 1000mL pH 7.47.6馬鈴薯培育基配方馬鈴薯去皮 200g葡萄糖或蔗糖 20g瓊脂 1525g水 1000ml自然pH察氏培育基配方蔗糖 30gNaNO3 2gK2HPO4 1gKCl 0.5gMgSO47H2O 0.5gFeSO47H2O 0.01g瓊脂 1525g蒸餾水 1000ml自然pH實驗及器材牛肉膏，蛋白胨，NaCl，瓊脂，1mol/LNaOH, 1mol/LHCl，KNO3，K2HPO43H2O，MgSO47H2O，F(xiàn)eS047H2O，馬鈴薯，蔗糖等。試管，三角瓶，燒杯，量

13、筒，玻棒，培育基分裝器，天平，牛角匙， pH試紙(pH 5.59.0)，棉花，牛皮紙，記號筆，麻繩，紗布等。實驗步驟1牛肉膏蛋白胨培育基配制方法(1) 稱量：按培育基配方比例依次推確地稱取牛肉膏、蛋白胨、NaCL放人燒杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小燒杯或外表皿中稱量，用熱水溶化后倒入燒杯，也可按在稱量紙上，稱量后直接放入水中，這時如略微加熱，牛肉膏便會與稱量紙分別，然后立刻取出紙片。蛋白胨很易吸濕，在稱取時動作要迅速。另外，稱藥品時嚴(yán)防藥品混雜，一把牛角匙用于一種藥品，或稱取一種藥品后，洗凈，擦干，再稱取另一藥品。瓶蓋也不要蓋錯。(2) 溶化：在上述燒杯中先參與少于所需求的水量，用玻棒攪勻，

14、然后，在石棉網(wǎng)上加熱使其溶解。將藥品完全溶解后，補充水到所需的總體積，假設(shè)配制固體培育基時，將稱好的瓊脂放入己溶的藥品中，再加熱溶化，最后補足所損失的水分。在瓊脂溶化過程中，應(yīng)控制火力，以免培育基因沸騰而溢出容器。同時需不斷攪拌以防瓊脂糊底燒焦。配制培育基時，不可用銅或鐵鍋加熱溶化，以免離子進(jìn)入培育基中，影晌細(xì)菌生長。(3) 調(diào)pH在未調(diào)pH前，先用精細(xì)pH試紙丈量培育基的原始pH，假設(shè)偏酸，用滴管向培育基中逐滴參與1mol/LNaOH,邊加邊攪拌，并隨時用pH試紙測其pH，直至pH達(dá)7.6。反之，用mol/LHCL進(jìn)展調(diào)理。 對于有些要求pH較準(zhǔn)確的微生物，其pH的調(diào)理可用酸度計進(jìn)展。 pH

15、不要調(diào)過頭，以防止回調(diào)而影響培育基內(nèi)各離子的濃度。配制pH低的瓊脂培育基時，假設(shè)預(yù)先調(diào)好pH并在高壓蒸氣下滅菌，那么瓊脂因水解不能凝固。因此，應(yīng)將培育基的成分和瓊脂分開滅菌后再混合，或在中性pH條件下滅菌，再調(diào)整PH。(4) 過濾 趁熱用濾紙或多層紗布過濾，以利某些實驗結(jié)果的察看。普通無特殊要求的情況下可以省去本實驗勿需過濾。(5) 分裝 按實驗要求，可將配制的培育基分裝人試管內(nèi)或三角燒瓶內(nèi)。1) 液體分裝：分裝高度以試管高度的l4左右為宜。分裝三角瓶的量那么根據(jù)需求而定，普通以不超越三角瓶容積的一半為宜，假設(shè)是用于振蕩培育用，那么根據(jù)通氣量的要求酌情減少；有的液體培育基在滅菌后，需求補加一定

16、量的其他無菌成分，如抗生素等，那么裝量一定要準(zhǔn)確。2) 固體分裝：分裝試管，其裝量不超越管高的1/5，滅菌后制成斜面。分裝三角燒瓶的量以不超越三角燒瓶容積的一半為宜。3) 半固體分裝：試管普通以試管高度的1/3為宜，滅菌后垂直待凝。 圖1-1 培育基的分裝 A 漏斗分裝安裝 ；B 自動分裝安裝 1 鐵架 ；2 漏斗 ；3孔膠管 ；4彈簧夾 ；5玻璃 ；6流速調(diào)理 ；7 裝量調(diào)理 ；8開關(guān)分裝過程中，留意不要使培育基沾在管(瓶)口上，以免沾污棉塞而引起污染。(6) 加塞圖1-2 棉塞的制造培育基分裝終了后，在試管口或三角烷瓶口上塞上棉塞或泡沫塑料塞及試管帽等，棉塞的作用有二：一方面阻止外界微生物

17、進(jìn)入培育基，防止由此而引起的污染；另一方面保證有良好的通氣性能，使培育在里面的微生物可以從外界源源不斷地獲得新穎無菌空氣。因此棉塞質(zhì)量的好壞對實驗的結(jié)果有著很大的影響。一只好的棉塞，外形應(yīng)象一只蘑菇，大小、松緊都應(yīng)適當(dāng)。加塞時的棉塞的總長度的3/5應(yīng)在口內(nèi)，2/5在口外。 (7) 包扎 加塞后，將全部試管用麻繩捆好，再在棉塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌時冷凝水潤濕棉塞，其外再用一道麻繩扎好。用記號筆注明培育基稱號、組別、配制日期。三角燒瓶加塞后，外包牛皮紙，用麻繩以活結(jié)方式扎好，運用時容易解開，同樣用記號筆注明培育基稱號、組別、配制日期。(8) 滅菌 將上述培育基以0.103MPa，121，20

18、min高壓蒸氣滅菌。(9) 擱置斜面 將滅菌的試管培育基冷至50左右以防斜面上冷凝水太多，將試管口端捆在玻棒或其他適宜高度的器具上，擱置的斜面長度以不超越試管總長的一半為宜 。(10) 無菌撿查將滅菌培育基放人37的溫室中培育2448h，以檢查滅菌能否徹底。2高氏I號培育基配制方法(1) 稱量和溶化 按配方先稱取可溶性淀粉、放入小燒杯中，并用少量冷水將淀粉調(diào)成糊狀，再參與少于所需水量的沸水中，繼續(xù)加熱，使可溶性淀粉完全溶化。然后再稱取其他各成分依次逐一溶化。對微量成分FeSO47H2O可先配成高濃度的貯備液按比例換算后再參與，方法是先在100mL水中參與1g的FeSO47H2O配成0.01gm

19、l，再在1000mL培育基中加1mL的0.0l gm1的貯備液即可。待一切藥品完全溶解后，補充水分到所需的總體積。如要配制固體培育基，其溶化過程同牛肉膏蛋白胨培育基配制方法。(2) pH調(diào)理、分裝、包扎、滅菌及無菌檢查同牛肉膏蛋白胨培育基配制方法。3馬鈴薯培育基配制方法取去皮馬鈴薯200g，切成小塊，放入1500mL的燒杯中煮沸30min，留意用玻棒攪拌以防糊底。然后用雙層紗布過濾，取濾液加糖酵母菌用葡萄糖，霉菌用蔗糖，加熱煮沸后參與瓊脂，繼續(xù)加熱融化并補足失水。再按前所述，進(jìn)展分裝、加塞、包扎、0.1MPa滅菌20 min。4察氏培育基配制方法方法同牛肉膏蛋白胨培育基配制。實驗結(jié)果及討論針對

20、實驗原理、步驟、景象進(jìn)展討論。實驗作業(yè)選做3題1牛肉膏應(yīng)置于何種容器中稱量為宜?2配制高氏合成一號培育基時，可溶性淀粉需經(jīng)什么處置后才干倒入到沸水中? 3何謂培育基的自然pH?4培育基配好后，為什么必需立刻滅菌?如何檢查滅菌后的培育基是無菌的5在配制培育基的操作過程中應(yīng)留意些什么問題?為什么?6配制合成培育基參與微量元素時最好用什么方法參與?天然培育基為什么不需求另加微量元素?7有人以為自然環(huán)境中微生物是生長在不按比例的基質(zhì)中，為什么在配制培育基時要留意各種營養(yǎng)成分的比例?8他配制的高氏I號培育基有沉淀產(chǎn)生嗎?闡明產(chǎn)生或未產(chǎn)生的緣由。9細(xì)菌能在高氏I號培育基上生長嗎?為了分別放線菌，他以為應(yīng)該

21、采取什么措施?實訓(xùn)三 革蘭氏染色法目的要求了解革蘭氏染色的原理，學(xué)習(xí)并掌握革蘭氏染色的方法。根本原理革蘭氏染色反響是細(xì)菌分類和鑒定的重要性狀。它是1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)建的。革蘭氏染色法不僅能察看到細(xì)菌的形狀而且還可將一切細(xì)菌區(qū)分為兩大類：染色反響呈藍(lán)紫色的稱為革蘭氏陽性細(xì)菌，用G+表示；染色反響呈紅色復(fù)染顏色的稱為革蘭氏陰性細(xì)菌，用G-表示。細(xì)菌對于革蘭氏染色的不同反響，是由于它們細(xì)胞壁的成分和構(gòu)造不同而呵斥的。革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁主要是由肽聚糖構(gòu)成的網(wǎng)狀構(gòu)造組成的，在染色過程中，當(dāng)用乙醇處置時，由于脫水而引起網(wǎng)狀構(gòu)造中的孔徑變小，通透性降低，使結(jié)晶紫-碘復(fù)合物被保管在細(xì)胞內(nèi)而不易

22、脫色，因此，呈現(xiàn)藍(lán)紫色；革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁中肽聚糖含量低，而脂類物質(zhì)含量高，當(dāng)用乙醇處置時，脂類物質(zhì)溶解，細(xì)胞壁的通透性添加，使結(jié)晶紫-碘復(fù)合物易被乙醇抽出而脫色，然后又被染上了復(fù)染液番紅的顏色，因此呈現(xiàn)紅色。 革蘭氏染色需用四種不同的溶液：堿性染料初染液；媒染劑；脫色劑和復(fù)染液。堿性染料初染液的作用象在細(xì)菌的單染色法根本原理中所述的那樣，而用于革蘭氏染色的初染液普通是結(jié)晶紫。媒染劑的作用是添加染料和細(xì)胞之間的親和性或附著力，即以某種方式協(xié)助 染料固定在細(xì)胞上，使不易零落，碘是常用的媒染劑。脫色劑是將被染色的細(xì)胞進(jìn)展脫色，不同類型的細(xì)胞脫色反響不同，有的能被脫色，有的那么不能，脫色劑常用9

23、5的酒精。復(fù)染液也是一種堿性染料，其顏色不同于初染液，復(fù)染的目的是使被脫色的細(xì)胞染上不同于初染液的顏色，而未被脫色的細(xì)胞依然堅持初染的顏色，從而將細(xì)胞區(qū)分成G+和G-兩大類群，常用的復(fù)染液是番紅。資料及器材(1) 大腸桿菌，枯草芽孢桿菌(2) 革蘭氏染色液，載玻片，顯微鏡等方法與步驟涂片將培育1416小時的枯草芽孢桿菌和培育24小時的大腸桿菌分別作涂片留意涂片切不可過于濃重，枯燥、固定。固定時經(jīng)過火焰12次即可，不可過熱，以載玻片不燙手為宜。初染 加草酸銨結(jié)晶紫一滴，約一分鐘，水洗。媒染 滴加碘液沖去殘水，并覆蓋約一分鐘，水洗。脫色 將載玻片上面的水甩凈，并襯以白背景，用95酒精滴洗至流出酒精

24、剛剛不出現(xiàn)紫色時為止，約2030秒鐘，立刻用水沖凈酒精。復(fù)染 用番紅液染12分鐘，水洗。鏡檢 枯燥后，置油鏡察看。革蘭氏陰性菌呈紅色，革蘭氏陽性菌呈紫色。以分散開的細(xì)菌的革蘭氏染色反響為準(zhǔn)，過于密集的細(xì)菌，經(jīng)常呈假陽性。同法在一載玻片上以大腸桿菌與枯草芽孢桿菌混合制片，作革蘭氏染色對比。革蘭氏染色的關(guān)鍵在于嚴(yán)厲掌握酒精脫色程度，如脫色過度，那么陽性菌可被誤染為陰性菌；而脫色不夠時，陰性菌可被誤染為陽性菌。此外，菌齡也影響染色結(jié)果，如陽性菌培育時間過長，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈陰性反響。革蘭氏染色過程：實驗作業(yè)在他所作的革蘭氏染色制片中，大腸桿菌和枯草芽孢桿菌各染成何色？它們是革蘭氏陰

25、性菌還是革蘭氏陽性菌？作革蘭氏染色涂片為什么不能過于濃重？其染色成敗的關(guān)鍵一步是什么？當(dāng)他對一株未知菌進(jìn)展革蘭氏染色時，怎樣能確證他的染色技術(shù)操作正確，結(jié)果可靠？實驗四 乙酰甲基甲醇實驗(V.P實驗)一、實驗?zāi)康牧私忤b別不同腸桿菌科各菌屬的乙酰甲基甲醇實驗原理，并掌握其操作方法二、原理某些細(xì)菌在葡萄糖蛋白胨水培育基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合、脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強堿環(huán)境下，被空氣中的氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱為V.P(+)反響。CH3 CH3 CH3 NH3 N=CH-CH3 CO CO CO NH=C NH=C COOH CHOH CO NH3

26、N=CH-CH3 CH3 CH3三、實驗資料 (1)菌種 大腸埃希氏菌(Escherichia coli),枯草芽孢桿菌(Bacillus subttilis)的斜面菌種。 (2)培育基 葡萄糖蛋白胨水培育基的試管 (3)其它 酒精棉球，酒精燈，接種針，恒溫箱等。四、方法與步驟發(fā)酵液試管標(biāo)志接種培育察看記錄。(1)標(biāo)志試管 取5支裝有葡萄糖蛋白胨水培育基的試管，分別標(biāo)志大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、普通變形桿菌、枯草芽孢桿菌和空白對照。 (2)接種培育 以無菌操作分別接種少量菌至以上相應(yīng)試管中，空白對看管不接菌，置37恒溫箱中，培育24 48 h。 (3)察看記錄a. 取出以上試管，振蕩2 min。另

27、取5支空試管相應(yīng)標(biāo)志菌名，分別參與35 mL以上對應(yīng)管中的培育液，再參與400 gL氫氧化鈉溶液1020滴，并用牙簽挑人約0.51 mg微量肌酸，振蕩試管，以使空氣中的氧溶人，置37恒溫箱中保溫15 30 min. b. 也可以取上述試管，參與和培育液一半的6%的萘酚，搖勻，再參與培育液1/3的40%氫氧化鈉溶液，充分搖勻，察看結(jié)果。五、實驗結(jié)果假設(shè)培育液呈紅色，記錄為VP實驗陽性反響(用“+表示)；假設(shè)不呈紅色，記錄為VP實驗陰性反響(用“-表示)。留意：原試管中留下的培育液用作甲基紅實驗。實驗五 甲基紅實驗(M.R實驗)一、實驗?zāi)康?、了解鑒別腸桿菌科各菌屬的甲基紅實驗原理2、學(xué)習(xí)甲基紅實

28、驗的操作技術(shù)。二、原理腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產(chǎn)生丙酮酸，進(jìn)一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸等有機酸。培育液指示劑珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培育基pH值下降至pH 4.5以下，使甲基紅指示劑變紅。三、實驗資料 (1)菌種 同V.P實驗 (2)培育基 同V.P實驗 (3)其它 酒精棉球，酒精燈，接種針，恒溫箱等。四、方法與步驟 于V.P實驗留下的培育液中，各參與23滴甲基紅指示劑，留意沿管壁參與，仔細(xì)察看培育液上層。五、實驗結(jié)果 假設(shè)培育液上層變成紅色, 即為陽性反響；假設(shè)仍呈黃色，那么為陰性反響，分別用“+或“-表示。 實驗六 吲哚實驗一、實驗?zāi)康?/p>

29、1、掌握吲哚實驗(Ehrlich法)的原理和方法：2、學(xué)習(xí)吲哚實驗(Ehrlich法)實驗的操作技術(shù)。二、原理 有些細(xì)菌含有色氨酸酶。能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚(靛基質(zhì))。吲哚本身沒有顏色，不能直接看看見，但當(dāng)參與對二甲基氨基苯甲醛試劑時，該試劑與吲哚作用構(gòu)成紅色的攻瑰吲哚。三、實驗資料 (1)菌種 大腸桿菌(Eschichiacoli)，枯草芽孢桿菌。 (2)培育基 蛋白胨水培育基。 (3)其它 二甲基氨基苯甲醛溶液，乙醚，酒精燈，接種針，恒溫箱等。四、方法與步驟標(biāo)志試管接種培育察看記錄。取裝有蛋白胨水培育基的試管3支，分別標(biāo)志大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和空白對照。置37恒溫箱中培育2448

30、 h。在培育基中參與乙醚l2ml，經(jīng)充分震蕩使吲哚萃取至乙醚中靜置片刻后乙醚層浮于培育液的上面。此時沿管璧緩慢參與510滴吲哚試劑(加人吲哚試劑后切勿搖動試管，以防破壞乙醚層影響結(jié)果察看)。五、實驗結(jié)果 如有吲哚存在，乙醚層呈現(xiàn)玫瑰紅色，此為吲哚實驗陽性反響，否那么為陰性反響，陽性用“+；陰性用“-表示。實驗七 半乳糖苷酶實驗一、實驗?zāi)康?、了解-半乳糖苷酶實驗的用途與原理：2、學(xué)習(xí)-半乳糖苷酶實驗的操作技術(shù)。二、原理 在鄰硝基酚-D-半乳糖苷培育基(ONPG培育基)中含有鄰硝基酚-D-半乳糖苷和pH75的0.01molL的磷酸緩沖液。當(dāng)實驗產(chǎn)生-半乳糖苷酶時，鄰硝基酚-D-半乳糖苷被水解，釋

31、放出鄰硝基酚，此物為酸堿指示劑，它的指示范圍是pH6.8(無色)pH8.6(黃色)，故能使pH7.5的培育液成為黃色，否那么不變色。三、實驗資料 (1)菌種 大腸桿菌(Eschichiacoli)，愛得華氏菌Edwardsiella sp (2)培育基 ONPG培育基 (3)其它 酒精棉球，酒精燈，接種針，恒溫箱等。四、方法與步驟 取ONFG培育基試管三支，于其上分別做好培育基稱號和“大腸桿菌、“愛檀華氏苗、“空白對照等標(biāo)志，然后分別將實驗菌相應(yīng)地接人ONPG培育基中，連同對照，置36土1培育13h和24h，察看結(jié)果。五、實驗結(jié)果 試管中培育基顏色變黃者為該實驗陽性，記“十號，否那么記“一。實

32、驗三 含碳化臺物的利用實驗一、實驗?zāi)康?學(xué)會測定某菌能否利用某一含碳化合物的方法。二、原理 細(xì)菌能否利用某些含碳化合物作為獨一碳源，反映該菌能否含有代謝這種含碳化合物有關(guān)的酶，因此可作為鑒定的根據(jù)。做這項測定的根底培育基配方很多，因酶的種類而異培育基可制成液體分裝試管，也可加1.5一2水洗瓊脂制成平板?？捎脕頊y定的底物種類很多，有單糖類、雙糖類、糖醇類、脂肪酸類、羥基酸類、各種有機酸類、醇類、各種氮基酸類、胺類以及磺氫化合物等。糖的含量普通為l，醇類、酚等底物在培育基中含量普通為0.1一0.2，氨基酸的含量普通為0.5。因碳?xì)浠衔锊蝗苡谒稍谝后w中撮搞培育或參與45左右的固體培育基中，用力

33、振蕩后立刻倒成平板。有些底物不宜加壓滅菌，可用過濾法滅菌后參與無菌的根底培育基中，某些醇類和酚類那么不需滅菌。三，實驗資料 (1)菌種 大腸桿菌(E.coli)和枯草芽孢桿菌(B.subtilis)。 (2)培育基 細(xì)菌根底培育基(附錄5)。實驗時，往根底培育基中加糖類1或醇、酚0.10.2，或氨基酸0.5。四、方法與步驟將實驗菌種首先制成懸液，以防止帶人少量碳源而干擾實驗結(jié)果平板接種用接種環(huán)點種，液體培育基用直針接種每一測定苗都必需接種未加碳水化合物的空白根底培育基作對照。適溫培育2、5、7D后察看。五、實驗結(jié)果凡測定菌在有碳水化合物的培育基中的生長情況明顯超越在空白根底培育基的生長量者為陽

34、性，否那么為陰性。如兩種培育基上生長情況差別不明顯，可在同一培育基上延續(xù)移種三次，如差別仍不明顯，那么為陰性。實驗四 丙二酸鹽實驗一、實驗?zāi)康?、了解丙二酸鈉實驗的用途及原理2、學(xué)習(xí)丙二酸實驗的操作技術(shù)。二、原理 由于微生物的酶系統(tǒng)不同，故有的菌能利用醋酸鹽作為氮源，有的菌那么不能，當(dāng)醋酸鹽被分解利用后，培育基中產(chǎn)生堿性物質(zhì)，使培育基縣堿性，促使培育基中酸堿指示劑麝香草酚藍(lán)由綠色變成藍(lán)色，可利用此反響來鑒別有關(guān)微生物。三、實驗資料 (1)菌種 大腸桿菌(Eschichiacoli)及沙門氏菌Salmonella sp (2)培育基 丙二酸鈉培育墓(附錄6)。 (3)其它 酒精棉球，酒精燈，接種

35、環(huán)，恒溫箱等四、方法與步驟 取丙二酸鈉培育基試管三支，于其上分別做好培育基稱號和“大腸桿菌及“沙門氏菌及“空白對照等標(biāo)志。然后對應(yīng)地將菌種接入丙二酸鈉培育基試管中，連同空白對照置于37恒溫箱培育48h，察看結(jié)果。五、實驗結(jié)果 培育基由綠色變成藍(lán)色者，闡明實驗菌能利用醋酸鹽作為碳源，故丙二酸鈉實驗結(jié)果為陽性，記“十號，培育基不變藍(lán)色者為陰性，否那么記“一。將察看結(jié)果以表格方式記錄。實驗五 葡萄糖銨實驗、實驗?zāi)康?)了解葡萄糖銨實驗的用途及原理。2)學(xué)習(xí)掌握葡萄糖銨實驗的操作技術(shù)。二、原理 有的菌種能利用銨鹽作為氮源而生長，有的菌那么不能用，在葡萄糖銨培育基中。磷酸二銨是獨一的氮源，故以能否在該培

36、育基上生長來作為鑒別有關(guān)細(xì)菌的根據(jù)之一。三、實驗資料菌種 大腸桿菌(Escherichia coli)和福氏志賀菌Shigelle flexneri2) 培育基 葡萄糖銨培育基(附錄-8),普通營養(yǎng)瓊脂斜面。3) 其它 酒精棉球，酒精燈，接種針，無菌生理鹽水8mL(二支)四、方法與步驟做標(biāo)志 取葡萄糖銨培育基、普通營養(yǎng)瓊脂斜面、無菌生理鹽水個2支，分別于其上做好培育基稱號和菌名等標(biāo)志。制備菌懸液 將苗種相應(yīng)接人理鹽水管內(nèi)，研磨并攪動使其均勻。要求每一接種環(huán)內(nèi)含菌數(shù)在20100個為宜或肉眼察看不見渾濁。接種 用無菌接種環(huán)分別取大腸桿菌菌液一環(huán)，在對應(yīng)的葡萄糖銨斜面培育基和普通營養(yǎng)瓊脂斜面培育基上

37、劃線接種，并以同樣的方法接種福氏志賀菌。培育 將種接好的試管置36土1恒溫箱培育24h，察看結(jié)果。五、實驗結(jié)果 在葡萄糖銨斜面上有正常大小菌落生長者為葡萄糖銨實驗陽性，記“十號；不生長或只生長為極微小的菌落，而在對照培育基上生長良好者，為陰性，否那么記“一。將察看結(jié)果以表格方式記錄。實驗六 酪蛋白分解實驗 一、實驗?zāi)康?(1)了解酪蛋白分解實驗的用途及原理 (2)學(xué)習(xí)酪蛋白分解實驗的操作技術(shù) 二、原理 某些菌具有酪蛋白分解酶，而有的菌那么不具有。具有酪蛋白分解酶的細(xì)菌在 蛋白瓊脂平板上可分解酪蛋白而令菌落周圍構(gòu)成透明圈。三、實驗資料1菌種 蠟樣牙孢桿菌和球形芽孢桿菌。(2) 培育基 酪蛋白瓊脂

38、培育基平板(附錄19)(3) 其它 酒精棉球，酒精燈，接種環(huán)，恒溫箱等。四、方法與步驟以劃線接種法將實驗菌接種于酪蛋白培育基上，然后置37恒溫箱培育12d后，察看結(jié)果五、實驗結(jié)果平板中菌落周圍有透明圈者，為酪蛋白分解實驗陽性。反之為陰性*注：1、培育基在倒時要搖勻由于酪蛋白不溶解 2、倒好后，培育基放置時間要較長凝固時間較長實驗七 細(xì)胞色素氧化酶實驗 一、實驗?zāi)康?(1)了解細(xì)胞色素氧化酶實驗的用途與原理 (2)學(xué)習(xí)細(xì)胞色素氧化酶實驗的操作技術(shù) 二、原理 在不以氧為直接受氫體的生物氧化體系中，生物氧化需求在多種酶結(jié)協(xié)作用下方能進(jìn)展。組成這類生物氧化體系的酶，主要是細(xì)胞色素類酵。這種酶在有分子氧

39、與脫氫酶的存在下，可氧化二甲基對苯撐二胺和萘酚成吲哚酚藍(lán)，其反響式同氧化酶實驗三、實驗資料 (1)菌種 大腸桿菌(Escherichiacoli)和枯草桿菌(13acillsubtilis)。 (2)試劑 同氧化酶實驗。四、方法與步驟 取37培育20h的斜面培育物一支，將兩種試劑各23滴順斜面從上端滴下，并將斜面略加傾斜，使試劑混合液流經(jīng)斜面上的培育物。如系平板培育物，那么可用試劑混合液滴到菌落上。五、實驗結(jié)果 在兩分鐘內(nèi)呈現(xiàn)藍(lán)色者為陽性，2min以后出現(xiàn)微弱或可疑反響者均作為陰性結(jié)果. 實驗九 淀粉水解實驗 一、實驗?zāi)康?(1)了解淀粉水解實驗的原理及用途。 (2)學(xué)習(xí)淀粉水解實驗的操作技術(shù)

40、。二、原理 許多菌產(chǎn)生淀粉酶，能把培育基中的淀粉水解為無色糊精的等小分子，或進(jìn)分解為麥芽糖和葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再變藍(lán)色三、實驗資料 (1)菌種 大腸桿菌(Escherichiacoil)和枯草芽抱桿酶(Bacillussubtilis)。 (2)培育基 在肉湯蛋白胨瓊脂中添加0.2%的可溶性淀粉，分裝0.1MPa20min滅菌。 (3)試劑 路哥氏碘液(附錄132) (4)其它 酒精棉球，酒精燈，接種針，恒溫箱等。 四，方法與步驟 將培育基熔化，倒成平板，凝固后，取菌種點種于平板上，每皿可點35個菌，37恒溫箱培育24d后，察看結(jié)果五、實驗結(jié)果取培育好的平皿，在平板上滴加路哥氏碘液以鋪

41、滿菌落周圍為度，平板呈藍(lán)色，而菌落周圍如有無色透明圈出現(xiàn)，闡明淀粉已被水解，稱淀粉水解實驗陽性。透明圈的大小普通闡明水解淀粉才干的大小。實驗八 過氧化氫酶實驗，實驗?zāi)康?)了解過氧化氫酶實驗的用途與原理。2)學(xué)習(xí)過氧化氫酶實驗的操作技術(shù)。二、原理 在以需氧脫氫酶催化的氧化體系中，氧原子接受電子后，即與溶液中氫離子結(jié)合，生成過氧化氫，此物對微生物有毒性。有的菌具有過氧化氧酶，可將其分解成水和氧，但有的菌不具有此酶故過氧化氫酶實驗是鑒別菌種的根據(jù)之一。 三、實驗資料 (1)菌種 大腸桿菌(Escherichia coli)和某種乳酸桿菌(Lactobacillus sp)。 (2)培育基肉湯培育基

42、(附錄11),麥汁培育基. (3)試劑 3%過氧化氫溶液 (4)其它 酒精棉球，酒精燈，干凈小試管，接種環(huán)等。四、方法與步驟從斜面挑取一環(huán)菌種置于干凈試管內(nèi)，滴加3%過氧化氫溶液約2mL,察看結(jié)果。五、實驗結(jié)果于半分鐘內(nèi)產(chǎn)生氣泡者，為過氧化氧酶實驗陽性；不發(fā)生氣泡者，為陰性。菌落總數(shù)測定范圍本規(guī)范規(guī)定了食品中菌落總數(shù)的測定方法。本規(guī)范適用于各類食品中菌落總數(shù)的測定。術(shù)語與定義以下術(shù)語和定義適用于本規(guī)范。2.1 菌落總數(shù) 食品檢樣經(jīng)過處置，在一定條件下培育后培育基成分、培育溫度和時間、PH、需氧性質(zhì)等，所得1ml或1g檢樣中構(gòu)成菌落的總數(shù)。本規(guī)范規(guī)定的培育條件下所得結(jié)果，只包括一群在平板計數(shù)瓊脂

43、上生長發(fā)育的嗜中溫需氧菌或兼性厭氧菌的菌落總數(shù)。 設(shè)備和資料除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培育設(shè)備外，其他設(shè)備和資料如下：3.1 恒溫培育箱：361，301。3.2 冰箱：25.3.3 恒溫水浴箱：461.3.4 天平：感量0.1g.3.5 均質(zhì)器。3.6 振蕩器。3.7 無菌吸管：1ml具0.01ml刻度、10 ml具0.1ml刻度或微量移液器及吸頭。3.8 無菌錐形瓶：容量250ml、500ml。3.9 無菌培育皿：直徑90mm3.10 PH計或PH比色管或精細(xì)PH試紙。3.11 放大鏡或菌落計數(shù)器或petrifilm自動判讀儀。4 培育基和試劑4. 1 平板計數(shù)瓊脂培育基：見第A.1章。4.

44、2 磷酸鹽緩沖液：見第A.2章。4. 3 無菌生理鹽水：稱取8.5g氯化鈉溶于100ml蒸餾水中，121高壓滅菌15min。4.4 1mol/L氫氧化鈉NaOH：稱取40g氫氧化鈉溶于1000ml蒸餾水中。4.5 1mol/L鹽酸HCL:移取濃鹽酸90ml用蒸餾水稀釋1000ml。4.6 petrifilm菌落總數(shù)測試片和壓板。第一法 平板菌落計數(shù)法5 檢驗程序 菌落總數(shù)的檢驗程序見圖1檢樣25g或25 ml樣品+225ml稀釋液，均質(zhì)10倍系列稀釋選擇2個3個適宜樣品勻液，各取1ml分別參與無菌培育皿內(nèi)每皿中參與15ml20ml平板計數(shù)瓊脂培育基，混勻 培 養(yǎng)36148h2h計數(shù)各平板菌落數(shù)

45、 計數(shù)菌落總數(shù)報 告 圖1 菌落總數(shù)的檢驗程序操作步驟樣品的稀釋固體和半固體樣品：稱取25g樣品置盛有225ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8 000r/min10 000r/min 均質(zhì)1min2min,或放入盛有225ml稀釋液的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min2min,制成1：10的樣品勻液。液體樣品：以無菌吸管汲取25ml樣品置盛有225ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠中，充分混勻,制成1：10的樣品勻液。用1ml無菌吸管或微量移液器汲取1：10樣品勻液1ml，沿管壁緩慢注于盛有9ml稀釋液的無菌試管中留意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液

46、面，振搖試管或換用一支無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1：100的樣品勻液。按6.1.3操作程序，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用一次1ml無菌吸管或吸頭。根據(jù)對樣品污染情況的估計，選擇2個3個適宜稀釋度的樣品勻液液體樣品可包括原液，在進(jìn)展10倍遞增稀釋時，每個稀釋度分別汲取1ml樣品勻液參與兩個無菌平皿內(nèi)。同時分別取1ml稀釋液參與兩個無菌平皿左空白對照。及時將15ml20ml冷卻至46的平板計數(shù)瓊脂培育基可放置于461恒溫水浴箱中傾注平皿，并轉(zhuǎn)動平皿使其混合均勻。培育6.2.1 瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，361培育48h2h。水產(chǎn)品301培育72h3h.6.2.2 假設(shè)樣品

47、中能夠含有在瓊脂培育基外表彌漫生長的菌落時，可在凝固后的瓊脂外表覆蓋一薄層瓊脂培育基約4ml，凝固后翻轉(zhuǎn)平板，按6.2.1條件進(jìn)展培育。6.3 菌落計數(shù)可用肉眼察看，必要時用放大鏡或菌落計數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計數(shù)以菌落構(gòu)成單位colony-forming units,CFU表示。選取菌落數(shù)在30CPU300CPU之間、無蔓延菌落生長的平板計數(shù)菌落總數(shù)。低于30CFU的平板記錄詳細(xì)菌落數(shù)，大于300的可記錄為多不可計。每個稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個平板的平均數(shù)。其中一個平板有較大片狀菌落生長時，那么不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù);假設(shè)片狀菌落不到平板的

48、一半，而其他一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘以，代表一個平板菌落數(shù)。當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界限的鏈狀生長時，那么將每條單鏈作為一個菌落計數(shù)。結(jié)果的表述菌落總數(shù)的計算方法假設(shè)只需一個稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)，計算兩個平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每克或毫升中菌落總數(shù)結(jié)果。7.1.2 假設(shè)有兩個延續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)時，按式1計算： 式中： N樣品中菌落數(shù)； C平板(含適宜范圍菌落數(shù)的平板)菌落數(shù)之和； n1 第一個適宜稀釋度平板上的菌落數(shù)； n2第二個適宜稀釋度平板上的菌落數(shù)； d 稀釋因子第一稀釋度。例如： 稀釋度1；100第一稀

49、釋度1；100第二稀釋度菌落數(shù)232，24433，357.1.3假設(shè)一切稀釋度的平板菌落數(shù)均大于300，那么對一切稀釋度最高的平板進(jìn)展計數(shù)，其他平板可記錄為多不可計，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計數(shù)。7.1.4假設(shè)一切稀釋度的平板菌落數(shù)均假設(shè)有一切稀釋度的平板菌落數(shù)均少于30，那么應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計數(shù)7.1.5假設(shè)一切稀釋度包括液體樣品原液的平板均無菌落數(shù)生成，那么以少于1乘以最低稀釋倍數(shù)計數(shù)。7.1.6假設(shè)一切稀釋度的菌落數(shù)均不在30300之間，其中一部分小于30或大于300時，那么以最接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。7.2 菌落總數(shù)的報告7.2.1菌

50、落數(shù)在100以內(nèi)時，按“四舍五入原那么修約，采用兩位有效數(shù)字報告。7.2.2 大于或等于100時，第三位數(shù)字采用“四舍五入原那么修約后，取用兩位數(shù)字，后面用0替代位數(shù)；也可用10的指數(shù)方式表示，按四舍五入原那么修約后，采用兩位有效數(shù)字。7.2.3 假設(shè)一切平板上蔓延菌落而無法計數(shù)，那么報告菌落蔓延。7.2.4 假設(shè)空白對照有菌落生成，那么這次檢測結(jié)果無效。7.2.5 稱重取樣以CFU/g為單位報告，體積取樣以CFU/ml為單位報告。第二法菌落總數(shù)Petrifilm TM測試片法8 檢驗程序除將平板計數(shù)瓊脂培育基改成PetrifilmTM 菌落總數(shù)測試片外，其他與第5 章一樣。9 操作步驟9.1

51、 樣品的稀釋按照6.1.1-6.1.2 制備1:10 的樣品勻液后，用1 mol/L 氫氧化鈉NaOH 或1 mol/L 鹽酸( HCL 調(diào)理pH 至6.6-7.2 。9.2 接種根據(jù)對樣本污染情況的估計，選擇2 個3 個適宜稀釋度的樣品勻液進(jìn)展檢驗。將測試片置于平坦實驗臺外表，揭開上層膜，用吸管或微量移液器汲取1 mL 樣品勻液，垂直滴加在測試片的中央，將上層膜蓋下，允許上層膜直接落下，但不要滾動上層膜，將壓板凹面底朝下放置在上層膜中央，悄然地壓下，使樣液均勻覆蓋于圓形的培育膜上，切勿改動壓板。拿起壓板，靜置至少1 min 以使培育基凝固。每個稀釋度接種兩張測試片。9.3 培育將測試片的透明

52、面朝上，程度置于培育箱內(nèi)?？啥询B至20 片，培育溫度和時間同6.2 。9.4 計數(shù)9.4.1 培育終了后立刻計數(shù)，可肉眼察看計數(shù)，或用菌落計數(shù)器、放大鏡、PetrifilmTM 自動判讀儀計數(shù)。選取菌落數(shù)在30 -300 之間的測試片計數(shù)。9.4.2 計數(shù)一切紅色菌落。細(xì)菌濃度很高時，整個測試片會變成紅色或粉紅色，將結(jié)果記錄為“多不可計。9.4.3 有時，當(dāng)細(xì)菌濃度很高時，測試片中央沒有可見菌落，但圓形培育膜的邊緣有許多小的菌落，其結(jié)果也記錄為“多不可計；進(jìn)一步稀釋樣品可獲得準(zhǔn)確的讀數(shù)。9.4.4 某些微生物會液化凝膠，呵斥部分分散或菌落模糊的景象。假設(shè)液化景象干擾計數(shù)，可以計數(shù)未液化的面積來

53、估算菌落數(shù)。10 結(jié)果的表述同第7章附錄A(規(guī)范性附錄)培育基和試劑A 1 平板計數(shù)瓊脂(plate count agar，PcA)培育基A 1 1成分 胰蛋白胨 5.0 g 酵母浸膏 2.5 g 葡萄糖 1.0 g 瓊脂 15.0 g 蒸餾水 1 000 mL pH 7.0士0.2A 1 2制法 將上述成分加于蒸餾水巾A 2磷酸鹽緩沖液A 2 1成分 磷酸二氫鉀(KH2P04) 蒸餾水 PH 7.2A 2 2制法GBT 4789 228煮沸溶解，調(diào)理PH。分裝試管或錐形瓶，121高壓滅菌15 min34.0g500mL 儲存液：稱取34.0 g的磷酸_二氫鉀溶于500mL蒸餾水中，用大約1.

54、75 mL的1 mol1氫氧化鈉溶液調(diào)理pH至7.2，蒸餾水稀釋至1 000 mL后儲存于冰箱。 稀釋液：取儲存液l.25 mL，用蒸餾水稀釋至l 000 mL，分裝于適宜容器中，121高壓滅菌15 min。大腸桿菌計數(shù)1 范圍 本規(guī)范規(guī)定了食品中大腸菌群計數(shù)的方法。 本規(guī)范適用于各類食品中大腸菌群的計數(shù)。2 術(shù)語和定義 以下術(shù)語和定義適用于本規(guī)范。2.1 大腸菌群 coliforms 一群在36條件下培育48h能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌。該菌群主要來源于人畜糞便，作為糞便污染目的評價食品的衛(wèi)生情況，推斷食品中腸道致病菌污染的能夠。2.2最能夠數(shù) most pro

55、bable number；MPN基于泊松分布的一種間接計數(shù)方法。設(shè)備和資料除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培育設(shè)備外，其他設(shè)備和資料如下：3.1 恒溫培育箱：361。3.2 冰箱：25。3.3 恒溫水浴箱：461。3.4 天平：感量0.1g。3.5 均質(zhì)器。3.6 振蕩器。3.7 無菌吸管：1mL具0.01mL刻度、10mL具0.1mL刻度或微量移液器吸頭。3.8 無菌錐形瓶：容量500mL。3.9 無菌培育皿：直徑90mm。3.10 pH計或pH比色管或精細(xì)pH試紙。3.11 菌落計數(shù)器或Pertrifilm 自動判讀儀。培育基和試劑月桂基硫酸鹽胰蛋白棟lauryl sulfate tryptose

56、，LST肉湯：見第A.1章?；途G乳糖膽鹽brilliant green lactose bile，BGLB肉湯：見第A.2章。結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂violet red bile agar，VRBA：見第A.3章。磷酸鹽緩沖液：見第A.4章。 Pctrifilm tm是由3M公司提供的產(chǎn)品的商品名，給出這一個薪資是為了方便本規(guī)范的運用者，并不表示對該產(chǎn)品的認(rèn)可。假設(shè)其他等效產(chǎn)品具有一樣的效果，那么可運用這些等效的產(chǎn)品。GB/T4789.320214.5 無菌生理鹽水：稱取8.5g氯化鈉溶于100mL蒸餾水中，121高壓滅菌15min。4.6 1mol/L氫氧化鈉NaOH：稱取40g氫氧化鈉溶于1

57、000mL蒸餾水中。4.7 1mol/L鹽酸Hcl：移取農(nóng)鹽酸90mL,用蒸餾水稀釋至1000mL4.8 Petrifilm大腸菌群檢驗測試片和壓板。 第一法 大腸菌群MPN計數(shù)檢驗程序 檢樣25g或25mL樣品225mL稀釋液，均質(zhì) 大腸菌群MPN計數(shù)的檢驗程序見圖110倍系列稀釋選擇適宜三個延續(xù)稀釋度的樣品勻液，接種LST肉湯管 361 48h2h不產(chǎn)氣 產(chǎn)氣 BGLB肉湯 361 48h2h 產(chǎn)氣不產(chǎn)氣 大腸桿菌陽性大腸桿菌陰性 查MPN表報告結(jié)果 圖1 大腸菌群MPN計數(shù)檢驗程序操作步驟6.1 樣品的稀釋6.1.1 固體和半固體樣品：稱取25g樣品，放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理

58、鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000r/min10000r/min均質(zhì)1min2min，或放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min2min，制成1：10的樣品勻液。6.1.2 液體樣品：以無菌吸管汲取25mL樣品，置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶瓶內(nèi)與之適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠中，充分混勻，置盛1：10的樣品勻液。6.1.3 樣品勻液的pH值應(yīng)在6.57.5之間，必要時分別用1mol/L氫氧化鈉NaOH或1mol/L鹽酸Hcl調(diào)理。6.1.4 用1mL無菌吸管或微量移液器汲取1：10樣品勻液1mL，巖管壁漸漸注入9mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌

59、試管中留意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面，振搖試管或用1支1mL無菌吸管反復(fù)吹打，使其混合均勻，制成1：100的樣品勻液。6.1.5 根據(jù)對樣品污染的情況估計，按上述操作，依次制成10倍遞增系稀釋樣品勻液。美遞增稀釋1次，換用1支1mL無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種終了，全程不過15min。6.2 初發(fā)酵實驗 每個樣品，選擇3個適宜的延續(xù)稀釋度的樣品勻液液體樣品可以選擇原液，每個稀釋度接3管月桂基硫酸鹽胰蛋白LST肉湯，每管接種1mL如接種量超越1mL，那么用雙料LST肉湯，361培育24h2h。記錄在24h和48h內(nèi)產(chǎn)氣的LST肉湯管數(shù)。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性，產(chǎn)氣者那么進(jìn)展復(fù)發(fā)酵

60、實驗。復(fù)發(fā)酵實驗用接種環(huán)從一切48h2h內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培育物1環(huán)，移種與煌綠乳糖膽鹽BGLB肉湯管中，361培育48h2h，察看產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者，計為大腸菌群的MPN值。 第二法 大腸菌群平板計數(shù)7 檢驗程序 大腸菌群平板計數(shù)的檢驗程序見以下圖 2檢樣25g或25mL樣品225mL稀釋液，均質(zhì) 10倍系列稀釋選擇2個3個適宜稀釋度的樣品勻液，接種VRBA平板 361 48h2h 計數(shù)典型和可疑菌落BGLG肉湯或復(fù)發(fā)實驗 報告結(jié)果 361 48h2h圖 2 大腸菌群平板計數(shù)的檢驗程序GB/T4789.320218 操作步驟8.1 樣品的稀釋 按6.1進(jìn)展。8.2 平板計數(shù)8.2